In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

La somatosensazione, la codifica neurale di stimoli meccanici, termici e chimici che colpiscono la pelle o altre strutture corporee, inclusi muscoli, ossa e visceri, inizia con l'attività nei neuroni afferenti primari che innervano queste strutture¹. Gli approcci elettrofisiologici basati su singole unità hanno fornito una grande quantità di informazioni sui sottotipi afferenti coinvolti in questo processo e su come le loro proprietà stimolo-risposta possono cambiare nel tempo ^1,2,3. Tuttavia, mentre rimangono forti prove a sostegno della teoria della linea marcata, che suggerisce che specifiche modalità sensoriali sono veicolate da specifiche sottopopolazioni di neuroni, la capacità di molte sottopopolazioni di neuroni di rispondere agli stessi tipi di stimoli meccanici, termici e chimici suggerisce che la maggior parte degli stimoli somatosensoriali sono codificati da più sottopopolazioni di neuroni^{4, 5}. Introduzione Pertanto, una migliore comprensione della somatosensazione arriverà solo con la capacità di studiare l'attività di 10, se non centinaia, di neuroni contemporaneamente.

I progressi negli approcci ottici con l'avvento relativamente recente delle tecniche di imaging confocale e, successivamente, multifotone e digitale hanno facilitato la capacità di eseguire analisi relativamente non invasive a livello di popolazione dell'attività neuronale ^6,7. Uno degli ultimi ostacoli nell'applicazione di questa tecnologia è stato lo sviluppo di strumenti per consentire la valutazione ottica dell'attività neurale. Data la velocità di un potenziale d'azione che può iniziare e finire in meno di un millisecondo, un colorante sensibile al voltaggio con la capacità di seguire le variazioni del potenziale di membrana alla velocità di un potenziale d'azione sarebbe lo strumento ideale per questo scopo. Ma mentre ci sono stati enormi progressi in quest'area 7,8,9,10, il rapporto segnale-rumore per molti di questi coloranti non è ancora abbastanza alto da consentire un'analisi della popolazione di centinaia di neuroni a livello di singola cellula. Come approccio alternativo, i ricercatori si sono rivolti al monitoraggio dei cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). I limiti di questa strategia sono stati chiari fin dall'inizio e includono il fatto che un aumento di [Ca²⁺]_i è una misura indiretta dell'attività neurale¹¹; che un aumento di [Ca²⁺]_i può verificarsi indipendentemente dall'afflusso di Ca²⁺ associato all'attivazione dei canali Ca²⁺ voltaggio-dipendenti (VGCC)^12,13; che l'entità e la durata di un transitorio di Ca²⁺ possono essere controllate da processi indipendenti dall'attività del VGCC 11,12,14; e che il decorso temporale dei transitori di Ca²⁺ supera di gran lunga quello di un potenziale d'azione¹⁵. Tuttavia, ci sono una serie di vantaggi significativi associati all'uso di Ca²⁺ come misura indiretta dell'attività neurale. Non ultimo di questi è il rapporto segnale-rumore associato alla maggior parte degli indicatori di Ca²⁺, che riflette sia l'entità del cambiamento nel Ca²⁺ intracellulare che il fatto che il segnale proviene dallo spazio tridimensionale del citosol piuttosto che dallo spazio bidimensionale della membrana cellulare. Inoltre, con lo sviluppo di indicatori di Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI), è possibile sfruttare strategie genetiche per guidare l'espressione degli indicatori di Ca²⁺ in specifiche sottopopolazioni di cellule, facilitando le analisi a livello di popolazione in preparati intatti (ad esempio, vedi¹⁶).

Dato il numero di strumenti genetici ora disponibili nei topi, non dovrebbe sorprendere che i GECI siano stati utilizzati più ampiamente in questa specie. Sono state sviluppate linee murine con espressione GECI costitutiva in sottopopolazioni di neuroni sensoriali ^7,16,17. Con lo sviluppo di linee murine che esprimono ricombinasi in specifici tipi di cellule, è possibile utilizzare strategie ancora più sofisticate per controllare l'espressione di GECI¹⁵. Tuttavia, mentre questi strumenti sono sempre più potenti, ci sono una serie di ragioni per cui altre specie, come i ratti, potrebbero essere più appropriate per alcune domande sperimentali. Questi includono le dimensioni maggiori, che facilitano una serie di manipolazioni sperimentali che sono difficili, se non impossibili, nel topo più piccolo; la facilità di addestrare i ratti in compiti comportamentali relativamente complessi; e almeno alcune prove che le proprietà biofisiche e i modelli di espressione di diversi canali ionici nei neuroni sensoriali di ratto possono essere più simili a quelli osservati nei neuroni sensoriali umani di quanto non lo siano gli stessi canali nel topo rispetto a quelli umani¹⁸.

