Summary
Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.
Abstract
Hoewel de oprichting van een biobank voor eierstokkanker op basis van van patiënten afgeleide organoïden samen met hun klinische achtergrondinformatie vooruitgang in onderzoek en patiëntenzorg belooft, blijft standaardisatie een uitdaging vanwege de heterogeniteit van deze dodelijke maligniteit, gecombineerd met de inherente complexiteit van organoïdetechnologie. Dit aanpasbare protocol biedt een systematisch kader om het volledige potentieel van organoïden voor eierstokkanker te realiseren, rekening houdend met een patiëntspecifieke variabiliteit van voorlopercellen. Door een gestructureerde experimentele workflow te implementeren om optimale kweekomstandigheden en zaaimethoden te selecteren, met parallelle tests van direct 3D-zaaien versus een 2D/3D-route, verkrijgen we in de meeste gevallen robuuste uitbreidingslijnen voor de lange termijn die geschikt zijn voor een breed scala aan stroomafwaartse toepassingen.
Het protocol is met name getest en efficiënt gebleken in een groot aantal gevallen (N = 120) van zeer heterogeen uitgangsmateriaal, waaronder hooggradige en laaggradige eierstokkanker en stadia van de ziekte met primaire debulking, recidiverende ziekte en post-neoadjuvante chirurgische monsters. Binnen een exogene signaalomgeving met een laag Wnt en een hoge BMP zagen we dat voorlopercellen verschillend gevoelig waren voor de activering van de Heregulin 1 ß (HERß-1)-route, waarbij HERß-1 bij sommigen de vorming van organoïden bevorderde en bij anderen remde. Voor een subset van de monsters van de patiënt vereisen optimale organoïdevorming en groei op lange termijn de toevoeging van fibroblastgroeifactor 10 en R-Spondin 1 aan het medium.
Verder belichten we de cruciale stappen van weefselvertering en isolatie van voorlopercellen en wijzen we op voorbeelden waarbij korte kweek in 2D op plastic gunstig is voor de daaropvolgende vorming van organoïden in de Basement Membrane Extract type 2-matrix. Over het algemeen vereist een optimale biobanking het systematisch testen van alle belangrijke voorwaarden parallel om een geschikte groeiomgeving voor individuele lijnen te identificeren. Het protocol beschrijft ook de hanteringsprocedure voor efficiënte inbedding, doorsnede en kleuring om afbeeldingen met hoge resolutie van organoïden te verkrijgen, wat nodig is voor uitgebreide fenotypering.
Introduction
De klinische behandeling van patiënten met epitheliale eierstokkanker blijft een uitdaging vanwege de heterogene klinische presentatie in een vergevorderd stadium en de hoge recidiefpercentages1. Om ons begrip van de ontwikkeling en het biologische gedrag van eierstokkanker te verbeteren, zijn onderzoeksbenaderingen nodig die zich richten op de patiëntspecifieke variabiliteit in de loop van de ziekte, de respons op de behandeling en histopathologische en moleculaire kenmerken.
Biobanking, gekenmerkt door het systematisch verzamelen en langdurig bewaren van tumormonsters afkomstig van patiënten met eierstokkanker, samen met hun klinische informatie, biedt het behoud van een groot patiëntencohort in verschillende ziektestadia, inclusief tumormonsters van primaire debulking-operaties, na neoadjuvante chemotherapie en van terugkerende ziekte. Het heeft een waardevol potentieel voor het bevorderen van kankeronderzoek en dient als een bron van veelbelovende prognostische biomarkers en therapeutische doelen3. Conventionele biobankmethoden, zoals formalinefixatie en bevriezing, zijn echter niet geschikt voor het uitvoeren van functionele studies op de oorspronkelijke tumormonsters vanwege het verlies van levensvatbaarheid en de verstoring van de oorspronkelijke driedimensionale weefselarchitectuur 4,5.
