Summary
Protokollet ger ett tillförlitligt och optimerat tillvägagångssätt för isolering av kärnor från solida tumörprover för multiomsekvensering med hjälp av 10x Genomics-plattformen, inklusive rekommendationer för vävnadsdissociationsförhållanden, kryokonservering av encellssuspensioner och bedömning av isolerade kärnor.
Abstract
Multiome-sekvensering, som ger samcelligt/parat encells-RNA- och analysen för transposastillgängligt kromatin med sekvenseringsdata (ATAC-sekvensering), representerar ett genombrott i vår förmåga att urskilja tumörcellsheterogenitet - ett primärt fokus för translationell cancerforskning vid denna tidpunkt. Kvaliteten på sekvenseringsdata som erhållits med hjälp av denna avancerade modalitet är dock i hög grad beroende av kvaliteten på det inmatade materialet.
Matsmältningsförhållandena måste optimeras för att maximera cellutbytet utan att ge avkall på kvaliteten. Detta är särskilt utmanande i samband med solida tumörer med täta desmoplastiska matriser som måste brytas ner försiktigt för cellfrisättning. Nyisolerade celler från solid tumörvävnad är mer ömtåliga än de som isolerats från cellinjer. Dessutom, eftersom de isolerade celltyperna är heterogena, bör betingelser väljas för att stödja den totala cellpopulationen.
Slutligen måste kärnisoleringsförhållandena optimeras baserat på dessa egenskaper i termer av lystider och reagenstyper/förhållanden. I den här artikeln beskriver vi vår erfarenhet av nukleär isolering för 10x Genomics multiome-sekvenseringsplattform från solida tumörprover. Vi ger rekommendationer för vävnadsnedbrytning, förvaring av encellssuspensioner (om så önskas) och nukleär isolering och bedömning.
Introduction
I takt med att vår kunskap om tumörbiologi växer har också betydelsen av att analysera heterogena celler i tumörens mikromiljö ökat 1,2. Förmågan att förvärva encells-RNA och analysen för transposastillgängligt kromatin med sekvenseringsdata (ATAC-sekvensering) från samma cell på ett parat cellsätt (multiomsekvensering) ger ett betydande framsteg mot detta mål 3,4. Dessa experiment är dock dyra och tidskrävande, och kvaliteten och effekten av de data som samlas in är i hög grad beroende av kvaliteten på de experimentella förhållandena och materialen. Standardiserade protokoll för isolering av kärnor har publicerats 5,6. Färska och heterogena vävnader kräver protokolloptimering eftersom nyligen isolerade celler från solida tumörprover är mer ömtåliga än de som isolerats från cellinjer.
En annan faktor är att för solida tumörer är kirurgiska prover ofta inte tillgängliga från operationssalen förrän sent på dagen. Som sådan är det i allmänhet inte möjligt att gå direkt från provtagning till kärnavskiljning utan ett kryokonserveringssteg. Enligt vår erfarenhet ger frysning av en encellssuspension kärnor av högsta kvalitet (snarare än snabbfryst hel vävnad eller andra konserveringsmetoder). Detta gäller särskilt för enzymatiska vävnadstyper med högt RNasinnehåll såsom bukspottkörteln.
Matsmältningsförhållanden för vävnad måste också utformas för att maximera cellutbytet utan att ge avkall på kvaliteten7. I samband med solida tumörtyper med täta desmoplastiska matriser8 måste den extracellulära matrisen försiktigt brytas ner för cellfrisättning. Dessutom, eftersom de isolerade celltyperna är heterogena, bör förhållandena justeras för att stödja den totala cellpopulationen. Prover från human bukspottkörtelcancer (pankreasduktalt adenokarcinom) används i det beskrivna protokollet. Bukspottkörtelcancer är en mycket desmoplastisk tumörtyp som förebådar relativt klibbig vävnad och celler. Dessutom, eftersom tumörprover från bukspottkörteln som är tillgängliga för forskning också tenderar att vara relativt små, görs ansträngningar för att maximera mängden celler som fångas.
