Summary
Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.
Abstract
Multioomsequencing, die same-cell/paired single-cell RNA levert en de test voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-sequencing) gegevens, vertegenwoordigt een doorbraak in ons vermogen om tumorcelheterogeniteit te onderscheiden - een primaire focus van translationeel kankeronderzoek op dit moment. De kwaliteit van de sequentiegegevens die met behulp van deze geavanceerde modaliteit worden verkregen, is echter sterk afhankelijk van de kwaliteit van het invoermateriaal.
De verteringsomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd om de celopbrengst te maximaliseren zonder in te boeten aan kwaliteit. Dit is vooral een uitdaging in de context van solide tumoren met dichte desmoplastische matrices die voorzichtig moeten worden afgebroken voor celafgifte. Vers geïsoleerde cellen uit solide tumorweefsel zijn kwetsbaarder dan cellen die uit cellijnen zijn geïsoleerd. Aangezien de geïsoleerde celtypen heterogeen zijn, moeten bovendien omstandigheden worden gekozen om de totale celpopulatie te ondersteunen.
Ten slotte moeten de nucleaire isolatieomstandigheden worden geoptimaliseerd op basis van deze kwaliteiten in termen van lysistijden en soorten/verhoudingen van reagens. In dit artikel beschrijven we onze ervaring met nucleaire isolatie voor het 10x Genomics multioom sequencing platform uit solide tumorspecimens. We geven aanbevelingen voor weefselvertering, opslag van eencellige suspensies (indien gewenst) en nucleaire isolatie en beoordeling.
Introduction
Naarmate onze kennis van tumorbiologie groeit, is ook het belang van het analyseren van heterogene cellen in de micro-omgeving van de tumor toegenomen 1,2. De mogelijkheid om single-cell RNA en de test voor transposase-toegankelijk chromatine te verwerven met sequencing (ATAC-sequencing) gegevens van dezelfde cel op een gepaarde cel-manier (multioomsequencing) biedt een aanzienlijke vooruitgang in de richting van dit doel 3,4. Deze experimenten zijn echter duur en tijdrovend en de kwaliteit en impact van de verkregen gegevens zijn sterk afhankelijk van de kwaliteit van de experimentele omstandigheden en materialen. Gestandaardiseerde protocollen voor het isoleren van kernen zijn gepubliceerd 5,6. Verse en heterogene weefsels vereisen protocoloptimalisatie, aangezien vers geïsoleerde cellen uit solide tumormonsters kwetsbaarder zijn dan cellen die uit cellijnen zijn geïsoleerd.
Een andere overweging is dat voor solide tumoren chirurgische monsters vaak pas laat op de dag beschikbaar zijn in de operatiekamer. Als zodanig is het over het algemeen niet haalbaar om rechtstreeks van monsterverwerving naar kernvangst te gaan zonder een cryopreservatiestap. Onze ervaring is dat het invriezen van een eencellige suspensie kernen van de hoogste kwaliteit oplevert (in plaats van snel ingevroren heel weefsel of andere vormen van bewaring). Dit geldt met name voor enzymatische weefseltypen met een hoog RNase-gehalte, zoals de alvleesklier.
Weefselverteringsomstandigheden moeten ook worden ontworpen om de celopbrengst te maximaliseren zonder in te boeten aan kwaliteit7. In de context van solide tumortypes met dichte desmoplastische matrices8, moet de extracellulaire matrix voorzichtig worden afgebroken voor celafgifte. Bovendien, omdat de geïsoleerde celtypen heterogeen zijn, moeten de omstandigheden worden aangepast om de totale celpopulatie te ondersteunen. Monsters van menselijke alvleesklierkanker (ductaal adenocarcinoom van de pancreas) worden gebruikt in het beschreven protocol. Alvleesklierkanker vertegenwoordigt een zeer desmoplastisch tumortype, dat relatief kleverig weefsel en cellen voorspelt. Bovendien, aangezien pancreastumorspecimens die beschikbaar zijn voor onderzoek ook relatief klein zijn, worden inspanningen geleverd om de hoeveelheid gevangen cellen te maximaliseren.
