Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التوليد الفعال لمستقبلات مستضد الفئران الخيمري (CAR) - الخلايا التائية

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

يبسط هذا البروتوكول إنتاج النواقل الفيروسية القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر ، مما يسهل التوليد الفعال للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للفئران.

Abstract

حققت العلاجات الخلوية المهندسة باستخدام مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -T فعالية ملحوظة في الأفراد المصابين بالأورام الخبيثة الدموية وتخضع حاليا للتطوير لعلاج الأورام الصلبة المتنوعة. حتى الآن ، تم إجراء التقييم الأولي لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة في الغالب في نماذج ورم xenograft باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تم اختيار هذا النهج لتسهيل التطعيمات الناجحة للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية البشرية في البيئة التجريبية. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران التخليقية ، التي تستمد فيها الأورام والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من نفس سلالة الفأر ، تسمح بتقييم تقنيات CAR الجديدة في سياق نظام المناعة الوظيفي والبيئة المكروية الشاملة للورم (TME). يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى تبسيط عملية توليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في الفأر من خلال تقديم طرق موحدة لنقل الفيروسات القهقرية وزراعة الخلايا التائية خارج الجسم الحي . يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك المستخدمة في هذه الدراسة لتمكين التقييم الروتيني لتقنيات CAR الجديدة في الأنظمة ذات الكفاءة المناعية.

Introduction

أحدثت علاجات الخلايا التائية بالتبني التي تعبر عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CARs) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسخير قوة جهاز المناعة التكيفي لاستهداف الخلايا السرطانية الإيجابية للمستضد والقضاء عليها على وجه التحديد1. في حين تم التحقق سريريا من صحة نجاح علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف الأورام الخبيثة في الخلايا البائية ، تظل الدراسات قبل السريرية التي أجريت على النماذج الحيوانية حيوية لتطوير مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة التي تستهدف الأورام الصلبة. ومع ذلك ، فقد تم إثبات فعالية سريرية محدودة في مؤشرات الورم الصلب حتى الآن ، وأصبح من الواضح بشكل متزايد أن النماذج الفردية قبل السريرية لا تتنبأ بدقة بالديناميكا الدوائية والفعالية السريرية للدواءالحي 2,3. لذلك ، بدأ الباحثون في توسيع الدراسة قبل السريرية لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لتشمل تقييمات موازية في النماذج الغريبة والنماذج الجينية لسرطانات الإنسان والفئران ، على التوالي.

على عكس نماذج الطعم الأجنبي ، حيث يتم غرس الأورام البشرية والخلايا التائية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فإن النماذج الجينية تمكن من فحص استجابات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في سياق نظام المناعة الوظيفي. على وجه التحديد ، توفر الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تحمل أوراما متزامنة نظاما لدراسة التفاعل بين الخلايا التائية المنقولة بالتبني والأوساط الخاصة بالسياق - بما في ذلك الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) المعروفة بقمع وظيفة الخلايا التائية في البيئة المكروية للورم (TME)4،5،6. علاوة على ذلك ، توفر النماذج الجينية منصة إضافية لتقييم السمية المستهدفة خارج الورم ، وتفاعل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية مع العوامل المضيفة التي قد تؤدي إلى سمية إضافية ، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين7.

على الرغم من هذه المزايا ، لا يزال عدد دراسات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الاصطناعية محدودا. والجدير بالذكر أن النماذج التخليقية تتطلب هندسة ذاتية لخلايا CAR-T من نفس سلالة الفأر ، وبالتالي تمثل تحديا إضافيا بسبب عدم وجود منهجية لنقل الخلايا التائية الفعالة للفأر والتوسع خارج الجسم الحي 2,8. يحدد هذا البروتوكول طرق تحقيق تعبير مستقر عن CAR من خلال إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية ونقل الخلايا التائية الأمثل. يظهر رسم تخطيطي للعملية بأكملها في الشكل 1. يوضح استخدام هذا النهج النقل الفعال للفيروسات القهقرية للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وتحقيق تعبير عالي عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق. تتم مناقشة استراتيجيات تغيير خصوصية المستضد لبناء CAR بالإضافة إلى التعبير المشترك عن جينات التحوير الإضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (جامعة كولومبيا ، بروتوكولات AC-AABQ5551 و AC-AAAZ4470) باستخدام إناث BALB / c البالغة من العمر 6-8 أسابيع أو CF57BL / 6 الفئران التي يتراوح وزنها بين 20-25 جم. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتمحور هذا البروتوكول حول "أيام ما بعد التنشيط" للخلايا التائية الفئرانية ، ويبدأ الإنتاج الفيروسي في اليوم -2. يمكن تخزين الفيروس القهقري عند -80 درجة مئوية بعد الإنتاج الأولي ، وللاستخدام المستقبلي لهذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يبدأ بالخطوة 2 ، عزل الخلايا التائية وتنشيطها في اليوم 0.

1. إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية

ملاحظة: تم جعل المنتجات الفيروسية معيبة في النسخ المتماثل عن طريق فصل جينات التعبئة إلى بلازميدات منفصلة (انظر جدول المواد) ، مما يقلل بشكل كبير من احتمالية أحداث إعادة التركيب والإنتاج غير المقصود للفيروس المختص بالتكاثر.

  1. تحضير خلايا Phoenix Eco قبل يوم واحد من النقل (إجراء اليوم -2).
    1. صفيحة حوالي 1 × 107 خلايا في صفيحة معالجة ب TC مقاس 15 سم أو دورق استزراع T150 ، باستخدام 30 مل من وسط الاستزراع (وسط استزراع Phoenix Eco ، كما هو مفصل في الجدول 1).
    2. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد 18-24 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ تقريبا وموزعة بشكل موحد لضمان إنتاجية فيروسية عالية دون نمو زائد.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، استخدم الخلايا ذات الممر المنخفض وقم بتمريرها في اليوم السابق للطلاء لإنتاج الفيروس. لا تسمح لخلايا Phoenix Eco بالنمو الزائد أثناء الزراعة الروتينية.
  2. قم بإعداد مزيج النقل الذي يحتوي على الكواشف الشحمية والكاشفة المحسنة ، pCL-Eco (Gag / Pol) ، وبلازميد تعبير pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) في وسائط مصل مخفضة (انظر جدول المواد) (إجراء اليوم -1).
    ملاحظة: يجب إجراء النقل المشترك بنسبة 1: 1 من pMSCV و pCL-Eco.
    1. تحضير الأنبوب A: قم بتخفيف 105 ميكرولتر من كاشف النقل في 3.75 مل من وسط المصل المخفض لكل صفيحة 15 سم واخلطها جيدا عن طريق الدوامة أو السحب لأعلى ولأسفل.
    2. تحضير الأنبوب B: تمييع بلازميد تعبير pMSCV (21 ميكروغرام) و pCL-Eco (21 ميكروغرام) مع 90 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى 3.75 مل من وسط المصل المختزل لكل لوحة 15 سم. تخلط جيدا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل.
      ملاحظة: في حالة إنشاء منتجات فيروسية متعددة، قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على pCL-Eco وكاشف المحسن.
    3. أضف الأنبوب A إلى الأنبوب B واخلطه جيدا عن طريق الماصة. احتضان لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما ينتج عنه حجم إجمالي يبلغ حوالي 7.5 مل.
    4. قم بإزالة 10 مل من وسائط زراعة الخلايا بعناية من لوحة (لوحات) Phoenix Eco وأضف الحجم الكامل لمزيج النقل إلى الوسائط المتبقية عن طريق إمالة اللوحة والسحب بالتنقيط. أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