Mentre la trasduzione degli stimoli somatosensoriali avviene generalmente nei terminali periferici delle afferenze primarie, il potenziale d'azione avviato in periferia deve passare attraverso la struttura che ospita i somati afferenti primari, denominati gangli della radice dorsale (DRG) o trigemino (TG) prima di raggiungere il sistema nervoso centrale¹⁹. Mentre ci sono prove che non tutti i potenziali d'azione che si propagano lungo un assone afferente primario invaderanno il corpo cellulare²⁰, una conseguenza del fatto che i somati afferenti primari sono collegati all'assone afferente principale tramite una giunzione a T¹⁹, la maggior parte dei potenziali d'azione iniziati nella periferia sembrano invadere il soma²¹. Ciò conferisce tre vantaggi sperimentali quando si utilizzano GECI per valutare la codifica di popolazione nelle afferenze primarie: le grandi dimensioni del corpo cellulare rispetto agli assoni aumentano ulteriormente il rapporto segnale/rumore quando si utilizza [Ca²⁺]_i come misura indiretta dell'attività afferente; i DRG sono generalmente di facile accesso; E la valutazione dell'attività in un sito spazialmente lontano dai terminali afferenti riduce al minimo il potenziale impatto dell'intervento chirurgico necessario per esporre i gangli sulle proprietà stimolo-risposta dei terminali afferenti. Tuttavia, poiché i TG si trovano sotto il cervello (o sopra la tavolozza), sono molto più difficili da accedere rispetto ai DRG. Inoltre, mentre ci sono molte somiglianze tra i neuroni DRG e TG, c'è anche un elenco crescente di differenze. Ciò include l'organizzazione approssimativamente somatotopica dei neuroni nel TG²², strutture uniche innervate, diversi modelli di terminazione terminale centrale 23,24,25,26 e ora un elenco crescente di differenze sia nell'espressione genica^27,28 che nell'espressione funzionale del recettore²⁹. Inoltre, poiché siamo interessati all'identificazione dei meccanismi periferici del dolore, il numero relativamente elevato di sindromi dolorose che sembrano essere uniche per il sistema trigemino (ad esempio, emicrania, nevralgia del trigemino, sindrome della bocca urente) che sembrano coinvolgere un'attività aberrante nelle afferenze primarie 30,31,32, suggerisce che la TG deve essere studiata direttamente.

Così, mentre le proprietà stimolo-risposta dei neuroni TG sono state studiate con GECI nel topo¹⁶, perché le ragioni sopra elencate suggeriscono che il ratto potrebbe essere una specie più appropriata per affrontare una varietà di domande sperimentali, lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare un approccio per utilizzare i GECI per studiare i neuroni TG nel ratto. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un approccio virale per guidare l'espressione dei GECI GCaMP6 nel sistema nervoso periferico. Abbiamo quindi rimosso il prosencefalo per consentire l'accesso al TG. Infine, sono stati applicati stimoli meccanici e termici al viso mentre le risposte neuronali sono state valutate al microscopio a fluorescenza. Insieme, questi dati supportano un ruolo per l'utilizzo del ratto per studiare i cambiamenti nel TG in molti stati, ampliando il kit di strumenti per i ricercatori interessati alla codifica sensoriale nel sistema trigemino.

Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di animali nella ricerca sono stati eseguiti in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health e dall'International Association for the Study of Pain e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Pittsburgh (protocollo #22051100). Alla fine di ogni esperimento, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia tramite eutanasia con perfusione cardiaca di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS), un approccio approvato dall'American Veterinary Medical Association e dall'Università di Pittsburgh IACUC.