Isolatie van kernen vereist de meeste optimalisatie in termen van cellyseomstandigheden en timing, evenals reagenstypen en -verhoudingen. Ook het hanteren van de kernen tijdens de isolatie vereist grote zorgvuldigheid. In dit artikel beschrijven we onze ervaring met het optimaliseren van nucleaire isolatie voor het 10x Genomics multioom-sequencingplatform uit solide tumorweefsel (Figuur 1). We geven aanbevelingen voor weefselvertering, cryopreservatie van eencellige suspensies (indien gewenst) en nucleaire isolatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Monsters van menselijke alvleesklierkanker (ductaal adenocarcinoom van de pancreas) werden in ons laboratorium verkregen volgens een door de IRB goedgekeurd protocol. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten voor weefselafname. Weefsel werd van de operatiekamer naar het laboratorium getransporteerd en vervolgens als volgt verwerkt.
1. Weefseldissociatie (spijsvertering)
- Bereid de digestbuffer voor (zie tabel met materialen).
- Verkrijg het weefsel van belang zo snel mogelijk na excisie van de tumor en transporteer het monster in quenchbuffer (DMEM F-12 met ~5% foetaal runderserum) of 1x PBS op ijs.
- Hak het weefsel fijn met een schone pincet en schaar in 3-5 ml Digest Buffer in een petrischaal van 90 mm (Figuur 2A).
- Breng het gehakte weefsel over in een conische buis van 50 ml en dissocieer in ~10 ml Digest Buffer gedurende 30 minuten bij 37 °C met behulp van een waterbad met schudfunctie of een droog roerwerk.
- Haal uit het roerwerk en blus af met ~20 ml blusmiddel. Filtreer de oplossing door een celzeef van 100 μm in een schone conische buis.
- Verzamel eventueel achtergebleven vast weefsel uit de zeef (hak indien nodig de resterende stukjes weefsel opnieuw) en plaats het in ~10 ml verse Digest Buffer gedurende nog eens 30 minuten bij 37 °C met roeren. Herhaal dit totdat al het tumorweefsel is gedissocieerd.
- Poolcelsuspensie aliquots en filtreert door een celzeef van 70 μm, gevolgd door een celzeef van 40 μm in een schone conische buis op ijs.
- Centrifugeer in pelletcellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer vervolgens het supernatant.
2. Cryopreservatie
- Spoel de cellen door de pellet te resuspenderen in 1 ml 1x PBS.
- Breng de celsuspensie (~1-10 miljoen cellen/buis voor optimale bevriezing) over in een cryovial van 1,5 ml op ijs.
- Centrifugeer tot pelletcellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer vervolgens het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml Bambanker-oplossing, breng ze over naar een cryovial van 1,5 of 2 ml (figuur 2B) en vries ze in met behulp van een vriescontainer met een koelsnelheid van -1 °C/min (met 100% isopropylalcohol) bij -80 °C, of breng ze over op vloeibare stikstof als langdurige opslag van het monster wordt verwacht.
3. Isolatie van kernen
- Ontdooi de cryovial van de celsuspensie snel en plaats deze op nat ijs.
- Breng de ontdooide celsuspensie over in een microcentrifugebuisje van 2 ml en vul de injectieflacon bij met 2 ml oplossing met 1x PBS om de cellen te spoelen.
- Verkrijg een handmatige celtelling met behulp van een hemocytometer om zowel de kwantiteit als de kwaliteit van de cellen te beoordelen (Figuur 2C).
- Centrifugeer in pelletcellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en decanteer het supernatans vervolgens voorzichtig met behulp van steeds kleinere pipetpunten om een droge pellet achter te laten en deze op ijs te houden.
- Gebruik een zwenkbakrotor voor alle centrifugeerstappen. Voor een maximale celopbrengst plaatst u de buisjes in de centrifuge met het scharnier naar buiten gericht en decanteert u vervolgens met de pipetpunt naar de andere kant van het buisje gericht (Figuur 2D).
OPMERKING: Gebruik voor het decanteren van het supernatant steeds kleinere pipetpunten om vloeistof te verwijderen om verstoring van de pellet te beperken en tegelijkertijd het volume van de gedecanteerde vloeistof te maximaliseren. Deze strategie is vooral nuttig later in het protocol na de extractie van de kernen, omdat de kernpellet over het algemeen niet zichtbaar is.
- Gebruik een zwenkbakrotor voor alle centrifugeerstappen. Voor een maximale celopbrengst plaatst u de buisjes in de centrifuge met het scharnier naar buiten gericht en decanteert u vervolgens met de pipetpunt naar de andere kant van het buisje gericht (Figuur 2D).
