Summary
In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice che consente la valutazione in vitro dell'abbondanza di microRNA marcati con fluorescenza per studiare le dinamiche dell'impacchettamento e dell'esportazione dei microRNA in vescicole extracellulari (EV).
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono importanti mediatori della comunicazione cellulare che vengono secreti da una varietà di cellule diverse. Queste vescicole extracellulari trasportano molecole bioattive, tra cui proteine, lipidi e acidi nucleici (DNA, mRNA, microRNA e altri RNA non codificanti), da una cellula all'altra, portando a conseguenze fenotipiche nelle cellule riceventi. Di tutti i vari carichi di EV, i microRNA (miRNA) hanno attirato una grande attenzione per il loro ruolo nel modellare il microambiente e nell'educare le cellule riceventi a causa della loro chiara disregolazione e abbondanza nelle EV. Ulteriori dati indicano che molti miRNA sono attivamente caricati nelle vescicole extracellulari. Nonostante questa chiara evidenza, la ricerca sulle dinamiche di esportazione e sui meccanismi di smistamento dei miRNA è limitata. Qui, forniamo un protocollo che utilizza l'analisi della citometria a flusso di EV-miRNA che può essere utilizzato per comprendere le dinamiche del carico di EV-miRNA e identificare i meccanismi coinvolti nell'esportazione di miRNA. In questo protocollo, i miRNA predeterminati per essere arricchiti in vescicole extracellulari e impoveriti dalle cellule donatrici vengono coniugati a un fluoroforo e trasfettati nelle cellule donatrici. I miRNA marcati con fluorescenza vengono quindi verificati per il caricamento nelle vescicole extracellulari e la deplezione dalle cellule utilizzando qRT-PCR. Sia come controllo della trasfezione che come strumento per il gating della popolazione di cellule trasfettate, è incluso un RNA cellulare marcato in modo fluorescente (trattenuto dalle cellule e impoverito di EV). Le cellule trasfettate sia con il miRNA EV che con il miRNA trattenuto dalle cellule vengono valutate per i segnali fluorescenti nel corso di 72 ore. L'intensità del segnale di fluorescenza specifica per i miRNA EV diminuisce rapidamente rispetto al miRNA trattenuto dalle cellule. Utilizzando questo semplice protocollo, è ora possibile valutare la dinamica del carico di miRNA e identificare vari fattori responsabili del caricamento dei miRNA nelle vescicole extracellulari.
Introduction
I microRNA (miRNA) sono uno dei sottoinsiemi meglio caratterizzati di piccoli RNA non codificanti, noti per il loro ruolo critico nella regolazione genica post-trascrizionale. L'espressione e la biogenesi della maggior parte dei miRNA seguono una serie coordinata di eventi che inizia con la trascrizione dei miRNA primari (pri-miRNA) nel nucleo. A seguito dell'elaborazione nucleare da parte del complesso microprocessore in miRNA precursori (pre-miRNA), i pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma, dove subiscono un'ulteriore elaborazione da parte dell'endonucleasi RNasi III, suddividendosi in duplex di miRNA maturi a 21-23 nucleotidi1. Uno dei filamenti del miRNA maturo processato si lega agli RNA messaggeri bersaglio (mRNA), portando alla degradazione o alla repressione traduzionale dei bersagli2. Sulla base del ruolo pleiotropico dei miRNA nella regolazione simultanea di più mRNA bersaglio diversi, non sorprende che l'espressione dei miRNA sia strettamente regolata3. In effetti, l'espressione inappropriata contribuisce a vari stati patologici, soprattutto nel cancro. L'espressione aberrante dei miRNA non solo rappresenta una firma specifica della malattia, ma è anche emersa come bersaglio per il potenziale prognostico e terapeutico 4,5,6. Oltre ai loro ruoli intracellulari, i miRNA hanno anche ruoli non autonomi. Ad esempio, i miRNA possono essere impacchettati selettivamente in vescicole extracellulari dalle cellule donatrici ed esportati nei siti riceventi dove suscitano diverse risposte fenotipiche nella fisiologia normale e della malattia 7,8,9.