  3. قم بتغيير الوسائط على خلايا Phoenix Eco المنقولة بعد 16-20 ساعة من النقل (إجراء اليوم 0).
    1. مصل ما قبل التسخين و β-mercaptoethanol (2-ME ، انظر جدول المواد) - وسط الخلايا التائية الخالية من الفئران (mTCM - الحصاد الفيروسي ، كما هو موضح في الجدول 1) إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي أو حبة.
    2. قم بإزالة وسط ثقافة Phoenix Eco بعناية عن طريق إمالة اللوحة ووضع طرف الماصة في الزاوية السفلية ، باستخدام مكنسة كهربائية إن أمكن. تجنب الإفراط في تجفيف الخلايا.
    3. أضف برفق وسط الحصاد الفيروسي mTCM الدافئ إلى جانب اللوحة المائلة عن طريق سحب 30 مل على أبطأ إعداد. أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن تتسبب هذه الخطوة في انفصال خلايا Phoenix Eco عن اللوحة وتقليل التتر الفيروسي. ستعمل الوسائط التي تم تسخينها مسبقا والسحب اللطيف على تقليل الاضطراب.
  4. حصاد طاف الفيروسية 48 ساعة بعد النقل (إجراء اليوم 1).
    1. احصد المادة الطافية الفيروسية وقم بتصفيتها من خلال مرشحات PVDF 0.45 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لإزالة الخلايا والحطام. قم بتجميد الفيروس عند -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى اليوم 1 من الخطوة 3 في حالة استخدام فيروس جديد.
    2. حدد العيار الفيروسي (وحدات التحويل / مل) عن طريق قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح سابقا9. هذه الخطوة اختيارية.
      1. تحديد العيار الفيروسي عن طريق نقل 1 × 105 خلايا تائية مورين منشطة على نطاق صغير في صفائح 96 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة (TC) ، مغلفة مسبقا بالريترونيكتين (انظر جدول المواد) ومحملة بتخفيفات تسلسلية ثلاثية من طاف الفيروس القهقري في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر من وسط الحصاد الفيروسي mTCM.
        ملاحظة: انظر الخطوة 2 والخطوة 3 أدناه للحصول على إرشادات مفصلة حول عزل الخلايا التائية وتنشيطها ونقلها.
      2. تحديد تعبير سطح CAR بعد 4-5 أيام من النقل عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      3. احسب العيار الفيروسي وفقا للصيغة10: (N x F x D) / V ، حيث N هو عدد الخلايا المحولة ، F هو تردد الخلايا الموجبة CAR ، D هو عامل التخفيف ، و V هو حجم التنبيط في مل للحصول على وحدات تحويل (TU) / مل.
        ملاحظة: قد ينخفض العيار الفيروسي عند التجميد / الذوبان ؛ لذلك ، يتم تحديد العيار الفيروسي بشكل مثالي على الفيروس المجمد والمذاب لاحقا.

