Summary
小鼠肺内气管移植 （IPTT） 模型对于研究肺移植后的闭塞性气道疾病 （OAD） 很有价值。它以高可重复性提供了对同种异体移植后气道闭塞中肺特异性免疫学和血管生成行为的见解。在这里，我们描述了 IPTT 程序及其预期结果。
Abstract
小鼠肺内气管移植 （IPTT） 用作肺移植后闭塞性气道疾病 （OAD） 的模型。该模型最初由我们的团队报道，由于其高技术可重复性和研究免疫行为和治疗干预的适用性，该模型已用于 OAD 的研究。
在 IPTT 模型中，啮齿动物气管移植物通过胸膜直接插入受体的肺部。该模型不同于异位气管移植 （HTT） 模型，其中移植物移植到皮下或网膜部位，也不同于原位气管移植 （OTT） 模型，其中供体气管取代受体的气管。
成功实施 IPTT 模型需要先进的麻醉和手术技能。麻醉技能包括接受者的气管插管、设置适当的通气参数以及麻醉恢复后适当定时拔管。手术技巧对于在肺内精确放置移植物以及确保有效密封脏胸膜以防止漏气和出血至关重要。一般来说，学习过程大约需要 2 个月。
与 HTT 和 OTT 模型相比，在 IPTT 模型中，同种异体移植气道在相关肺微环境中发生气道闭塞。这使研究人员能够研究肺移植后气道闭塞所涉及的肺特异性免疫学和血管生成过程。此外，该模型的独特之处在于它表现出三级淋巴器官 （TLO），这在人类肺同种异体移植物中也可见。TLO 由 T 细胞群和 B 细胞群组成，其特征是存在指导免疫细胞募集的高内皮小静脉;因此，它们很可能在移植物的接受和排斥中起着至关重要的作用。我们得出的结论是，IPTT 模型是研究肺移植同种异体移植物气道闭塞发展中涉及的肺内免疫和促纤维化途径的有用工具。
Introduction
肺移植已被确定为终末期呼吸系统疾病患者的有效治疗方法。然而，人肺移植受者的中位生存率仅为 6 年左右，闭塞性细支气管炎 （OB） 是一种阻塞性气道疾病 （OAD），是移植后第一年后死亡的主要原因1。
已经利用几种动物模型来研究OAD的潜在机制。其中一种模型是异位气管移植 （HTT） 模型2。在该模型中，气管移植物被植入接受者的皮下组织或网膜中。发生缺血诱导的气管移植物上皮细胞丢失，随后发生同种异体淋巴细胞浸润和供体上皮细胞凋亡。成纤维细胞和肌成纤维细胞在气管周围迁移，产生细胞外基质。最后，气道管腔完全纤维性闭塞。HTT模型技术简单，提供 体内 环境，并提供高可重复性。
研究 OAD 的另一种模型是大鼠原位气管移植 （OTT） 模型，其中气管移植物插入受体的气管以维持生理通气3。在该模型中，缺血诱导的供体上皮细胞耗竭导致它们被气管内受体上皮细胞取代，形成通畅的气道并伴有中度纤维化。尽管这些模型有助于理解肺移植后气道闭塞，但它们在肺实质微环境的概括方面存在局限性。
我们的研究小组介绍了大鼠肺内气管移植（IPTT）模型，其中气管移植物植入受体肺4（图1）。IPTT 模型表现出肺微环境中发生的气道管腔纤维性闭塞。此外，它已成功应用于技术上比大鼠IPTT 5,6,7,8,9,10更具挑战性的小鼠。小鼠IPTT模型的这种适应使我们能够更深入地研究使用转基因小鼠进行肺移植后OAD肺免疫环境的复杂细节。
IPTT 模型具有一些独特的功能。一种是新血管生成，它由肺循环促进，在气道闭塞中起着至关重要的作用 4,10。此外，IPTT 模型表现出淋巴样聚集体，其中一些具有表达外周淋巴结地址蛋白的高内皮小静脉，表明它们是三级淋巴器官 （TLO）7,8。TLO 类似于淋巴结，由 T 细胞、B 细胞组成，通常由滤泡树突状细胞伴生的生发中心组成 11,12。TLOs在各种慢性炎症性疾病（包括气道闭塞）中已有报道，这使得IPTT模型适用于研究TLOs在气道闭塞中的作用7,8,11,12,13。本文介绍了小鼠 IPTT 模型的方法，目的是让研究人员熟悉该模型，并促进对肺移植后气道闭塞的进一步研究。
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Protocol
所有动物均按照加拿大动物护理委员会在《实验动物护理和使用指南》中规定的指南进行治疗。该实验方案已获得多伦多综合医院研究所动物护理委员会、大学健康网络的批准。
1. 供体手术
注意：BALB / c小鼠被用作实验供体的一个例子。所有程序都必须使用无菌技术进行。
- 在操作之前，记录每只鼠标的重量。
- 使用CO2 室对小鼠实施安乐死。
- 确认死亡后，将鼠标置于仰卧位并用胶带固定四肢。
- 用 70% 异丙醇对手术区域进行消毒，为手术区域做好准备。
注意：如果需要并按照当地动物伦理委员会的建议，从切口部位剪下毛皮。 - 在皮肤上做一个中线切口，从中腹部开始，延伸到颈前区。