Nonostante la chiara evidenza che i miRNA associati alle EV sono biomolecole funzionali, non è completamente chiaro come specifici sottoinsiemi di miRNA siano disregolati in stati patologici come il cancro e come il macchinario cellulare selezioni e selezioni i miRNA in Evs10,11. Dato il potenziale ruolo dei miRNA EV nella modulazione del microambiente, è fondamentale identificare i meccanismi coinvolti nell'esportazione di miRNA selezionati per chiarire completamente il ruolo degli EV nella comunicazione intercellulare e nella patogenesi della malattia. Comprendere il processo di rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari non solo evidenzierà importanti mediatori dell'esportazione di miRNA, ma può anche fornire informazioni su potenziali terapie. Per raggiungere questo livello di conoscenza, è necessario adattare gli strumenti per affrontare fedelmente queste nuove domande sperimentali. In effetti, gli studi che valutano le vescicole extracellulari stanno crescendo in modo esponenziale grazie all'introduzione di nuove tecniche e controlli12,13. In relazione alla valutazione dell'abbondanza di miRNA esportati nelle vescicole extracellulari, il sequenziamento di nuova generazione e la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) sono stati gli attuali strumenti standard. Sebbene questi strumenti siano utili per valutare l'abbondanza di miRNA nelle vescicole extracellulari, ci sono limitazioni alla loro sensibilità e specificità e l'utilizzo di questi approcci statici per valutare le dinamiche è insufficiente. Delineare le dinamiche dell'esportazione dei miRNA nelle vescicole extracellulari richiede una combinazione di strumenti specializzati. Qui, presentiamo un protocollo completo che utilizza miRNA coniugati in fluorescenza, per analizzare le dinamiche del rilascio di miRNA dalle cellule donatrici e l'incorporazione nelle vescicole extracellulari. Discutiamo anche i vantaggi e i limiti del metodo e forniamo raccomandazioni per un uso ottimale. Il metodo versatile presentato in questo articolo sarà utile ai ricercatori interessati a studiare il rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari e il loro potenziale ruolo nella comunicazione cellulare e nella malattia.
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Protocol
NOTA: Come prerequisito per l'utilizzo di questa tecnica, è richiesta l'identificazione e la convalida dei miRNA esportati selettivamente. Poiché le diverse linee cellulari variano in base al carico di miRNA smistato nelle loro vescicole extracellulari, si raccomanda di valutare la linea cellulare di interesse e le vescicole extracellulari associate per i miRNA prima dell'uso. Inoltre, la trasfezione a base di lipofectamina è uno dei passaggi critici del protocollo; Si raccomanda di predeterminare l'efficienza di trasfezione prima di impostare l'esperimento.
1. Cellule in crescita in coltura e trasfezione di cellule con EV-miRNA coniugato con fluorofori
- Piastra da 200.000 a 400.000 cellule in pozzetti triplicati in una piastra a 6 pozzetti in un terreno di coltura appropriato. Agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule fino a raggiungere il 70%-80% di confluenza, circa 24-48 ore.
- Per ogni pozzetto da trasfettare, diluire il reagente di trasfezione in 100 μL di terreno privo di siero in una provetta per microcentrifuga secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: La concentrazione ottimale di lipidi deve essere determinata per la linea cellulare di interesse prima di questa configurazione. - Per ciascun pozzetto da trasfettare, diluire separatamente l'EV-miRNA (2nM) e il miRNA cellulare (2nM) coniugati con fluoroforo in una provetta per microcentrifuga in 100 μL di terreno privo di siero.
NOTA: Il volume totale deve essere calcolato per il numero totale di pozzi trasfettati. In questo protocollo, la fluorescenza è stata valutata in 7 punti temporali; pertanto, il volume totale è stato di 700 μL per la fase 1.2 e di 700 μL per la fase 1.3. Inoltre, per catturare con sicurezza la popolazione fluorescente positiva di cellule, l'utente dovrebbe trasfettare le cellule con un miRNA strapazzato non fluorescente e impostare un gate che escluda queste cellule. - Aggiungere la miscela di RNA diluito (dal passaggio 1.3) al reagente di trasfezione diluito (dal passaggio 1.2) e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta 3-4 volte. Lasciare incubare la miscela combinata lipide-RNA per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere i normali terreni di coltura dalle cellule e aggiungere 800 μL di terreno privo di siero a ciascun pozzetto. Aggiungere delicatamente 200 μL della miscela lipide-RNA (dal passaggio 1.4) goccia a goccia alle cellule.
NOTA: Il terreno Opti-MEM è stato utilizzato per la trasfezione della linea cellulare di interesse (cellule Calu6). Provare ad aggiungere la miscela lipido-RNA direttamente al terreno di coltura, evitando di aggiungere la miscela ai lati della piastra.
2. Raccolta di cellule trasfettate in vari punti temporali per l'analisi della fluorescenza
- Incubare le cellule trasfettate a 37 °C per 7 ore.