- Bereid 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer en Wash Buffer (Figuur 3A) voor volgens het gepubliceerde protocol met de volgende wijzigingen (zie Tabel 1, Tabel met materialen):
NOTITIE: Plaats de Digitonin voor gebruik op een verwarmingsblok bij 65 °C om het neerslag op te lossen (Figuur 3B). Dit duurt meestal ongeveer 10 minuten. - Bereid de 0,1x cellysebuffer voor door 100 μl 1x cellysebuffer en 900 μl cellyseverdunningsbuffer te combineren, pipetteer voorzichtig om te mengen en leg het op ijs.
- Resuspendeer de celpellet in 100 μL gekoelde 0,1x Cell Lysis Buffer en pipetteer voorzichtig om 5x te mengen.
- Incubeer gedurende 3 minuten op ijs (Figuur 3C).
- Voeg 1 ml gekoelde wasbuffer toe en pipetteer op en neer om 5x voorzichtig te mengen.
- Centrifugeer om de kernen te pelleteren bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, decanteer het supernatans voorzichtig tot een droge pellet en bewaar op ijs.
OPMERKING: Als het aantal startcellen laag is (100.000-200.000 cellen), voer dan de cellyse- en wasstappen uit in een PCR-buis van 200 μL in plaats van een microcentrifugebuis van 2 ml om het oppervlak van de buis te verkleinen en verliezen te minimaliseren. Pas in dit geval het volume van de wasbuffer aan om plaats te bieden aan het kleinere slangvolume. - Herhaal stap 3.9-3.10 2x voor een totaal van drie wasbeurten.
- Tel de kernen handmatig met behulp van een hemocytometerglaasje onder de microscoop. Gebruik desgewenst trypanblauwe kleurstof om contrast te bieden voor het bekijken van de kernen en om kernen te onderscheiden van niet-gelyseerde cellen.
- Bereid de 1x Nuclei Buffer voor volgens het gepubliceerde protocol: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNaseremmer in nucleasevrij water en bewaar op ijs (zie Materiaaltabel).
- Resuspendeer de kernpellet in 1x Nuclei Buffer op basis van doelgericht kernherstel.
OPMERKING: Als de concentratie hoog genoeg is, streef dan naar een gerichte terugwinning van 10.000 of iets hoger in deze stap (3.230-8.060 kernen/μl) bij het bepalen van het startresuspensievolume, gezien het verwachte volumeverlies van 25 μl en de afname van de concentratie met 20% bij filtering (stap 3.15). - Haal het geresuspendeerde kernvolume voorzichtig door een 40 μm pipetpuntcelzeef en plaats de kernen op ijs (figuur 3D).
- Tel de kernen (Figuur 4A-C). Verdun de uiteindelijke oplossing indien nodig verder met Nuclei Buffer.
- Transporteer de kernen op ijs en ga onmiddellijk verder met het vastleggen van kernen volgens gepubliceerde protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit solide tumormonsters van patiënten voor multioomsequencing (Figuur 1), werd het tumorweefsel gedissocieerd en werd een eencellige suspensie gecryopreserveerd (Figuur 2A-D). De celsuspensie werd vervolgens ontdooid op het moment van de geplande multioomvangst. Het afvangen van kernen werd uitgevoerd met geoptimaliseerde lysisbufferreagentia en timing om zowel de kwaliteit als de opbrengst te maximaliseren (Figuur 3A-D). Representatieve afbeeldingen van de kernen tonen de juiste grootte en vorm (figuur 4A-C). De lichtgrijs omcirkelde kernen vertonen een lichte stippeling van het omhulsel.