1. Induzione GCaMP

1. Ordina ratti Sprague Dawley in gravidanza in modo che i cuccioli possano essere iniettati al momento opportuno dopo la nascita.
2. Spruzzare i guanti con EtOH al 70% prima di maneggiare ogni cucciolo di ratto. Questo dissuaderà la diga dal cannibalizzare i giovani.
3. Tamponare i cuccioli di ratto (P1-2) con il 70% di EtOH e anestetizzare su ghiaccio per 3 min.
4. Iniettare 15 μL di AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) per via intraperitoneale utilizzando una siringa Hamilton sterile da 25 μL a tenuta di gas.

2. Chirurgia dell'esposizione del ganglio trigemino

1. Somministrare cocktail anestetico (55 mg/kg di ketamina, 5,5 mg/kg di xilazina, 1 mg/kg di acepromazina) per via intraperitoneale in base al peso corporeo a ratti di 6-8 settimane (circa 150-200 g).
   NOTA: Questo è generalmente sufficiente per mantenere un piano chirurgico di anestesia come valutato dall'assenza di un riflesso di astinenza al pizzico nocivo di una zampa posteriore. Tuttavia, integrare con isoflurano attraverso un cono nasale se gli animali diventano leggeri.
2. Una volta completamente anestetizzato, radere i capelli e i baffi della testa e del viso.
3. Montare il ratto su un telaio stereotassico con barre auricolari e posizionare un termoforo (~37 ^oC) sotto per mantenere la temperatura corporea.
4. Monitorare i segni vitali (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, saturazione di ossigeno nel sangue) con un ossimetro per topi o equivalente.
   NOTA: La temperatura corporea viene monitorata da una sonda rettale e mantenuta posizionando i ratti su una coperta d'acqua circolante controllata da feedback.
5. Metti una garza imbevuta di soluzione salina ghiacciata sulla testa per restringere i vasi sanguigni e ridurre al minimo il sanguinamento. Usando un bisturi misura 15, fai un'incisione sulla linea mediana della pelle e del muscolo sopra il cranio.
6. Usa la dissezione smussata della pelle e del muscolo per esporre il cranio.
7. Usando una punta da trapano rotonda da 1/4, perforare con cura la calotta cranica per esporre il prosencefalo. Quindi, usa i rongeur (coppa da 2,5 mm) per tagliare con cura il cranio.
8. Usando un bisturi misura 15, praticare un'incisione nel cervello (Bregma: -3,80) e nel bulbo olfattivo.
   NOTA: Tagliare più caudalmente oltre questo punto provocherà la morte del ratto
9. Usa una spatola per scollegare con cura la dura dal cranio e solleva delicatamente il cervello reciso per rivelare il TG e la base del cranio.
   NOTA: L'uso aggiuntivo della perfusione salina ghiacciata durante l'estrazione ridurrà al minimo lo spurgo e ottimizzerà il seguente campo di dissezione.
10. Utilizzando una penna per cauterizzazione, arginare eventuali emorragie derivanti dall'estrazione.
    NOTA: Il taglio della dura provocherà un inevitabile sanguinamento. È meglio preparare aCSF ghiacciato (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM di glucosio, 2,5 mM CaCl₂) per bagnare la cavità cranica per aiutare a restringere i vasi sanguigni mantenendo la salute neuronale.

3. Imaging GCaMP6s

NOTA: Date le dimensioni e la densità di questi neuroni, il sistema di imaging e acquisizione dati utilizzato (obiettivo, microscopio, sorgente luminosa, fotocamera) determinerà il numero di cellule GECI⁺ visualizzate. La sorgente luminosa, l'obiettivo e la fotocamera determineranno anche i parametri utilizzati per l'acquisizione dell'immagine, tra cui il tempo di esposizione e la velocità di acquisizione dell'immagine. Mentre le tecniche multifotone e confocali possono essere utilizzate a seconda dei parametri dell'esperimento, la microscopia a epifluorescenza può essere sufficiente per risolvere molte cellule. È possibile utilizzare qualsiasi pacchetto di acquisizione delle immagini. Idealmente, l'applicazione dello stimolo è bloccata nel tempo con il pacchetto software di acquisizione delle immagini.