2. عزل الخلايا التائية الفئران

  1. عزل وتنشيط الخلايا التائية الفئران (إجراء اليوم 0).
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوات في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 4 درجات مئوية ويجب تنفيذها في بيئة معقمة.
    1. حصاد الطحال (الطحال) من سلالة الفئران ذات الأهمية (على سبيل المثال ، Balb / c ، C57BL / 6) كما هو موضح سابقا11 والحصول على تعليق أحادي الخلية من خلال التفكك الميكانيكي.
    2. باستخدام الجزء الخلفي من حقنة معقمة ، سحق الطحال (الطحال) من خلال مصفاة خلية 70-100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل.
    3. بعد وضع المحقنة جانبا ، اغسل المصفاة ب 5 مل من محلول عزل الخلايا التائية (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS ، مكمل بمصل بقري جنيني 2٪ ، FBS).
    4. كرر خطوة الهرس واغسل المصفاة مرة أخرى باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلايا التائية. ارفع الحجم النهائي إلى 50 مل باستخدام المخزن المؤقت لعزل الخلايا التائية.
    5. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم اليدوي أو عداد الخلايا التلقائي عن طريق التخفيف بنسبة 1:20 ثم الخلط عند 1: 1 مع تريبان الأزرق.
    6. قم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 × جم ، عند 4 درجات مئوية (أو RT) ، وأعد تعليق الخلايا الطحالية عند 1 × 108 / مل في حالة استخدام مجموعة عزل الخلايا التائية الموصى بها (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن إعادة تصفية الخلايا الطحالية من خلال مصفاة 40-70 ميكرومتر في هذه المرحلة لإزالة الكتل.
  2. اعزل خلايا CD3+ T عن طريق التحديد السلبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). بعد الفصل المغناطيسي ، انقل العزلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بإجراء تعداد نهائي للخلايا الحية.
  3. قم بتجميع الخلايا التائية المعزولة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 450 × جم ، عند 4 درجات مئوية (أو RT) ، وأعد تعليقها عند 1 × 106 / مل في وسط تنشيط mTCM (الجدول 1).
  4. قم بتنشيط الخلايا التائية عن طريق إضافة خرز مغناطيسي مغلف بالأجسام المضادة أحادية النسيلة مضادة ل CD3 / مضاد CD28 (انظر جدول المواد) بنسبة 25 ميكرولتر / 1 × 106 خلايا تائية و 100 وحدة / مل IL-2.
  5. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية واتركها طوال الليل.
    ملاحظة: نظرا لصغر حجم الخلايا التائية ، يمكن تحقيق عدد أكثر دقة من الخلايا التائية الحية عن طريق التخفيف بنسبة 1: 10-1: 20 والخلط عند 1: 1 مع تريبان الأزرق للعد اليدوي باستخدام مقياس الدم. يمكن تحديد النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق تلطيخ الخلايا بجسم مضاد αCD3 مترافق بالفلورسنت. سينتج كل طحال ما بين 7-10 × 106 خلايا تائية اعتمادا على عمر وسلالة الفأر.