NOTA: Per convalidare la trasfezione coerente di entrambi i miRNA (EV-miRNA e cellula-miRNA), le cellule vengono raccolte da un pozzetto 3 ore dopo la trasfezione per analizzare la fluorescenza utilizzando il citometro a flusso. - Dopo il periodo di incubazione di 7 ore, rimuovere il complesso di trasfezione dai pozzetti e sostituirlo con un terreno completo.
- Per valutare il time-point di 7 ore, raccogliere le cellule e lavarle tre volte con 1x PBS.
- Se si lavora con cellule aderenti, aggiungere 200 μL di tripsina a un pozzetto e attendere che le cellule si stacchino dalla piastra. Trasferire le cellule staccate in una provetta per microcentrifuga e pellet mediante centrifugazione a 200xg per 5 min.
- Scartare con cura il surnatante per evitare di interrompere il pellet cellulare. Per il primo lavaggio PBS, risospendere il pellet in ~500 μL di 1x PBS e ripetere la pellettatura utilizzando le fasi di centrifugazione sopra descritte. Ripetere il lavaggio PBS altre due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di soluzione di paraformaldeide (PFA) al 2% e valutare la fluorescenza.
NOTA: Dopo aver aggiunto il 2% di PFA, il pellet cellulare può essere conservato a 4 °C per 3-4 giorni.
- Raccogli i punti temporali rimanenti seguendo i passaggi nella sezione 2.3. Raccogliere tutti i pellet di celle immagazzinati e procedere con i passaggi nella sezione 3.
3. Analisi citometrica a flusso del segnale cellula-miRNA ed EV-miRNA nelle cellule
- Preparare le cellule per l'analisi della citometria a flusso. Filtrare la sospensione cellulare dalla sezione 2 ai tappi del filtro da 35 μm che fanno parte delle provette FACS in polistirene a fondo tondo per consentire la rimozione di detriti e aggregati cellulari che potrebbero interferire con l'analisi dei fluorofori.
- Impostare lo strumento seguendo le istruzioni di calibrazione. Accendere il citometro a flusso e lasciarlo riscaldare per almeno 30 minuti prima dell'uso. Adescare il sistema fluidico con fluido della guaina e controllare e regolare l'allineamento del laser.
- Eseguire il controllo di qualità per confermare la fluidica dello strumento. Caricare l'acqua filtrata ultrapura nel citometro a flusso e farla funzionare a una portata appropriata per un tempo di acquisizione adeguato.
NOTA: La portata e il tempo di acquisizione appropriati dipendono dal tipo di cella di interesse, dalla complessità del campione e dalla qualità dei dati desiderata. - Aprire il software di analisi dei dati di citometria a flusso e confermare le prestazioni del rivelatore e dei laser. Impostare i parametri di soglia e tensione per il rilevamento in base alla linea cellulare di interesse e ai fluorofori scelti.
NOTA: Per tutti gli esperimenti a valle, sono state utilizzate celle Calu6.- Impostare la soglia per l'acquisizione del segnale per le celle Calu6 a FSC 5000. Eseguire l'analisi per 1 x 104 celle per ogni ripetizione sperimentale.
- Per tenere conto della sovrapposizione spettrale tra diversi fluorofori, utilizzare cellule non trasfettate e cellule trasfettate in modo indipendente con uno solo dei fluorofori per impostare i controlli di compensazione.
- Per il rilevamento dell'esportazione di miRNA, utilizzare EV-miRNA candidati (miR-451a e miR-150) coniugati ad Alexa-fluor 488 e una cellula-miRNA di controllo (cel-miR-67) coniugata a Cy3.
- Per ogni EV-miRNA, coniugare il fluoroforo all'estremità 5′ del filamento 5p. Prima della trasfezione, ricuocere il filamento coniugato con fluorofori al suo filamento 3p complementare al 100%.
- Per l'analisi dell'espressione nelle cellule trasfettate, analizzare i campioni utilizzando i canali FSC, SSC, FITC e PE impostati rispettivamente su 258, 192, 269 e 423 unità di tensione (Figura 1A, B).
- Introdurre il campione di controllo negativo nel citometro a flusso. Acquisisci i segnali delle celle dopo aver definito le intensità di dispersione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) in un foglio di lavoro personalizzato.
- Nel grafico, scegliere FSC per l'asse X, SSC per l'asse Y e gate per la popolazione di interesse disegnando un poligono attorno ad esso (vedere la Figura 1B, pannello inferiore).
- Creare un nuovo appezzamento utilizzando la popolazione recintata.
- Impostare l'asse X sul segnale di fluorescenza 1 (FS1) per il rilevamento di miRNA cellulari e l'asse Y sul segnale di fluorescenza 2 (FS2) per il rilevamento di EV-miRNA. Impostare i parametri di compensazione per i singoli fluorofori utilizzando cellule trasfettate in modo indipendente con ciascuno dei miRNA marcati con fluorescenza. Nella nuova trama, cancello sulla popolazione di interesse.
- Per il rilevamento di EV-miRNA, utilizzare il canale FITC. Per la valutazione del segnale cellula-miRNA, utilizzare il canale PE. Nel software, creare un gate attorno alle celle che erano positive sia per FITC che per PE disegnando un poligono attorno alla popolazione a doppia fluorescenza quando FITC è stato selezionato per l'asse X e PE è stato selezionato per l'asse Y.
- Registrare le statistiche per la popolazione recintata.
- Registrare la percentuale di cellule nella popolazione gated che sono positive sia per FITC che per EP, nonché per quelle che sono positive per FITC o EP.
- Ripeti i passaggi precedenti per eventuali campioni o controlli aggiuntivi nell'esperimento.
4. Isolare le vescicole extracellulari dalle cellule trasfettate
- Per le cellule coltivate in terreni contenenti siero, esaurire le vescicole extracellulari dal siero per prevenire la contaminazione incrociata.
- Per generare un siero impoverito di EV, diluire il siero al 50% in terreni di coltura cellulare per ridurre la viscosità e centrifugare il siero risultante al 50% a 110.000 x g per 18 ore.
- Raccogliere con cura il surnatante (siero privo di EV) e filtrarlo utilizzando un gruppo filtro da 0,2 μm. Utilizzare il siero risultante senza EV al 50% per generare terreni completi, in questo caso RPMI più il 10% di siero.
- Per raccogliere le vescicole extracellulari, aggiungere il terreno completo impoverito di vescicole extracellulari alle cellule e raccogliere le vescicole extracellulari 48 ore dopo l'incubazione.
NOTA: Il protocollo descritto di seguito è stato modificato da Kowal et al.14.
- Coltiva le cellule in piastre di coltura tissutale da 15 cm all'80% di confluenza. Trasfettare le cellule separatamente con miRNA cellulare e miRNA EV in 10 mL di Opti-MEM seguendo il protocollo di trasfezione nella sezione 1 del protocollo.
NOTA: non tutti i protocolli di trasfezione scalano linearmente. Può essere essenziale adattare e valutare prima le condizioni di trasfezione in lastre da 15 cm. - Dopo 7 ore, aspirare il terreno di trasfezione e sostituirlo con il terreno impoverito di EV (15 mL). Far crescere le cellule nel terreno impoverito di EV per 48 ore.
- Rimuovere il terreno condizionato dalle cellule ed erogarlo in una provetta da centrifuga da 50 mL all'interno dell'armadio di biosicurezza. Centrifugare il terreno condizionato a 2000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere le cellule morte e i detriti cellulari. Trasferire il surnatante risultante in una provetta nuova.
- Centrifugare il surnatante a 10.000 x g per 40 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e filtrarlo utilizzando un gruppo filtro da 0,2 μm.
- Trasferire il terreno di coltura cellulare filtrato in una provetta sterile per ultracentrifuga all'interno dell'armadio di biosicurezza. Pesare e bilanciare le provette l'una contro l'altra. Centrifugare i campioni a 110.000 x g per 90 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in un volume appropriato di 1x PBS per lavare e centrifugare a 110.000 x g per 90 min 4 °C.
NOTA: Il pellet EV è stato risospeso in 60 mL di 1x PBS in base al volume massimo consentito per i tubi del rotore ad angolo fisso utilizzati in questo studio. - Aspirare il PBS e sospendere il pellet EV in un volume appropriato (50-100 μL) di PBS fresco 1x e vortex. Conservare i veicoli elettrici a -80 °C per un uso successivo.
5. Analisi citometrica a flusso del segnale cellula-miRNA ed EV-miRNA nelle vescicole extracellulari
- Per preparare la sospensione di EV per l'analisi della citometria a flusso, diluire le EV in un volume appropriato di PBS 1x ultrafiltrato.