Isolering av kärnor kräver mest optimering när det gäller celllysförhållanden och tidpunkt, såväl som reagenstyper och förhållanden. Att hantera kärnorna under isoleringen kräver också stor försiktighet. I den här artikeln beskriver vi vår erfarenhet av att optimera nukleär isolering för 10x Genomics multiome-sekvenseringsplattform från solid tumörvävnad (figur 1). Vi ger rekommendationer för vävnadsnedbrytning, kryokonservering av encellssuspensioner (om så önskas) och nukleär isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prover från human bukspottkörtelcancer (bukspottkörtelcancer (bukspottkörtelduktalt adenokarcinom) togs enligt ett IRB-godkänt protokoll i vårt laboratorium. Informerat samtycke inhämtades från patienter för vävnadsinsamling. Vävnad transporterades från operationssalen till laboratoriet och behandlades sedan på följande sätt.
1. Vävnadsdissociation (matsmältning)
- Förbered sammanfattad buffert (se materialförteckning).
- Skaffa vävnaden av intresse så snart som möjligt efter tumörexcision och transportera provet i släckningsbuffert (DMEM F-12 med ~5 % fetalt bovint serum) eller 1x PBS på is.
- Finhacka vävnaden med en ren pincett och sax i 3-5 ml digestbuffert i en 90 mm petriskål (Figur 2A).
- Överför den malda vävnaden till ett 50 ml koniskt rör och dissociera i ~10 ml digestbuffert i 30 minuter vid 37 °C med hjälp av ett vattenbad med skakningsfunktion eller en torr omrörare.
- Ta bort från omröraren och släck med ~20 ml härdningsmedium. Filtrera lösningen genom en 100 μm cellsil till ett rent koniskt rör.
- Samla upp eventuell kvarvarande fast vävnad från silen (hacka bort återstående vävnadsbitar om det behövs) och placera i ~10 ml färsk Digest Buffer i ytterligare 30 minuter vid 37 °C med omrörning. Upprepa tills all tumörvävnad har dissocierats.
- Poola cellsuspensionsalikvoter och filtrera genom en 70 μm följt av en 40 μm cellsil till ett rent koniskt rör på is.
- Centrifugera till pelletsceller vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C och dekantera sedan supernatanten.
2. Kryokonservering
- Skölj cellerna genom att suspendera pelleten i 1 ml 1x PBS.
- Överför cellsuspensionen (~1-10 miljoner celler/rör för optimal frysning) till en 1,5 ml kryovial på is.
- Centrifugera till pelletsceller vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C och dekantera sedan supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml Bambanker-lösning, överför till en 1,5 eller 2 ml kryovial (figur 2B) och frys med en frysbehållare med -1 °C/min kylhastighet (innehållande 100 % isopropylalkohol) vid -80 °C, eller överför till flytande kväve om långtidsförvaring av provet förväntas.
3. Isolering av kärnor
- Tina snabbt kryovialen av cellsuspensionen och placera den på våt is.
- Överför den tinade cellsuspensionen till ett 2 ml mikrocentrifugrör och fyll på injektionsflaskan till 2 ml lösning med 1 x PBS för att skölja cellerna.
- Få en manuell cellräkning med hjälp av en hemocytometer för att bedöma både cellernas kvantitet och kvalitet (Figur 2C).
- Centrifugera till pelletsceller vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C och dekantera sedan försiktigt supernatanten med gradvis mindre pipettspetsar för att lämna kvar en torr pellet och hålla den på is.
- Använd en svängskopa för alla centrifugeringssteg. För maximalt cellutbyte, placera rören i centrifugen med gångjärnet vänt utåt och dekantera sedan med pipettspetsen riktad mot rörets motsatta sida (Figur 2D).
OBS: För dekantering av supernatanten, använd progressivt mindre pipettspetsar för att avlägsna vätska för att begränsa störningar av pelleten samtidigt som volymen vätska dekanteras maximeras. Denna strategi är särskilt användbar senare i protokollet efter kärnextraktion eftersom kärnpelleten i allmänhet inte är synlig.
- Använd en svängskopa för alla centrifugeringssteg. För maximalt cellutbyte, placera rören i centrifugen med gångjärnet vänt utåt och dekantera sedan med pipettspetsen riktad mot rörets motsatta sida (Figur 2D).
- Förbered 1x celllysbuffert, celllysutspädningsbuffert och tvättbuffert (figur 3A) enligt det publicerade protokollet med följande ändringar (se tabell 1, materialförteckning):
OBS: Placera Digitonin på ett värmeblock vid 65 °C före användning för att lösa upp fällningen (Figur 3B). Detta tar vanligtvis cirka 10 minuter. - Förbered 0.1x Cell Lysis Buffer genom att kombinera 100 μL 1x Cell Lysis Buffer och 900 μL Cell Lysis Dilution Buffer, pipettera försiktigt för att blanda och placera den på is.
- Återsuspendera cellpelleten i 100 μL kyld 0,1x celllysbuffert och pipettera försiktigt för att blanda 5x.
- Inkubera på is i 3 minuter (Figur 3C).
- Tillsätt 1 ml kyld tvättbuffert och pipettera upp och ner för att försiktigt blanda 5 gånger.
- Centrifugera för att pelletera kärnorna vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C, dekantera försiktigt supernatanten till en torr pellet och låt den ligga på is.
OBS: Om startcellantalet är lågt (100 000-200 000 celler), utför celllyserings- och tvättstegen i ett 200 μL PCR-rör istället för ett 2 ml mikrocentrifugrör för att minska rörets yta och minimera förlusterna. Justera i så fall ner tvättbuffertvolymen för att rymma den mindre rörvolymen. - Upprepa steg 3.9-3.10 2x för totalt tre tvättar.
- Räkna kärnorna manuellt med hjälp av ett hemocytometerglas under mikroskopet. Använd trypanblått färgämne om så önskas för att ge kontrast för att se kärnorna och för att hjälpa till att skilja kärnor från olyserade celler.
- Förbered 1x Nuclei Buffer enligt det publicerade protokollet: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNashämmare i nukleasfritt vatten och håll på is (se materialtabell).
- Återsuspendera kärnpelleten i 1x Nuclei Buffer baserat på målinriktad kärnåterhämtning.
OBS: Om koncentrationen är tillräckligt hög, sikta på ett målutbyte på 10 000 eller något högre i detta steg (3 230-8 060 kärnor/μL) vid bestämning av startresuspensionsvolymen, givet den förväntade volymförlusten på 25 μL och 20 % minskning av koncentrationen med filtrering (steg 3.15). - För försiktigt de återsuspenderade kärnorna genom en 40 μm pipettspetscellssil och lägg kärnorna på is (figur 3D).
- Räkna om kärnorna (Figur 4A-C). Späd den slutliga lösningen ytterligare med Nuclei Buffer om det behövs.
- Transportera kärnorna på is och fortsätt omedelbart med kärnfångst enligt publicerade protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att isolera kärnor av hög kvalitet från patientens solida tumörprover för multiomsekvensering (Figur 1) dissocierades tumörvävnaden och en encellssuspension kryokonserverades (Figur 2A-D). Cellsuspensionen tinades sedan upp vid tidpunkten för den planerade multiominfångningen. Avskiljning av kärnor utfördes med optimerade lysbuffertreagenser och timing för att maximera både kvalitet och utbyte (Figur 3A-D). Representativa kärnbilder visar lämplig storlek och form (Figur 4A-C). Kärnorna som är inringade i ljusgrått visar en mild stöppling av höljet.