Figuur 1: Schema van de workflow voor het isoleren van kernen. Schema met de basisworkflow van een volledig tumorweefselmonster tot een single-nucleus suspensie die klaar is voor indiening voor het vangen van kernen, de voorbereiding van de multioombibliotheek en uiteindelijk scRNA- en ATAC-sequencing. Afkortingen: scRNA = single-cell RNA; ATAC-seq = test voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weefselvertering, cryopreservatie, celbeoordeling en centrifugatiestappen. (A) Opstelling van apparatuur voor het fijnhakken van tumorweefselmonsters; (B) cryopreservatie van celsuspensie; c) microscopische evaluatie van de celsuspensie; D) benadering van centrifugeren voor dit protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bereiding van reagentia, extractie van kernen en filtreer. (A) Bereiding van reagentia voor de extractie van kernen; B) het oplossen van digitonine bij 65 °C vóór gebruik; c) incubatie van monsters voor cellyse op ijs; (D) filtreren van geëxtraheerde kernen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve microscopische beelden van kernen geoogst uit complexe tumorweefselmonsters. (A-C) Representatieve beelden van kernen geoogst met en zonder Trypan Blue-kleuring. (B,C) De lichtgrijs omcirkelde kernen vertonen een lichte stippeling van de nucleaire envelop. 10x en 40x gebruikte objectieven. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van de oplossing | Onderdelen | ||
| Buffer verteren | 0,5-1 mg/ml collagenase type IV | ||
| 100 E/ml DNase I | |||
| 0,1% Poloxameer 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% foetaal runderserum (FBS) in Medium 199 | |||
| 1X Cel Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA (i.p.v. 1%) | |||
| 0.10% Tween-20 | |||
| 0,1% niet-ident P40-vervanger | |||
| 0,01% Digitonine | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-remmer in nucleasevrij water | |||
| Cellyse verdunningsbuffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-remmer in nucleasevrij water | |||
| Buffer wassen | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0.10% Tween-20 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-remmer in nucleasevrij water | |||
Tabel 1: Oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwarren van de heterogene celpopulaties die aanwezig zijn in de micro-omgeving van de tumor is een actief aandachtsgebied in de kankerbiologie. Evenzo bestaan complexe weefsels in goedaardige pathologieën zoals wondgenezing en fibrose. Multioomsequencing is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel dat het mogelijk maakt om gepaarde scRNA- en ATAC-seq-gegevens van dezelfde cel te verkrijgen. Dit protocol beschrijft de isolatie van kernen, wat optimalisatie vereist bij het verwerken van verse, kwetsbare, kleine tumormonsters. Hier bieden we een protocol voor kernisolatie uit desmoplastische solide tumorweefselmonsters. We hebben gemerkt dat deze aanpak betrouwbare en hoogwaardige gegevens oplevert, zelfs wanneer celsuspensies worden ingevroren voordat de kernen worden geïsoleerd en gevangen.
Het verhogen van de albumineconcentratie tijdens de test is nuttig bij het beperken van het samenklonteren van cel- en stroomafwaartse kernen, wat een probleem kan zijn bij het werken met tumormonsters. Op het gebied van weefselvertering kunnen desgewenst ook reagentia voor de spijsverteringskit met dit protocol worden gebruikt (zie Materiaaltabel). Indien gebruikt, raden we nog steeds aan om de 30 minuten durende digest/quench- en bufferuitwisselingen te volgen om de opbrengst van levensvatbare cellen te maximaliseren. Na weefseldissociatie kan lysis van rode bloedcellen worden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Een gradiëntcelscheidingsprotocol kan ook worden uitgevoerd naar goeddunken van de onderzoeker (zie Tabel met materialen). We voeren deze protocollen niet routinematig uit, maar we hebben dergelijke protocollen toegepast op vergelijkbare monsters zonder noemenswaardige verschillen in resultaten. Als er na het filteren van kernen significante, kleine deeltjes worden opgemerkt, kan Fluorescence-Activated Nuclei Sorting (FANS) worden overwogen voor verdere zuivering. Een gedetailleerde bespreking van FANS, inclusief protocolaanbevelingen, is beschikbaar, maar valt buiten het bestek van dit protocol. Merk op dat er protocollen in de literatuur zijn die een fixatiestap voorafgaand aan cellyse overwegen. We geven er echter de voorkeur aan om verder te gaan met niet-gefixeerd weefsel en kernen, omdat scATAC-seq het beste werkt op niet-gefixeerd weefsel9.