NOTA: Il volume di carico per l'analisi citometrica a flusso delle vescicole extracellulari deve essere determinato in base al numero di vescicole extracellulari nei campioni. Approssimativamente, se ci sono ~30.000 particelle nella sospensione EV, il volume finale dovrebbe essere ~500-600 μL in 1x PBS. Un campione pulito contiene circa 35-50 particelle/μL. - Utilizzare il citometro a nanoflusso o un'apparecchiatura alternativa abbastanza potente da analizzare particelle di dimensioni nanometriche.
NOTA: In questo caso, è stato utilizzato il citometro a nanoflusso Attune NxT. - Aprire il software e configurare lo strumento seguendo le istruzioni di calibrazione consigliate. Eseguire il test delle prestazioni utilizzando nanosfere ad alte prestazioni. Se le nanosfere vengono rilevate nell'intervallo di dimensioni standard, le prestazioni sono ottimali. Determinare la portata appropriata per il rilevamento di particelle EV.
- Eseguire il controllo di qualità utilizzando acqua filtrata ultrapura per confermare la fluidica dello strumento e le prestazioni del rivelatore e dei laser.
- Utilizzando le microsfere di calibrazione adatte all'esperimento, impostare il citometro a flusso in modo da rilevare con precisione le microsfere di dimensioni diverse e misurare i segnali di fluorescenza.
NOTA: Per l'impostazione dell'analisi EV mediante citometria a flusso, sono state utilizzate le microsfere ApogeeMix. Queste perle contengono una miscela di perle di silice non fluorescente e perle di polistirene fluorescente di dimensioni comprese tra 80 nm e 1300 nm.- Impostare i parametri per valutare la sensibilità e la risoluzione di diverse popolazioni nella miscela di microsfere in base al protocollo del produttore. Utilizzare il gating appropriato per risolvere la popolazione di cordoni dal rumore dello strumento.
- Vorticare accuratamente i campioni per distribuire uniformemente le vescicole extracellulari prima di caricarle per l'analisi.
- Aprire il software di analisi dei dati di citometria a flusso e introdurre PBS ultra-filtrato. Impostare il gating per le particelle EV utilizzando PBS ultra-filtrato, assicurandosi che il gating corrisponda alla dimensione appropriata delle particelle in base alle perle nel passaggio 5.5.
- Caricare il campione di controllo negativo per analizzare le vescicole extracellulari mentre passano attraverso il citometro a flusso. Cattura i segnali EV tracciando FSC sull'asse X e SSC sull'asse Y.
NOTA: la soglia SSC per l'acquisizione di EV è stata impostata su 300. Il volume di acquisizione è stato fissato a 95 μL da un totale di 145 μL di volume prelevato. La portata è stata impostata a 12,5 μL/min. L'analisi è stata eseguita con 1 x 10particelle da 6 EV. La popolazione di vescicole extracellulari è eterogenea e si tradurrà in alcuni detriti isolati insieme alle vescicole extracellulari. Il rilevamento complessivo delle particelle nel grafico FSC vs. SSC evidenzia le particelle in un intervallo diversificato, come ci si aspetta quando si utilizzano preparati EV grezzi. - Creare un nuovo appezzamento utilizzando la popolazione recintata.
- Questa volta, scegli il segnale di fluorescenza 1 (FS1) per il rilevamento di miRNA cellulari sull'asse X e il segnale di fluorescenza 2 (FS2) per il rilevamento di EV-miRNA sull'asse Y.
- Impostare i parametri di compensazione per i fluorofori utilizzando i campioni EV isolati da cellule trasfettate con un singolo miRNA. Nella nuova trama, cancello sulla popolazione EV di interesse.
- Per l'analisi dell'espressione di miRNA coniugati con fluorofori in vescicole extracellulari isolate dalle cellule trasfettate, analizzare i campioni di vescicole extracellulari utilizzando i canali FSC, SSC, BL1 e YL1 impostati rispettivamente su unità di tensione 370, 370, 400 e 400 (Figura 2A, B).
- Registra le statistiche per la popolazione recintata e visualizzale utilizzando istogrammi e grafici a punti.
- Ripeti i passaggi precedenti per eventuali campioni o controlli aggiuntivi nell'esperimento.
6. Validazione del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari mediante qRT-PCR
- Estrarre l'RNA dalle vescicole extracellulari e dalle cellule madri utilizzando il kit di isolamento dell'RNA miRVana seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: La quantificazione dell'RNA isolato dalle vescicole extracellulari non è possibile perché la quantità totale di RNA isolato dalle vescicole extracellulari in genere non supera la soglia minima di quantità di una nano-goccia standard. Ciò è dovuto all'esaurimento dell'RNA ribosomiale dai campioni di EV, che può essere convalidato utilizzando il bioanalizzatore Agilent. Pertanto, il punteggio di integrità per la quantificazione dell'EV-RNA di solito non è affidabile e non è la vera rappresentazione della quantità di EV-RNA. Pertanto, per la quantificazione qRT-PCR dell'EV-RNA e dell'RNA cellulare, sono stati utilizzati volumi uguali di isolati di RNA dopo l'isolamento da un numero uguale di cellule. Per la normalizzazione della qRT-PCR, sono stati utilizzati miRNA ubiquitariamente presenti su più campioni, come determinato dai dati di sequenziamento dell'RNA acquisiti in precedenza. - Convertire l'RNA estratto in cDNA utilizzando un kit di trascrittasi inversa specifico per piccoli RNA.
- Impostare la reazione qRT-PCR utilizzando un modello di cDNA e primer specifici per miRNA seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Per gli esperimenti di validazione, sono stati utilizzati il kit miRCURY LNA qRT PCR e i corrispondenti primer del produttore per valutare l'espressione di miRNA cellulare e EV-miRNA.
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Representative Results
Qui, utilizziamo la citometria a flusso come un potente strumento per studiare il rilascio di miRNA dalle cellule alle vescicole extracellulari. Utilizzando questo protocollo, l'analisi della citometria a flusso di cellule trasfettate con miRNA cellulare ed EV-miRNA ha rivelato una diminuzione sequenziale del segnale di fluorescenza corrispondente all'EV-miRNA, mentre il segnale corrispondente al miRNA cellulare è stato mantenuto nelle cellule. Per garantire che la coniugazione del fluoroforo non interferisca con il rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari, il miR-451a è stato coniugato a due fluorofori separati (cioè Alexa fluor 488 e Alexa fluor 750) ed è stata valutata la ritenzione cellulare. I risultati indicano una variabilità minima tra la rilevazione dei segnali dei fluorofori separati dopo la trasfezione, convalidando l'affidabilità di questo approccio (Figura 3A,B).
Poiché varie ragioni potrebbero spiegare la perdita di miR-451a marcato fluorescente dalle cellule, inclusa la degradazione dell'RNA, è stato fondamentale verificare che la perdita cellulare coincidesse con l'abbondanza di EV. Utilizzando la citometria a flusso, l'accumulo di miR-451a coniugato ad Alexa fluor-488 nelle vescicole extracellulari è stato osservato in modo dipendente dal tempo, fornendo prove di un impacchettamento efficiente e dell'eventuale rilascio del miRNA nelle vescicole extracellulari. Al contrario, il segnale di fluorescenza corrispondente al miRNA trattenuto dalla cellula, cel-miR-67, non è stato rilevato nelle vescicole extracellulari (Figura 4). Questi risultati utilizzando questo nuovo approccio sono stati convalidati utilizzando la qRT-PCR, che ha rivelato un rapporto di espressione EV/cellula significativamente più elevato per miR-150, un miRNA EV aggiuntivo, rispetto al miRNA cellulare, cel-miR-67 (Figura 5).