- 通过小心地缩回脂肪垫、横向移动带状肌肉并将气管与周围的结缔组织分开来进入气管。使用镊子在气管和食道之间创造空间。
- 抬起剑突并切断横膈膜。
- 抬高胸骨，通过插入止血钳确保从胸骨到颈部区域的畅通路径。夹住两侧的肋骨，切开胸骨，向上延伸至颈部肌肉。
- 去除胸腺和任何阻塞气管的脂肪或肌肉，以暴露气管分叉处。
- 切开主支气管，小心地将气道与食道分开。
- 切开喉部并将其取出。
- 用无菌盐水溶液或用浸泡在无菌盐水或保存溶液中的无菌纱布的保存液喷洒解剖的气管，并将其放在冰上以保持其活力。
2. 受体手术
注意：C57BL / 6小鼠用作实验受体的示例。
- 在手术当天早上以 1 mg/kg 的剂量皮下注射缓释丁丙诺啡。
- 使用5%异氟烷在诱导室中诱导麻醉。
- 一旦小鼠被轻度麻醉，腹膜内注射由（0.1mg / g）甲苯噻嗪和（0.01mg / g）氯胺酮组成的混合物。
- 将小鼠放回诱导室，保持2-3%异氟烷。
- 在手术部位剃掉皮毛。此外，以 7 mg/kg 的剂量沿计划的注射部位皮下注射布比卡因作为线块。
- 在经口气管插管前确认对脚趾捏合没有反射反应。使用20G静脉导管经口气管插管小鼠，并将其连接到潮气量为500μL，呼吸频率为120bpm，100%氧气和2%异氟烷的呼吸机。使用带有夹子的支架夹在舌头上，将动物保持在垂直位置，颈部伸直，以方便此过程。
- 激活加热垫并将鼠标放置在加热垫顶部的右侧位置，头部远离外科医生，尾巴朝向外科医生（图 2）。用胶带固定四肢。在眼睛上涂上兽药膏，以防止麻醉时干燥。
- 用7.5%聚维酮碘擦洗手术区域，用70%异丙醇消毒，用10%聚维酮碘重新擦洗。使用无菌手术布覆盖手术区域。
- 在此期间，将供体气管加载到 16 G 静脉导管中（图 3C，D）。
- 使用手术刀在接受者的皮肤上切开一个切口，烧灼肌肉和结缔组织。
- 打开第五或第六肋间隙，并使用两个牵开器保持肋骨腔打开。
- 用棉签和剪刀解剖肺下韧带。
- 模拟供体气管通路的创建（图3G，H）。
- 用三通旋塞阀部分闭塞呼吸机流出管，以促进左肺充气，从而固定呼吸机流出管。
- 通过用 20 G 针刺穿左肺来创建通路。确保穿刺深度大致等于气管同种异体移植物的长度。选择肺边缘的穿刺部位（如 图3I所示），确保通路平行于桌面（ 如图3J中的蓝色圆圈标记）。
注意：向上的插入角度将导致胸膜层的穿透，而较深的角度可能会导致主要血管出血（ 如图3J中的红十字标记）。 - 将 16 G 静脉导管插入左肺，并将供体气管挤压到左肺中。插入气管同种异体移植物后，松开三通旋塞阀，使呼气流畅通无阻地通过流出管。
- 用夹子关闭胸膜注射部位（图3K，L）。将夹子精确定位在穿刺部位，其边缘对齐以匹配肺边缘的轮廓（由图3L中的蓝色圆圈表示）。
注意： 夹子部位的位置不正确会导致密封无效和漏气，而夹子深度不足可能会导致夹子在手术后脱落（如 图 3L 中的红叉所示）。 - 用生理盐水填充胸腔，并用纱布吸收生理盐水。
- 使用运行缝合技术对左肺进行再充气并闭合肋骨。
- 用中断的缝合线闭合肌肉和皮肤。
- 手术结束时皮下注射美洛昔康镇痛药，剂量为 5 mg/kg。
- 观察接收鼠标，直到它醒来。然后，取出气管插管并将受体小鼠放入笼子中。
注意：受体小鼠应单独饲养。 - 美洛昔康（5mg/kg）每日一次皮下注射，术后24小时开始，术后持续3天。
3.从受体小鼠收集样本
- 使用5%异氟烷在诱导室中诱导麻醉。
- 在口气管插管前确认对脚趾捏合没有反射反应。插管方法和呼吸器设置与受体手术相同。
- 将鼠标置于仰卧位并固定四肢。
- 用 70% 异丙醇对手术区域进行消毒，为手术区域做好准备。
- 在皮肤上做一个中线切口，从中腹部开始，延伸到颈前区。
- 使用连接到25G针头的1ml注射器通过下腔静脉对小鼠进行放血，导致安乐死。
- 打开胸部，以与供体小鼠相同的方式进入气管。用 7-0 丝绸将气管绑在插管周围。
- 去除胸腺、脂肪和肌肉，露出心脏。
- 切开左心房、右心房和下腔静脉。用 3 mL 无菌生理盐水通过右心室灌注肺部。
- 对于组织学分析，通过插管用 10% 福尔马林充气肺部。
- 拔管通气管并用 7-0 丝绸绑住气管。
- 将喉部和食道分开。将它们拉向下部，然后提取心脏和肺阻滞，将其放入10%福尔马林中。
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Representative Results
根据我们的经验，熟练掌握此模型通常需要大约 2 个月的培训。一旦达到熟练程度，供体程序通常需要 15 分钟，而接受者程序大约需要 30 分钟。训练有素的操作员的预期死亡率为 0%。
在 图4A中，气管同种异体移植物与成纤维细胞组织完全阻塞，上皮细胞明显被破坏。相反，在 图4B中，气管同工移植物保持通畅，上皮细胞被保留。
图 5 显示了气管同种异体移植物移植的肺，显示了淋巴聚集体的存在。
图1：小鼠肺内气管移植模型图。 从供体小鼠中提取气管同种异体移植物。将气管同种异体移植物装入导管中。气管同种异体移植物被移植到受者的肺部。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：手术过程中接受者的位置。 将鼠标置于右侧褥疮位置。受体小鼠的头部远离外科医生，尾巴朝向外科医生。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：用于气管插入的导管和气管移植物插入方向的图示。 （A） 气管插入导管。外导管有一个锋利的尖端（左），而内导管有一个钝的尖端（右）。（B） 外导管和内导管的组合。内导管从外导管略微突出。（C，D）将供体气管装入导管。红色括号表示气管移植物。（E） 导管内的气管移植物。红色括号表示气管移植物。（F） 使用内导管作为“推杆”挤出内气管移植物。红色括号表示气管移植物。（G、H）模拟气管移植物的放置方向。（一、J）使用 22 G 针创建通路。深度应与气管同种异体移植物的长度密切匹配。针头的方向应与外科医生相反，并与桌面平行。正确的穿刺部位用红点表示。适当的插入角度由蓝色圆圈表示。不正确的角度由红叉表示。（K，L）用夹子闭合胸膜注射部位。黑线表示剪辑。红点代表穿刺部位。蓝色圆圈表示正确的剪切点。红叉表示剪切点不正确。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：肺移植后 28 天的组织病理学。 （A） 气管同种异体移植物的 H&E（左）和 Masson 三色染色图像（供体：BALB/c，受体：C57BL/6）。同种异体移植物的管腔被胶原蛋白和纤维组织阻塞，这些胶原和纤维组织被Masson's Trichrome（黑色箭头）染成蓝色。此外，上皮细胞已经丢失（蓝色箭头）。（B） 气管等移植物的 H&E（左）和 Masson 的三色染色图像。与同种异体移植物相比，同种移植物（供体，受体：C57BL/6）的管腔保持开放，上皮细胞得以保留。染色的组织是粘液。比例尺 = 500 μm。 缩写：H&E = 苏木精和伊红。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：移植气管同种异体移植物在肺中的淋巴样聚集。 （A） 原位移植气管同种异体移植物的肺的 H&E 染色 图像。在肺组织内观察到淋巴聚集体（黑色箭头）。比例尺 = 500 μm。 （B） 淋巴聚集体的免疫荧光图像，突出显示 B 细胞（B220，红色）、T 细胞（CD3，绿色）和细胞核（DAPI，蓝色）的存在。比例尺 = 100 μm。 缩写： H&E = 苏木精和伊红;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
小鼠IPTT程序包括关键步骤。关于麻醉，第一个关键步骤是气管插管。必须将鼠标保持在适当的高度，双腿放在桌子上，以可视化声带并促进立即插管。此外，还需要仔细调整呼吸量和呼气末正压 （PEEP）。通常，500μL的呼吸容积和2cmH2O的PEEP足以使体重为25-30g的小鼠满意。然而，较大的受体小鼠可能会经历“打嗝”发作，表明缺氧。在这种情况下，可能需要增加呼吸量，PEEP，并暂时夹住呼气管以募集肺部。如果打嗝持续存在，应调整气管插管的深度。最后，气管插管拔管的时机至关重要，确认接受者的呼吸频率对于确保充分恢复至关重要。否则可能导致拔管后死亡。
在外科手术中，移植气管的正确放置至关重要。模拟适当的针头方向对于准确定位气管移植物是必要的（图3G）。如果路径太浅，气管移植物可能会穿透胸膜，而插入太深可能会导致肺血管穿孔和严重出血。另一个关键步骤是通过用不锈钢夹牢固地固定插入气管同种异体移植物的胸膜切口来确保插入点的准确密封（图3H）。密封不足会导致漏气，可能导致接受者在胸部闭合后死亡。
虽然 IPTT 模型具有一些优点，例如相对简单、高可重复性和类似于肺移植的免疫环境，但它确实存在一些局限性。IPTT 模型中的气管同种异体移植物与临床情况不同，其中 OB 发生在小气道中。此外，在这种主要组织相容性复合体 （MHC） 错配 IPTT 模型中，气管同种异体移植物完全被成纤维细胞组织闭塞，这与临床 OAD 形成鲜明对比，后者成纤维细胞组织闭塞通常是部分闭塞的。为了解决这个问题，另一种菌株组合（轻微或不同的主要错配）可用于 IPTT（取决于预期的研究），因为与 BALB/c-to-C57BL/6 组合相比，它可能导致更温和的同种免疫反应和更温和的成纤维细胞组织闭塞。我们不知道有任何已发表的研究检查不同的菌株组合，因此这种可能性需要通过经验进行测试。