Bild 1: Schematisk bild av arbetsflödet för isolering av kärnor. Schematisk som visar det grundläggande arbetsflödet från ett vävnadsprov för hela tumörer till en suspension med en kärna redo för inlämning för kärnfångst, multiombiblioteksberedning och slutligen scRNA- och ATAC-sekvensering. Förkortningar: scRNA = encells-RNA; ATAC-seq = bestämning av transposastillgängligt kromatin med sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Vävnadsnedbrytning, kryokonservering, cellbedömning och centrifugering. A) Utrustning för malning av vävnadsprover från tumörer. B) Kryokonservering av cellsuspension. C) Mikroskopisk utvärdering av cellsuspensionen. D) Centrifugeringsmetod för detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Beredning av reagenser, extraktion och filtrering av kärnor. A) Beredning av reagenser för kärnextraktion. B) Upplösning av digitonin vid 65 °C före användning. C) Inkubation av prover för celllys på is. D) Filtrering av extraherade kärnor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa mikroskopiska bilder av kärnor som skördats från komplexa tumörvävnadsprover. (A-C) Representativa bilder av kärnor skördade med och utan trypanblåfärgning. (B,C) Kärnorna som är inringade i ljusgrått visar en mild stöppling av kärnhöljet. 10x och 40x objektiv används. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Lösningens namn | Komponenter | ||
| Sammanfatta buffert | 0,5-1 mg/ml kollagenas typ IV | ||
| 100 U/ml DNas I | |||
| 0,1% Poloxamer 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% fetalt bovint serum (FBS) i Medium 199 | |||
| 1X celllys buffert | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2 % BSA (i stället för 1 %) | |||
| 0,10 % interpolering av 20-20 | |||
| 0,1 % Nonident P40-ersättning | |||
| 0.01% Digitonin | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-hämmare i nukleasfritt vatten | |||
| Celllys utspädningsbuffert | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-hämmare i nukleasfritt vatten | |||
| Tvätta buffert | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0,10 % interpolering av 20-20 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-hämmare i nukleasfritt vatten | |||
Tabell 1: Lösningar som används i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att reda ut de heterogena cellpopulationer som finns i tumörens mikromiljö är ett aktivt fokusområde inom cancerbiologin. På samma sätt finns komplexa vävnader i godartade patologier som sårläkning och fibros. Multiomsekvensering har visat sig vara ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt att samla in scRNA- och ATAC-seq-data från samma cell. Detta protokoll beskriver isoleringen av kärnor, vilket kräver optimering vid bearbetning av färska, ömtåliga, små tumörprover. Här tillhandahåller vi ett protokoll för isolering av kärnor från desmoplastiska solida tumörvävnadsprover. Vi har funnit att detta tillvägagångssätt ger tillförlitliga och högkvalitativa data även när cellsuspensioner fryses före isolering och infångning av kärnor.
Att öka albuminkoncentrationen under hela analysen är till hjälp för att begränsa cell- och nedströmskärnor som klumpar ihop sig, vilket kan vara ett problem när man arbetar med tumörprover. När det gäller vävnadsnedbrytning kan reagenser i uppslutningssatser också användas med detta protokoll om så önskas (se materialförteckning). Om det används rekommenderar vi fortfarande att du följer smält-/släcknings- och buffertutbytena var 30:e minut för att maximera utbytet av livskraftiga celler. Efter vävnadsdissociation kan lys av röda blodkroppar utföras enligt tillverkarens protokoll. Ett gradientcellseparationsprotokoll kan också utföras efter forskarens bedömning (se materialtabell). Vi utför inte dessa protokoll rutinmässigt, men vi har tillämpat sådana protokoll på liknande prover utan märkbara skillnader i resultat. Om betydande, små rester noteras efter kärnfiltrering kan fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) övervägas för ytterligare rening. En detaljerad diskussion om FANS, inklusive protokollrekommendationer, finns tillgänglig men ligger utanför detta protokolls räckvidd. Det är värt att notera att det finns protokoll i litteraturen som tar hänsyn till ett fixeringssteg före celllys. Vi föredrar dock att fortsätta med icke-fixerad vävnad och kärnor eftersom scATAC-seq fungerar bäst på ofixerad vävnad9.
Eftersom RNas-hämmaren är ganska dyr är det rimligt att minska den beredda volymen av celllysbufferten (och celllysutspädningsbufferten) jämfört med de volymer som anges i det publicerade protokollet, om så önskas, så länge som förhållandet mellan reagenserna förblir proportionellt. Vid bedömning och räkning av de skördade kärnorna kan ett LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit appliceras efter forskarens bedömning. Trypanblått färgämne kan också användas för att ge kontrast för att se kärnorna och för att hjälpa till att skilja kärnor från olyserade celler om det behövs. Slutligen är det värt att notera att vi har tillämpat samma celllysbetingelser med justerade reagenser per protokoll för encells ATAC-seq med utmärkta resultat10.
Kritiska steg i protokollet är exakt timing av lys och skonsam men ändamålsenlig hantering av kärnorna. Underblandning kommer att leda till ofullständig eller inkonsekvent celllys; Överblandning kommer dock att skjuva kromatinet. Som noterats i andra protokoll för isolering av kärnor bör kärnblandning åstadkommas genom pipettering snarare än virvelning av provet eftersom skjuvkrafterna kan skada de ömtåliga kärnorna11. I detta avseende är det viktigt att Cell Lysis Buffer bereds färsk strax före användning vid varje tillfälle. Silning av pipettspetscellen (filtrering) efter det sista centrifugeringssteget är nyckeln enligt vår erfarenhet för att förhindra att kärnorna klumpar sig innan de fångas upp. Denna filtrering kan upprepas före laddning om klumpar fortfarande upptäcks vid den slutliga räkningen eller utvecklas under transporten av provet före laddning, med tanke på den ytterligare förlusten i volym och koncentration med varje filtreringssteg som läggs till. Observera att det inte bör finnas någon betydande tidspaus mellan isolering av kärnor och infångning.
Begränsningar med detta protokoll är att vävnadsdissociation och särskilt celllysinkubationstiden och förhållandena kan behöva optimeras för olika solida tumörtyper12. Detta protokoll har optimerats för desmoplastiska solida tumörer som bröstcancer och pankreasadenokarcinom och har också framgångsrikt tillämpats på icke-tumördesmoplastiska vävnader såsom parenkymal fibros, men andra tumörtyper kan kräva ytterligare justeringar. Den är optimerad för både färska cellsuspensioner och frysta cellsuspensioner med utmärkt kärnutbyte från båda dessa. Vi rekommenderar att du följer en sådan optimering sekventiellt med början med vävnadsdissociation, och när en optimal encellssuspension har uppnåtts, går vi vidare till optimering av celllysförhållandena för att ge en optimal suspension.
Encells-ATAC-sekvensering och på senare tid multiomsekvensering utgör ett enormt genombrottsverktyg för att reda ut cellulär heterogenitet i solida tumörer. Cellsubtyper kan avgränsas baserat på både deras kromatintillgänglighet och genuttrycksegenskaper, och påverkan av transkriptionsfaktorns tillgänglighet och uttryck på tumörbeteende kan undersökas direkt. Dessa metodologiska framsteg tillämpas brett med tanke på deras enorma potential att avslöja nya terapeutiska mål. Som sådan är utvecklingen av optimerade protokoll för att erhålla dessa data av yttersta vikt. Här delar vi med oss av detta protokoll för isolering av kärnor i samband med bukspottkörtelcancervävnad - en cancertyp för vilken det finns få terapier och alla med begränsad effekt hittills.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi vill tacka Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), särskilt Dhananjay Wagh och John Coller, och 10x Genomics för deras hjälp med att optimera våra experiment. Vi vill också tacka Drs. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser och Byrne Lee för deras hjälp med att skaffa patientprover. Vi vill tacka Art och Elaine Taylor, Rantz Foundation och Warren och Judy Kaplan för deras generösa stöd till våra forskningsinsatser. Finansieringskällor inkluderar NIH-anslag 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation och Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sekvensering erhölls med hjälp av maskiner som köpts med NIH-medel (S10OD025212, S10OD018220 och 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
- Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
- Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542 (2020).