Voor cellyse, aangezien de RNase-remmer vrij duur is, is het redelijk om het voorbereide volume van de cellysebuffer (en de cellyseverdunningsbuffer) te verkleinen in vergelijking met de volumes in het gepubliceerde protocol, indien gewenst, zolang de verhoudingen van reagentia proportioneel blijven. Bij het beoordelen en tellen van de geoogste kernen kan naar goeddunken van de onderzoeker een LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit worden toegepast. Trypanblauwe kleurstof kan ook worden gebruikt om contrast te bieden voor het bekijken van de kernen en om indien nodig kernen te onderscheiden van niet-gelyseerde cellen. Ten slotte is het vermeldenswaard dat we dezelfde cellysecondities hebben toegepast met aangepaste reagentia per protocol voor single-cell ATAC-seq met uitstekende resultaten10.
Cruciale stappen in het protocol zijn een nauwkeurige timing van lysis en een zachte maar doelmatige behandeling van de kernen. Te weinig mengen leidt tot onvolledige of inconsistente cellyse; Overmenging zal het chromatine echter afschuiven. Zoals opgemerkt in andere protocollen voor het isoleren van kernen, moet het mengen van kernen worden bereikt door pipetteren in plaats van vortexen van het monster, omdat de schuifkrachten de fragiele kernen kunnen beschadigen11. In dit verband is het belangrijk dat de Cell Lysis Buffer bij elke gelegenheid vlak voor gebruik vers wordt bereid. Het persen (filteren) van de pipetpuntcellen na de laatste centrifugatiestap is in onze ervaring van cruciaal belang om te voorkomen dat kernen samenklonteren voordat ze worden gevangen. Deze filtering kan vóór het laden worden herhaald als er bij de eindtelling nog klonten worden gedetecteerd of als er zich tijdens het transport van het monster voorafgaand aan het laden klonten ontstaan, rekening houdend met het extra volume- en concentratieverlies bij elke toegevoegde filterstap. Merk op dat er geen significante tijdspauze mag zijn tussen het isoleren van kernen en het vangen.
Beperkingen van dit protocol zijn dat weefseldissociatie en in het bijzonder de incubatietijd en -omstandigheden van de cellyse mogelijk moeten worden geoptimaliseerd voorverschillende soorten solide tumoren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor desmoplastische solide tumoren zoals borstcarcinoom en pancreasadenocarcinoom en is ook met succes toegepast op niet-tumor desmoplastische weefsels zoals parenchymale fibrose, maar andere tumortypes kunnen aanvullende aanpassingen vereisen. Het is geoptimaliseerd voor zowel verse celsuspensies als bevroren celsuspensies met een uitstekende kernopbrengst van beide. We raden aan om een dergelijke optimalisatie achtereenvolgens na te streven, te beginnen met weefseldissociatie, en zodra een optimale eencellige suspensie is bereikt, over te gaan tot de optimalisatie van de cellyseomstandigheden om een optimale enkelvoudige suspensie te verkrijgen.
Single-cell ATAC-sequencing en meer recentelijk multioomsequencing vormen een enorm baanbrekend hulpmiddel voor het ontrafelen van de cellulaire heterogeniteit van solide tumoren. Celsubtypes kunnen worden afgebakend op basis van zowel hun chromatinetoegankelijkheid als genexpressiekenmerken, en de invloed van de toegankelijkheid en expressie van transcriptiefactoren op tumorgedrag kan direct worden onderzocht. Deze methodologische vooruitgang wordt breed toegepast gezien hun enorme potentieel om nieuwe therapeutische doelen te ontdekken. Daarom is de ontwikkeling van geoptimaliseerde protocollen om deze gegevens te verkrijgen van het grootste belang. Hier delen we dit protocol voor het isoleren van kernen in de context van alvleesklierkankerweefsel - een kankertype waarvoor weinig therapieën bestaan en die tot op heden allemaal een beperkte werkzaamheid hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We willen graag de Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), in het bijzonder Dhananjay Wagh en John Coller, en 10x Genomics bedanken voor hun hulp bij het optimaliseren van onze experimenten. We willen ook Drs. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser en Byrne Lee bedanken voor hun hulp bij het verwerven van patiëntenspecimens. We willen Art en Elaine Taylor, de Rantz Foundation en Warren en Judy Kaplan bedanken voor hun genereuze steun aan onze onderzoeksinspanningen. Financieringsbronnen zijn onder meer NIH-subsidies 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (MTL), 1R01GM136659 (MTL), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), de Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), het Gunn/Olivier Fund, het California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation en het Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sequencing werd verkregen met behulp van machines die waren gekocht met NIH-fondsen (S10OD025212, S10OD018220 en 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
- Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
- Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542 (2020).