3. نقل الخلايا التائية الفئران

  1. تحضير لوحات للتنبيغ (إجراء اليوم 0).
    1. قم بطلاء الألواح المعقمة غير المعالجة مسبقا المكونة من 24 بئرا ب 0.5 مل من كاشف محسن نقل الفبرونيكتين البشري (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي يتراوح بين 20-40 ميكروغرام / مل عن طريق تخفيفه في برنامج تلفزيوني معقم وتخزينه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوة في اليوم 1 عن طريق طلاء الألواح غير المعالجة المكونة من 24 بئرا بكاشف التنبيغ واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  2. إجراء نقل الخلايا التائية (إجراء اليوم 1).
    1. تحضير لوحة المغلفة مسبقا للتنبيث. قم بإزالة كاشف النقل من كل بئر من الصفيحة والكتلة المطلية مسبقا المكونة من 24 بئرا بحجم مكافئ من PBS المصفى المعقم + 2٪ ألبومين مصل الأبقار (BSA) (0.5 مل) لمدة 30 دقيقة في RT.
    2. يغسل مرة واحدة مع 0.5-1 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. أضف 0.5-1 مل من الفيروس القهقري الأنيق من الخطوة 1 أو مخفف بناء على العيار الفيروسي إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي مطلي مسبقا لمدة 90 دقيقة عند 2000 × جم و 32 درجة مئوية.
  4. أضف 1 مل من الخلايا التائية المنشطة إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي محمل بالفيروس لمدة 10 دقائق عند 450 × جم و 32 درجة مئوية. أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. بعد 24 ساعة من النقل ، قم بإزالة 1-1.5 مل من وسائط زراعة الخلايا واستبدلها ب 1-1.5 مل من mTCM-complete و 10 نانوغرام / مل من IL-7 و IL-15 البشري المؤتلف (انظر جدول المواد). أعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية (إجراء اليوم 2).
    ملاحظة: أثناء الزراعة خارج الجسم الحي ، يجب إضافة 10 نانوغرام / مل من السيتوكينات إلى المزرعة كل 48 ساعة ، ويجب عدم تخفيف الخلايا التائية بعد 1 × 106 / مل.
  6. بعد 48 ساعة من النقل ، انقل الخلايا من لوحة التنبيغ إلى صفيحة جديدة من 24 بئرا أو 6 آبار وأعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية (إجراء اليوم 3).
    ملاحظة: قد تتحسن صلاحية الخلايا التائية عن طريق نقل الخلايا في 24 ساعة إلى يومين بعد النقل ، اعتمادا على بدء صلاحية الخلايا التائية والعيار الفيروسي.
  7. قم بإزالة خرزة الخلايا التائية وتأكيد تعبير CAR (إجراء اليوم 5-6).
    1. أعد تعليق الخلايا تماما لفصل الخلايا التائية المنشطة عن الخرزات المطلية ب αCD3 / CD28 (انظر جدول المواد) وضع تعليق الخلية على مغناطيس لمدة 30 ثانية. انقل معلق الخلية إلى وعاء الاستزراع خارج الجسم الحي المطلوب وأعده إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استزراع الخلايا التائية في قوارير الثقافة أو ألواح زراعة الآبار العميقة. يوصى بطلاء ما لا يقل عن 5 × 106 خلايا T في 30 مل من وسط mTCM الكامل لكل بئر في بئر عميق من صفيحة ذات تنسيق 6 آبار (انظر جدول المواد).
    2. تحديد تعبير CAR عن طريق قياس التدفق الخلوي8.
      ملاحظة: تم تحديد تعبير GFP-CAR عن طريق الحضانة مع 100 نانوغرام / مل من GFP المنقى. سيؤدي دمج علامة N-terminal epitope إلى تسهيل اكتشاف تركيبات CAR البديلة.
  8. إجراء زراعة خارج الجسم الحي للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية (إجراء اليوم 7-10).
    1. أثناء الزراعة خارج الجسم الحي ، حافظ على الخلايا عن طريق إزالة 50٪ من وسط المزرعة واستبداله ب mTCM-complete + 2x 10 نانوغرام / مل من IL-7 و IL-15 كل 48 ساعة.
      ملاحظة: خلايا Murine CAR-T جاهزة للاستخدام في التطبيقات النهائية بعد 7 أيام من التنشيط ويجب عدم حفظها بالتبريد بسبب ضعف الصلاحية بعد الذوبان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى توحيد عملية نقل الخلايا التائية للفأر لتوليد خلايا CAR-T للفأر. ويقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للخطوات المعنية. تبدأ العملية بإنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية عن طريق النقل المشترك للمكونات الفيروسية إلى خلايا Phoenix Eco. يقدم الشكل 2 صورة للكثافة المثلى لخلايا Phoenix Eco في يوم النقل. ثم يتم تنشيط الخلايا التائية المعزولة بعد 24 ساعة من النقل ، أو "اليوم 0" من هذا البروتوكول ، استعدادا للتنبيغ في اليوم 1. بعد التحويل ، يتم زراعة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في وجود IL-7 و IL-15 البشريين المؤتلف لتحقيق تمدد كاف للطية مع الحفاظ على مجموعات ذاكرة الخلايا الجذعية.