1. Posiziona la cavità cranica sotto l'obiettivo e metti a fuoco il TG usando la luce visibile.
2. La lunghezza d'onda di eccitazione di GCaMP6s è di 496 nm e la sua lunghezza d'onda di emissione è di 513 nm; pertanto, utilizzare i cubi dicroici e di filtro appropriati per individuare le celle GCaMP⁺ . Regolare la messa a fuoco per individuare e risolvere l'area dei gangli in cui i neuroni rispondono agli stimoli applicati al campo recettivo di interesse.
3. Utilizzare un obiettivo 10x per consentire la visualizzazione della maggior parte dei neuroni nel TG che rispondono a stimoli meccanici applicati a una regione di 1 cm² del viso¹⁶. Utilizzare un obiettivo asciutto 20x con una lunga distanza di lavoro (10.8 mm) per aumentare la risoluzione.
4. Utilizzare un software di acquisizione (ad esempio, Metamorph) per raccogliere i dati di fluorescenza nel tempo e in risposta all'applicazione dello stimolo.
   1. Per ridurre al minimo il foto-sbiancamento dei neuroni, utilizzare il tempo di esposizione più breve possibile per rilevare gli aumenti di fluorescenza al basale e evocati. Con l'obiettivo in aria 20x, 0,40 NA, una sorgente luminosa ad alogenuri di mercurio da 120 W e una fotocamera CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) utilizzata nel presente studio, un tempo di esposizione di 300 ms e una velocità di acquisizione delle immagini di 3 Hz, si ottengono registrazioni di base stabili per >90 min.
      NOTA: 1) Questi parametri di acquisizione delle immagini devono essere determinati empiricamente. 2) Al campo recettivo possono essere applicati metodi meccanici (pennello, punteggiatura, vibrazione, pizzico), termici (caldo e freddo) e chimici (capsaicina, mentolo, mediatori infiammatori). Un approccio soggettivo relativamente poco costoso consiste nell'applicare gli stimoli a mano. Tuttavia, si raccomandano approcci più oggettivi e riproducibili, in cui gli attuatori controllati dal feedback possono essere utilizzati per applicazioni ripetute a una forza nota. Sebbene i dispositivi Peltier controllati dal feedback siano utili per il riscaldamento e il raffreddamento controllati, non sono ideali per la stimolazione termica di un viso curvo. Le sorgenti luminose a infrarossi controllate dal feedback sono un'alternativa per il riscaldamento e lo spray freddo è un'alternativa tutt'altro che ideale per il raffreddamento.

Poiché in precedenza abbiamo avuto successo con il sierotipo AAV9 per l'infezione dei neuroni sensoriali di ratto15, abbiamo usato questo sierotipo per l'espressione di GCaMP6 nei neuroni TG di ratto. Abbiamo quindi cercato di valutare l'efficienza dell'infezione da neuroni sensoriali di AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando questo virus è stato somministrato a cuccioli di rattoneonatale 20. Questo virus utilizza il promotore CAG, che guida e mantiene alti livelli di espressione genica. Inoltre, è stato dimostrato che AAV9 infetta efficacemente i neuroni sensoriali quando somministrato a ratti neonatali33. Le prime iniezioni hanno utilizzato 5 μL nei cuccioli postnatali al 5° giorno (p5), con un'efficienza di circa il 51,66% ± del 14,33% (Figura 1A). Per aumentare il tasso di infezione, alla fine abbiamo utilizzato un volume maggiore di virus (15 μL) nei ratti più giovani (p2), mantenendo lo stesso titolo virale di 2,4 x 1014 . Questa strategia ha portato al 91,84% ± al 3,18% (n = 8) dei neuroni infettati (Figura 1B).