最后，它是一种非血管化移植物，类似于 HTT 和 OTT 模型。为了解决这一局限性，可以使用原位肺移植 （OLT）14。然而，OAD样病理学的发展在小鼠OLT模型15,16,17中是可变的。鉴于 IPTT 模型与 OLT 相比相对简单且可重复性，它仍然是研究移植相关 OAD 机制的合理模型。总之，IPTT模型是研究肺移植后气道闭塞发展过程中涉及的肺内免疫和促纤维化途径的有用研究模型。
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Disclosures
本手稿的作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢杰罗姆·瓦莱罗（Jerome Valero）编辑了这份手稿。 图1 和 图3I，J，L 是用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cJ | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Donor |
| BD 1 mL Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide |
Becton Dickinson | 305122 | |
| Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture | Bovie | DEL1 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Recipient |
| Dumont #5/45 Forceps | F·S·T | 11251-35 | |
| Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers- | Ethicon | LX107 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | F·S·T | 11150-10 | |
| Glover Bulldog Clamp | Integra | 320-127 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | F·S·T | 13009-12 | |
| Horizon Titanium Ligating Clips | Teleflex | 001201 | |
| Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures | Leica | ||
| Magnetix Fixator with spring lock | CD+ LABS | ACD-001 | |
| Microsurgical Scissor | Jarit | 277-051 | |
| Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687 | Harvard | 55-0001 | |
| Perfadex Plus | XVIVO | 19850 | |
| Retractor Tip Blunt - 2.5 mm | CD+ LABS | ACD-011 | |
| small animal table | CD+ LABS | ACD-003 | |
| Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed | Covidien | VP702X | |
| Systane ointment | Alconn | 1444062 | |
| System Elastomer | CD+ LABS | ACD-007 | |
| Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in | Terumo Medical Corporation | SR-OX2025CA | |
| VMT table Top | benson | 91803300 |
References
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