ينتج عن استخدام مجموعة عزل الخلايا التائية الموصى بها (انظر جدول المواد) مع هذا البروتوكول نقاء الخلايا التائية بنسبة <98٪ قبل النقل ، على النحو الذي يحدده قياس التدفق الخلوي (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، يمكن تحقيق معدلات تعبير CAR القابلة للتكرار بنسبة 65٪ -75٪ باستخدام هذا البروتوكول وتعديل ناقل الفيروس القهقري pMSCV للتعبير عن بنية CAR من مروج PGK (الشكل 3B ، C). يكشف تحديد عيار الفيروسات القهقرية عن عيار يصل إلى ~ 2 × 107 وحدة حرارية بريطانية / مل وتعبير CAR بنسبة 74٪ مع 1/3rd من المادة الطافية الفيروسية التي يتم حصادها بعد النقل المشترك ل pMSCV مع pCL-Eco (الشكل التكميلي 1).

أخيرا ، تؤدي الزراعة خارج الجسم الحي مع 10 نانوغرام / مل من IL-7 و IL-15 إلى توسع 15 ضعفا تقريبا ، مما يؤدي إلى ~ 150 × 106 خلايا تائية بحلول اليوم 10 بعد التنشيط من طحال واحد (الشكل 3D). تؤدي الثقافة باستخدام IL-7 و IL-15 إلى ترددات خلايا CD8 + و CD4 + T قابلة للمقارنة (الشكل 3E) ومجموعات ذاكرة الخلايا الجذعية المحفوظة التي يحددها تعبير CD62L + CD44- بعد 10 أيام من الثقافة خارج الجسم الحي (الشكل 3F).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. اللوحة العلوية: نظرة عامة تخطيطية على الجدول الزمني للبروتوكول. اللوحة السفلية: إرشادات خطوة بخطوة لإنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكثافة الخلوية المثلى للنقل. صورة مجهرية برايتفيلد لخلايا Phoenix Eco بالكثافة المثلى قبل النقل باستخدام pMSCV و pCL-Eco. تم التقاطها باستخدام عدسة موضوعية بمعدل 10 أضعاف. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إنتاج الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي. (أ) مخطط قياس التدفق الخلوي الذي يوضح تواتر خلايا BALB/c CD3+ بعد عزل الخلايا التائية الفأرية. (ب) التمثيل التخطيطي للناقل الفيروسي القهقري pMSCV المستخدم في تعبير GFP-CAR في الخلايا التائية الفئرانية. (ج) الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي توضح تعبير سطح CAR على الخلايا التائية للفأر بعد الحضانة باستخدام sfGFP المنقى. UT ، غير محولة. (د) تمدد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية بحلول اليوم 10 بعد التنشيط والزرع باستخدام IL-17 و IL-15 البشريين المؤتلفين. تم تنشيط ما يقرب من 8 × 106 خلايا تائية مورين قبل التنبيغ ووصلت إلى ما يقرب من 1.28 × 108 بحلول اليوم 10 بعد التنشيط. (ه) مخطط قياس التدفق الخلوي الذي يوضح تواتر خلايا CD8+ وCD4+ CAR-T في اليوم 10 بعد التنشيط. (F) مخطط قياس التدفق الخلوي الذي يوضح تردد مجموعات ذاكرة الخلايا التائية CD8 + المحددة بواسطة التعبير السطحي CD62L و CD44. تتميز ذاكرة الخلايا الجذعية (TSCM) ب CD62L + CD44- ، والذاكرة المركزية (TCM) بواسطة CD62L + CD44 + ، والذاكرة المستجيبة (TEM) بواسطة CD62L-CD44 +. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: صياغة وسائط زراعة الخلايا. تفاصيل الصياغة لوسائط زراعة الخلايا المستخدمة في البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي 1: التعبير السطحي ل CAR وعيار الفيروسات القهقرية. (أ) الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي تظهر تعبير سطح CAR على الخلايا التائية BALB / c بعد الحضانة باستخدام sfGFP المنقى. تم إنشاء الفيروس القهقري عن طريق نقل خلايا Phoenix Eco مع pMSCV_PGK_mGFP28z بالاشتراك مع pCL-Eco و pMD2.G (I) أو pCL-Eco (II) أو بمفرده (III). تم تحويل الخلايا التائية بالفيروس القهقري المخفف كما هو موضح. (ب) التتر الفيروسي القهقري الذي يحدده التعبير السطحي CAR للخلايا التائية المستحثة. تم حساب وحدات التحويل (TU) / mL باستخدام الصيغة: (N∙F∙D) / V ، حيث N هو عدد الخلايا المحولة (1 × 105) ، F هو تردد خلايا CAR + ، D هو عامل التخفيف ، و V هو حجم النقل في مل (0.2 مل). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: تسلسل متجه تعبير pMSCV. تسلسل GFP28z CAR والتسلسلات الجانبية (المائلة) في متجه تعبير pMSCV ، مع تمييز مواقع إنزيم NotI و BamHI باللون الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول الخطوات والكواشف اللازمة لنقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية الفئرانية لتوليد خلايا CAR-T للدراسات في الجسم الحي . إن تحسين ظروف نقل الفيروسات القهقرية يحقق تعبيرا قويا عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق أو الكواشف الإضافية. ومع ذلك ، هناك العديد من التعديلات التي يمكن تطبيقها على هذه المنهجية.