Per visualizzare i neuroni TG che innervano il pad vibrissale, abbiamo successivamente sviluppato una strategia chirurgica per esporre i TG in vivo. Circa il 60% del prosencefalo può essere rimosso senza intaccare i principali centri respiratori. Ciò corrisponde al tessuto cerebrale rostrale a Bregma -3,80. Uno schema del TG esposto (a sinistra) e del territorio di innervazione del nervo infraorbitale (ION, a destra) è mostrato nella Figura 2. La regione del TG che dà origine all'innervazione del cuscinetto vibrissale è stata determinata con l'applicazione di una leggera stimolazione meccanica (spazzola) al cuscinetto vibrissale monitorando i cambiamenti di fluorescenza a 20x. Come previsto, la regione V2 del TG, che innerva la divisione mascellare del viso, era l'unica area attivata. Cioè, anche se non studiati sistematicamente, non sono stati rilevati cambiamenti nella fluorescenza in risposta agli stimoli applicati alle regioni V1 (pelle sulla fronte) o V3 (pelle sulla mandibola) quando i neuroni in studio potevano essere attivati con stimoli applicati al cuscinetto vibrissale. Sono stati quindi monitorati i cambiamenti nella fluorescenza al basale e in risposta agli stimoli applicati al pad vibrissale. La regione di interesse (V2) è delimitata nella Figura 3A. Coerentemente con i precedenti rapporti di livelli relativamente bassi di attività a riposo nei neuroni sensoriali34, la fluorescenza a riposo era relativamente bassa nella maggior parte dei neuroni e c'erano poche prove di aumenti spontanei della fluorescenza (Figura 3B). I criteri utilizzati per identificare l'attività evocata dallo stimolo nei neuroni della periferia 6,16,21 e del SNC 12,35,36 è un campo in evoluzione con diversi sofisticati pacchetti di flusso di lavoro che sono stati resi disponibili gratuitamente 37,38. Una discussione completa dei punti di forza e di debolezza dei vari approcci impiegati esula dallo scopo del presente manoscritto. Poiché questo non era l'obiettivo del presente studio, abbiamo utilizzato criteri relativamente arbitrari e soggettivi basati sulla risposta di picco osservata nelle regioni dei gangli in cui non c'erano neuroni chiaramente rilevabili (in base alla capacità di vedere il nucleo), in modo tale che un neurone fosse considerato reattivo a uno stimolo se l'aumento della fluorescenza era bloccato nel tempo rispetto all'applicazione dello stimolo (aumento della fluorescenza rilevato entro 1 s dall'applicazione dello stimolo ( sulla base dell'ipotesi che un potenziale d'azione iniziato negli assoni a conduzione più lenta (0,2 m/s) iniziato in un sito a non più di 3 cm dal corpo cellulare dovrebbe raggiungere il corpo cellulare in meno di un secondo) ed era >6 volte la deviazione standard della risposta di picco (ΔF/F) ha rilevato un sito di controllo (Figura 3C). Successivamente, abbiamo caratterizzato le proprietà di risposta di questi neuroni agli stimoli naturali: spazzola, punteggiatura, calore e freddo. Esempi di risposte a ciascuno di questi stimoli sono mostrati nella Figura 4. In particolare, la risposta alla stimolazione puntiforme, che viene spesso utilizzata negli studi sul dolore, ha la risposta più robusta (Figura 4B,F).

Il nostro obiettivo nello sviluppo di questa tecnica era quello di essere in grado di valutare i cambiamenti nella codifica della popolazione nei neuroni TG. Pertanto, abbiamo adattato la lesione da costrizione cronica allo ION (CCI-ION), come precedentemente impiegato29, per studiare i ratti 2 settimane dopo la lesione nervosa. A seguito dell'induzione del modello, abbiamo esposto il TG e valutato l'attività a riposo ed evocata nel TG omolaterale e controlaterale al sito di lesione. È interessante notare che l'entità della risposta evocata di picco allo spazzolino è aumentata di ~ 2 volte sul lato danneggiato dal nervo rispetto alla risposta di picco allo stesso stimolo applicato al lato controlaterale (Figura 5A-C). Inoltre, quando due stimoli a spazzola sono stati applicati in serie (con un intervallo tra gli stimoli di 10 s), c'è stata una significativa amplificazione dell'entità della risposta al secondo stimolo sul lato ferito ma non illeso (Figura 5D).

Infine, come esperimento di controllo iniziale per confermare che l'aumento della fluorescenza evocato dallo stimolo era dovuto ai potenziali d'azione avviati in periferia, abbiamo valutato l'impatto della tetrodotossina (1 μM) sulle risposte evocate dallo stimolo. TTX è stato iniettato in un volume di 200 μL per via percutanea come descritto in precedenza28 in modo da colpire il nervo infraorbitale. Come mostrato nella Figura 6, l'attività evocata è stata quasi completamente eliminata. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano l'utilità dell'utilizzo di AAV9-GCaMP per interrogare le risposte della popolazione TG in vivo.

Figura 1: Alta efficienza dell'infezione da GCaMP6s nei neuroni TG con iniezione neonatale di AAV. (A) I cuccioli di ratto P5 sono stati iniettati con 5 μL di virus pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titolo: 2,4 x 1014) per via intraperitoneale: l'espressione di GCaMP6s è stata rilevata nel 51,7 ± nel 14,3% dei neuroni TG (n = 3 fette per animale, 7 ratti). (B) L'aumento del volume di iniezione a 15 μL negli animali più giovani (p2) ha migliorato l'efficienza dell'infezione: l'espressione di GCaMP6s è stata rilevata nel 91,8 ± nel 3,2% dei neuroni TG (n = 3 fette per animale, 8 ratti). I pannelli a sinistra sono stati colorati per GCaMP6. I pannelli al centro sono stati colorati con NeuN, un marcatore neurone-specifico. I pannelli a destra sono un'immagine unita dei pannelli GCaMP6s e NeuN. La barra della scala nel primo pannello è la stessa per tutti i pannelli successivi. Il grafico a destra è un grafico dell'espressione di GCaMP6s (media ± SEM) come percentuale del numero totale di neuroni per fetta per animale, dove i singoli punti sono i dati per ogni animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Posizione del ganglio trigemino (TG), del nervo infraorbitale (ION) e dell'area del viso (cuscinetto vibrisale) stimolata. (A) Il prosencefalo è stato rimosso per consentire l'accesso al TG. (B) Area del viso in cui sono stati applicati stimoli naturali rispetto allo ION e al TG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Aumento della fluorescenza GCaMP6s evocato dallo stimolo. (A) Campo visivo totale con ingrandimento 20x. Sono indicate le divisioni oftalmiche (V1) e mascellari (V2) del TG. (B,C) La regione nel riquadro è mostrata nei pannelli B e C, che sono immagini di fluorescenza rispettivamente prima e dopo la stimolazione a spazzola del cuscinetto vibrissale. I cerchi bianchi sono regioni di interesse di confronto. I neuroni sono stati considerati responsivi a uno stimolo in base al picco di variazione della fluorescenza osservato nelle regioni di interesse del comparatore, come descritto nel testo. La barra della scala nel primo pannello è la stessa per entrambi i pannelli. (D) Cambiamenti rappresentativi nella fluorescenza dei neuroni mostrati in B e C in risposta a uno stimolo a pennello applicato al viso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Classificazione dei neuroni in base alla loro risposta agli stimoli applicati al viso. Immagini rappresentative dei neuroni TG prima (pannelli superiori - Basale) e dopo (pannello centrale - Stimolazione) delle risposte a una spazzola di pelo di cammello di 1 cm (A - Spazzola), 1 cm2 di griglia di monofilamenti (B - Punteggiatura), riscaldamento (C - Calore) e raffreddamento (D - Freddo) applicata alla stessa regione del viso. La barra della scala nel primo pannello è la stessa per tutti i pannelli successivi. I cerchi arancioni indicano un esempio di neurone reattivo. I cerchi bianchi sono regioni di interesse di confronto. (E-H) Tracce rappresentative di ogni risposta per stimolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: La lesione nervosa aumenta le risposte evocate dal pennello nei neuroni TG. Risposte tipiche dei neuroni TG allo spazzolino applicato due volte sul muso di ratto sul lato controlaterale di una lesione di costrizione cronica del nervo infraorbitale (A, Contro) o sul lato omolaterale alla lesione nervosa (B, Ipsi). (C) L'analisi dei dati aggregati provenienti da neuroni responsivi di sei ratti (i dati tracciati sono per ratto) ha confermato che la differenza nell'entità della prima risposta al pennello era significativa (test t accoppiato). (D) Quando la risposta di picco alla prima e alla seconda applicazione di stimolo è stata analizzata come rapporto (R2/R1), l'analisi dei dati aggregati ha confermato che l'aumento del rapporto di risposta sul lato nervoso era significativo. ** p < 0,01 Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Blocco dell'attività evocata nei neuroni TG con tetrodotossina (TTX). (A) Dati di fluorescenza da neuroni TG omolaterali a una lesione nervosa dopo iniezione di TTX (200 μL, 1 μM) adiacente al nervo infraorbitale in seguito all'applicazione di uno stimolo a spazzola (barra blu). (B) Dati aggregati di risposta al picco di tre ratti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il Dr. Gold stava ricevendo sovvenzioni da Grunenthal durante lo sviluppo di questa preparazione. Non c'è stata alcuna sovrapposizione tra il focus dello studio di Grunenthal e la preparazione descritta in questo manoscritto. Nessuno degli altri autori ha altri potenziali conflitti di interesse da rivelare.