Figura 1: Impostazione dei parametri del citometro a flusso per la rilevazione di segnali nelle cellule. (A) Per l'analisi della fluorescenza cellulare, utilizzando il software, sono state impostate le tensioni evidenziate per i parametri indicati. Lo strumento è stato impostato per registrare 10.000 cellule per campione. La vista Inspector conferma i parametri impostati per il rilevamento e l'analisi. (B) Per l'analisi della fluorescenza cellulare, la soglia per il parametro FSC è stata impostata a 5.000 nella scheda delle impostazioni del citometro del software. Il pannello in alto a destra mostra le impostazioni del laser per l'acquisizione dei dati. I pannelli inferiori mostrano un foglio di lavoro globale attivo durante l'avanzamento del rilevamento delle celle. I campioni sono stati analizzati a un flusso medio e catturati stabilendo FSC-A e SSC-A rispettivamente come parametri dell'asse x e dell'asse y. Il gating è stato impostato utilizzando uno strumento di disegno poligonale intorno alla popolazione di interesse. Il gating potrebbe essere diverso per un'altra linea cellulare di interesse a seconda della diversità della popolazione cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Impostazione dei parametri di citometria a flusso per il rilevamento del segnale nelle vescicole extracellulari. (A) Per il rilevamento e l'analisi a valle delle vescicole extracellulari, il volume di acquisizione è stato impostato a 95 μL con la velocità del flusso impostata a 12,5 μL/min. La soglia scelta per il rilevamento delle EV era 0,3 x1000 nella scheda delle impostazioni dello strumento del software in base alle perle di calibrazione utilizzate. Le tensioni per FSC, SSC, BL1 e YL1 erano rispettivamente 370, 370, 400 e 400. (B) Impostazione del gating per la cattura di popolazioni eterogenee di EV e la distinzione delle EV dal rumore di fondo dello strumento. Un campione PBS vuoto (in alto) è stato utilizzato come controllo negativo per risolvere il rumore di fondo della popolazione di veicoli elettrici. Il campione EV (in basso) mostra che la popolazione di interesse è solo l'1,8% della popolazione totale perché il campione è eterogeneo con particelle sovrapposte nell'intervallo dimensionale. Tuttavia, è stato scelto un gating rigoroso per garantire il rilevamento della popolazione di EV di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento del segnale nelle cellule attraverso la citometria a flusso. (A) La fluorescenza corrispondente a EV-miRNA e cellula-miRNA è stata rilevata nelle cellule in tempi indicati tra 7 e 72 ore dopo la trasfezione. Il segnale corrispondente a EV-miR-451a (Alexa fluor-488) è diminuito con il tempo rispetto al segnale del miRNA trattenuto dalla cellula, cel-miR-67. (B) La fluorescenza corrispondente a EV-miR-451a marcata con Alexa fluor-750 ha mostrato la stessa tendenza di Alexa Fluro-488 marcata miR-451a, indicando che il fluoroforo non influisce sulla ritenzione di miRNA da parte delle cellule. Nel complesso, i risultati rappresentativi indicano che il miRNA trasfettato si comporta in modo simile al miRNA endogeno in base all'esportazione del miRNA nelle vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rilevamento del segnale nelle vescicole extracellulari attraverso la citometria a flusso. La fluorescenza corrispondente a EV-miR-451a e cell-cel-miR-67 è stata rilevata nelle EV 24 ore e 48 ore dopo la trasfezione. Il segnale corrispondente a EV-miR-451a (Alexa fluor-488) è stato catturato in EV 48 ore dopo la trasfezione. Al contrario, il segnale per cel-miR-67 non è stato rilevato nelle vescicole extracellulari. Per impostare il gating per questo esperimento è stato utilizzato un campione PBS vuoto, come mostrato nella Figura 2B. I campioni di EV isolati da cellule trasfettate con RNA strapazzato non fluorescente sono stati utilizzati come controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione di EV-miRNA e cellula-miRNA in cellule e vescicole extracellulari mediante qRT-PCR. Le cellule Calu6 sono state trasfettate con 2 nM di miR-150 e cel-miR-67 ciascuna. Le vescicole extracellulari sono state raccolte 48 ore dopo la trasfezione. L'arricchimento di EV è stato calcolato come il rapporto tra l'espressione di EV diviso per l'espressione cellulare nelle cellule Calu6 trasfettate per miR-150 e cel-miR-67. Sulla base dei risultati del sequenziamento dell'RNA che confrontano l'espressione dei miRNA nelle cellule Calu6 e nelle loro corrispondenti vescicole extracellulari, il miR-30c è stato utilizzato come controllo endogeno e normalizzatore per il calcolo del fold change. I dati presentati provengono da una replica biologica, con ogni punto dati che presenta reazioni qRT-PCR triplicate. I dati sono espressi come media ± SD e i valori p sono stati calcolati utilizzando un test t spaiato con correzione di Welch (**p < 0,01). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Punti di forza | Debolezze |
| Consente la valutazione simultanea dell'esportazione selettiva di più miRNA nelle cellule e nelle rispettive vescicole extracellulari | Richiedere procedure aggiuntive per distinguere tra fenomeno di esportazione attivo e passivo |
| La valutazione di popolazioni eterogenee grezze è possibile e non richiede una separazione preliminare delle popolazioni EV. Può essere utilizzato per analizzare diversi tipi di veicoli elettrici NOTA: La soglia per il rilevamento di diversi tipi di particelle varia |
La bassa sensibilità non consente il rilevamento di concentrazioni limitate di miRNA nelle cellule o nelle vescicole extracellulari. Questo problema può essere superato incorporando l'analisi qRT-PCR a valle dopo l'isolamento dell'RNA dalle vescicole extracellulari |
| Richiede un breve lasso di tempo per la configurazione e l'analisi rispetto ai metodi standard utilizzati per la quantificazione dei miRNA | Mancanza di protocolli di standardizzazione per diversi tipi di apparecchiature, linee cellulari e vari fluorofori. |
Tabella 1: I principali punti di forza e di debolezza del protocollo.