بينما يصف هذا البروتوكول مثال توليد CAR الخاص ب GFP ، يمكن تكييف هذه الطرق لتوليد خلايا CAR-T للفأر تستهدف أي مستضد خارج الخلية مهم. يسمح ناقل الفيروسات القهقرية pMSCV_PGK المستخدم في هذه الدراسة بالإفراج الفعال عن تسلسل الجسم النانوي الخاص ب GFP عن طريق الهضم الأنزيمي مع NotI و BamHI ويمكن استبداله بمجال التعرف على المستضد المحدد من قبل المستخدم مثل scFv أو الجسم النانوي أو مجال ربط الرباط (الملف التكميلي 1). لتسهيل تقييم تعبير CAR البديل ، يوصى بتصميم CARs بعلامة N-terminal epitope ، مثل علامات Myc (EQKLISEEDL) أو Flag (DYKDDDDK) ، والتي يمكن اكتشافها باستخدام الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت12. وعلاوة على ذلك، تبين الدراسة الحالية إنتاج جين محوري واحد؛ ومع ذلك ، فإن دمج الببتيدات ذاتية الشق (تسلسلات 2A) أو مواقع دخول الريبوسوم الداخلية (IRES) سيمكن من الإنتاج المشترك لجينات التحوير المتعددة ، بما في ذلك التقنيات الإضافية لتعزيز وظيفة الخلايا التائية في الجسم الحي8،13،14.

على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تطويره للتخلص من الحاجة إلى المعدات المتخصصة عن طريق حذف الطرد المركزي الفائق (24000 × جم ، 2 ساعة ، 4 درجات مئوية) ، تجدر الإشارة إلى أن تركيز المادة الطافية الفيروسية يمكن أن يحقق عيارا فيروسيا أعلى ويقلل من حجم الفيروس المطلوب لتحقيق تعبير CAR العالي8. بالإضافة إلى ذلك ، يبسط هذا البروتوكول إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية من خلال تحقيق عيار فيروسي مرتفع بشكل متكرر (~ 2 × 107 وحدة حرارية بريطانية / مل) وتعبير ثابت عن CAR دون الحاجة إلى تحديد عيار فيروسي قبل الاستخدام. ومع ذلك ، بالإضافة إلى تسهيل التوحيد القياسي ، فإن تحديد العيار الفيروسي قبل نقل الخلايا التائية قد يزيد أيضا من صلاحية الخلايا التائية عن طريق تقليل السمية المحتملة الناجمة عن التركيزات الفيروسية العالية غير الضرورية10,15.

يوصى بمكملات IL-7 و IL-15 لتعزيز توسع الخلايا التائية والحفاظ على مجموعات ذاكرة الخلايا التائية ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام IL-2 البشري المؤتلف كبديل لتقليل عدد الكواشف اللازمة للزراعة خارج الجسم الحي 16،17،18،19. ومع ذلك ، فإن طرق توليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الموضحة هنا لا تزال محدودة بسبب التوسع الضعيف نسبيا للخلايا التائية الفئرانية. ومع ذلك ، يمكن تعزيز تدابير تحسين صلاحية الخلايا التائية التي تمت مناقشتها أعلاه من خلال تضمين مكملات إضافية و 2-ME في وسط زراعة mTCM طوال عملية التنبيغ20. في حين أن هذه التعديلات قد تحسن تمدد الخلايا التائية من 15 ضعفا إلى 20 ضعفا20 ، إلا أنها قد تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل وتقليل تعبير CAR.

وفي نهاية المطاف، يمكن إنتاج الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الفئرانية من تطوير نماذج جينية لتقييم وظيفة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية داخل نظام مناعي سليم - مما يسهل إجراء تقييم خاص بالسياق لقوتها ومتانتها وسلامتها. في حين أن النماذج في الفئران التي تعاني من نقص المناعة تسمح بإجراء دراسات مهمة قبل السريرية لمنتج الخلايا التائية البشرية التي تستهدف مستضد الورم البشري. سيكون الجمع بين أنظمة النماذج التكميلية هذه أمرا لا غنى عنه لفهم تعقيد بيولوجيا الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية ، وتحسين تصميمات CAR الجديدة ، وفي النهاية ترجمة النتائج قبل السريرية إلى علاجات سريرية فعالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر L. Brockmann على المراجعة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1R01EB030352 و UL1 TR001873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 204 ،
التوليد الفعال لمستقبلات مستضد الفئران الخيمري (CAR) - الخلايا التائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vincent, R. L., Li, F., Ballister,… More

Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter