Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10
Summary
Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .
Abstract
La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l’iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L’iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell’occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l’iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell’area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.
Introduction
Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all’età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)1. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (ESCs)2,3,4, le cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e le cellule progenitrici retiniche (RPC)4,5,6,7,8 sono state utilizzate per ripristinare le cellule fotorecettrici danneggiate. Lo spazio sotto-retinico, uno spazio confinato tra la retina e l’RPE, è un luogo attraente per depositare queste cellule per sostituire le cellule fotorecettrici danneggiate, l’RPE e le cellule di Mueller a causa della sua vicinanza 9,10,11.
Le terapie geniche e cellulari hanno utilizzato lo spazio sottoretinico per la medicina rigenerativa per varie malattie della retina in studi preclinici. Ciò include la consegna di copie funzionali del gene o degli strumenti di editing genetico sotto forma di terapia oligonucleotidica antisenso12,13 o CRISPR/Cas9 o editing di base tramite la strategia basata su virus adeno-associati (AAV) 14,15,16, l’impianto di materiali (ad esempio, foglio RPE, protesi retiniche 17,18,19) e organoidi retinici derivati da cellule staminali differenziate 20,21,22 per il trattamento delle malattie retiniche e correlate all’RPE. Studi clinici che utilizzano hESC-RPE31 nello spazio sottoretinico per il trattamento dell’amaurosi congenita di Leber (LCA) associata a RPE6523,24, acromatopsia legata a CNGA325, retinite pigmentosa associata a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 si sono dimostrati efficaci. L’iniezione diretta di cellule in prossimità dell’area danneggiata migliora notevolmente la possibilità di insediamento cellulare nella regione appropriata, l’integrazione sinaptica e l’eventuale miglioramento visivo.
Anche se è stata stabilita l’iniezione sub-retinica in modelli umani e con occhi grandi (cioè maiale 32,33,34,35, coniglio 36,37,38,39,40 e primate non umano 41,42,43), tale iniezione nel modello murino è ancora impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare e dell’enorme lente che occupa l’occhio del topo 44,45,46. Tuttavia, i modelli geneticamente modificati sono prontamente disponibili solo in piccoli animali e non in animali di grandi dimensioni (ad esempio, conigli e primati non umani), pertanto l’iniezione sottoretinica nei topi attira l’attenzione per studiare nuovi approcci terapeutici nelle malattie genetiche retiniche. Per veicolare cellule o AAV nello spazio sottoretinico vengono utilizzati tre approcci principali, vale a dire la via transcorneale, la via trans-sclerale e la via pars plana (vedere la Figura 2). Le vie transcorneali e transsclerali sono associate alla formazione di cataratta, alle sinechie, al sanguinamento coroideale e al reflusso dal sito di iniezione 11,44,45,47,48,49. Abbiamo adottato l’approccio pars plana come visualizzazione diretta del processo di iniezione e il sito di iniezione può essere raggiunto in tempo reale al microscopio.
Recentemente abbiamo descritto un metodo in grado di differenziare le cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori fotorecettori in condizioni xenolibere, chimicamente definite, utilizzando l’isoforma di laminina ricombinante LN523 specifica per la retina umana. Poiché è stato scoperto che LN523 è presente nella retina, abbiamo ipotizzato che la nicchia della matrice extracellulare della retina umana potesse essere ricapitolata in vitro e quindi supportare la differenziazione dei fotorecettori dalle hESC36. L’analisi trascrittomica a singola cellula ha mostrato che i progenitori dei fotorecettori che co-esprimono l’omeobox cono-bastoncino e la recoverina sono stati generati dopo 32 giorni. Un modello murino mutante di degenerazione retinica 10 (rd10) che imita la retinite pigmentosa umana autosomica è stato utilizzato per valutare l’efficacia dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC al giorno 32 in vivo. Le cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC sono state iniettate nello spazio sub-retinico di topi rd10 a P20, dove la disfunzione e la degenerazione dei fotocettori sono in corso36. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC post-crioconservati e la consegna nello spazio sotto-retinico di topi rd10 . Questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare AAV, sospensioni cellulari, peptidi o sostanze chimiche nello spazio sottoretinico nei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung per aver fornito assistenza tecnica per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo la crioconservazione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e dalla National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) a H.G.T.
Materials
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
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