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Discussion
Il protocollo di nuova istituzione consente di catturare la cinetica del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari dopo la trasfezione di miRNA extracellulari. L'approccio consente l'analisi simultanea di più miRNA EV e miRNA cellulari, in base alle capacità del citometro. Inoltre, sebbene l'analisi della citometria a flusso possa fornire preziose informazioni sulla biologia dei miRNA EV, non è priva di limitazioni. Tuttavia, alcune delle limitazioni possono essere superate se utilizzate in combinazione con altre tecniche per una comprensione più completa.
Un'area emergente di interesse nella biologia delle vescicole extracellulari è la comprensione dell'esportazione selettiva di miRNA nelle vescicole extracellulari15,16. Sebbene questo protocollo offra un potente strumento per consentire lo studio dell'esportazione selettiva di miRNA, una delle sfide critiche è distinguere tra esportazione attiva e passiva. È necessario prestare attenzione poiché la sovraespressione di un miRNA a una concentrazione sufficientemente elevata potrebbe alterare l'esportazione del miRNA, con conseguente potenziale carico passivo inappropriato. Pertanto, la sperimentazione per determinare le concentrazioni ottimali di trasfezione dei miRNA è fondamentale quando si studia l'esportazione selettiva.
Inoltre, il protocollo, se combinato con tecniche complementari come l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), consente al ricercatore di valutare il conteggio delle particelle EV valutando anche il rilascio di miRNA e ha il potenziale per consentire di distinguere tra alterazioni nelle vie di biogenesi delle EV e meccanismi di esportazione dei miRNA. Ciò è particolarmente importante a causa della sovrapposizione dei mediatori di questi processi17. Considerando che i miRNA possono avere un impatto su vari fenotipi, tra cui alcuni coinvolti nella biogenesi delle EV, sarebbe prudente valutare il conteggio delle particelle dopo la trasfezione dei miRNA18. Per superare questo ostacolo, un'altra opzione sarebbe quella di incorporare un miRNA EV che rimanga inalterato nelle condizioni sperimentali, escludendo così i fattori coinvolti nella biogenesi delle EV ed evidenziando i percorsi coinvolti nell'esportazione di EV-miRNA.
Diversi studi hanno quantificato i miRNA utilizzando la qRT-PCR, un metodo standard per la quantificazione endogena dei miRNA 10,11,16. Tuttavia, non ha la capacità di catturare dinamicamente il rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari. Quando si confronta la citometria a flusso con la qRT-PCR, si notano notevolmente in base alla sensibilità e al design del test. Sebbene la qRT-PCR sia una tecnica altamente sensibile e teoricamente in grado di quantificare un numero minimo di copie di miRNA, la distinzione di due campioni richiede una differenza di almeno 2 volte (100%) nel numero di copie dei miRNA di interesse. La citometria a flusso, d'altra parte, cattura le differenze basate sul segnale in base all'abbondanza di miRNA marcati con fluorescenza e può differenziare piccole variazioni percentuali nei segnali. Tuttavia, la sua bassa sensibilità limita il rilevamento di miRNA con un numero limitato di copie. Le due tecniche si completano sinergicamente a vicenda quando vengono utilizzate congiuntamente, come indicato nel protocollo.
In sintesi, questo protocollo offre uno strumento prezioso per studiare le dinamiche di esportazione selettiva dei miRNA. Nonostante le sfide di cui sopra, la forza di questo protocollo risiede nella sua capacità di analizzare più miRNA contemporaneamente, contribuendo a una migliore comprensione della biologia dei miRNA, della loro esportazione e del loro ruolo nella biologia delle EV. I principali punti di forza e di debolezza del protocollo che devono essere considerati sono elencati nella Tabella 1.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo il supporto e la consulenza della Dott.ssa Jill Hutchcroft, Direttore della Flow Cytometry Core Facility presso la Purdue University. Questo lavoro è stato sostenuto da R01CA226259 e R01CA205420 ad A.L.K., un premio per l'innovazione dell'American Lung Association (ANALA2023) IA-1059916 ad ALK, una sovvenzione della Purdue Shared Resource Facility P30CA023168 e una borsa di studio di dottorato Fulbright assegnata dal Dipartimento di Stato, USA a S.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