Studies van moleculaire mechanismen, in de oncologie en daarbuiten, zijn in belangrijke mate afhankelijk van het gebruik van geschikte experimentele modellen die de biologie van de ziekte getrouw weergeven en de in vitro waargenomen eigenschappen van het in vivo waargenomen weefsel behouden. Patiënt-afgeleide organoïden, gebaseerd op het behoud van het vernieuwingspotentieel, reproduceren in het laboratorium de oorspronkelijke structuur en functie van het epitheel en maken testen in een patiëntspecifieke context mogelijk. Daarom zijn ze naar voren gekomen als veelbelovende hulpmiddelen voor kankeronderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde, waarbij de kloof tussen klinische diversiteit en laboratoriumonderzoek wordt overbrugd 6,7,8,9. Op maat gemaakte therapeutische strategieën op basis van individuele geneesmiddelresponsen van organoïdelijnen en het testen van de functionele relevantie van moleculaire profielen, kunnen mogelijk direct worden toegepast op patiëntenzorg10,11. De mogelijkheid van langdurige teelt, met inbegrip van patiëntspecifieke kenmerken en het verzamelen van relevante prospectieve klinische gegevens in de loop van de tijd, is veelbelovend voor het identificeren van nieuwe prognostische en voorspellende factoren die betrokken zijn bij ziekteprogressie en resistentiemechanismen 3,9.
Desalniettemin vereist het bouwen van een biobank met organoïden uit verschillende tumormonsters een combinatie van strikte naleving van complexe methodologie en het opzetten van protocollen voor eenvoudig onderhoud12. Processtandaardisatie zorgt ervoor dat de biobank efficiënt kan worden opgezet en onderhouden door opgeleid personeel, zelfs bij een hoog verloop, terwijl tegelijkertijd wordt voldaan aan de hoogste kwaliteitsnormen13. Verschillende studies rapporteerden de succesvolle generatie van stabiele organoïdelijnen voor eierstokkanker die overeenkomen met het mutatie- en fenotypische profiel van de oorspronkelijke tumor met verschillende efficiëntiepercentages. Toch blijft routinematig biobankieren in de praktijk een uitdaging, met name voor een stabiele groei van lijnen op lange termijn, wat een voorwaarde is voor grootschalige uitbreiding of succesvolle genomische bewerking.
Met name de kwestie van uitbreidbaarheid blijft vaag gedefinieerd in het veld, aangezien organoïden die een langzaam en beperkt groeipotentieel vertonen, af en toe als gevestigde lijnen worden geteld. Zoals aanvankelijk aangetoond door Hoffmann et al., een studie waarvan de belangrijkste bevindingen de basis vormden voor dit verder ontwikkelde protocol, vereist een optimale behandeling van eierstokkankerweefsel een unieke strategie om tegemoet te komen aan heterogeniteit14. Fenotypische karakterisering van de organoïden verkregen met deze methode en nauwe gelijkenis met ouderlijk tumorweefsel werden bevestigd door panel DNA-sequencing en transcriptomics-analyse van rijpe culturen (4-10 maanden cultivatie) die de stabiliteit van het model aantoonden 8,9,12,14.
In tegenstelling tot de paracriene omgeving die de homeostase in de gezonde eileiders reguleert, is de epitheellaag, die waarschijnlijk hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC), kankerregeneratiepotentieel en organoïdevormingscapaciteit oplevert, minder afhankelijk van exogene Wnt-suppletie. Bovendien bleek actieve botmorfogenetische proteïne (BMP)-signalering, gekenmerkt door de afwezigheid van Noggin in organoïdemedium, gunstig te zijn voor de vestiging van langetermijnculturen van vaste weefselafzettingen van eierstokkanker14,15. Tijdens het systematisch biobankieren van vaste afzettingen van eierstokkanker hebben we deze bevindingen bevestigd en de pijplijn opgezet, met details die in dit protocol worden beschreven en dat in de meeste gevallen een duurzame uitbreiding op lange termijn garandeert. We vinden dat het parallel testen van verschillende mediasamenstellingen en zaaimodaliteiten bij het werken met primaire isolaten essentieel is om de totstandbrenging van stabiele organoïdelijnen op lange termijn te verbeteren en de opbrengst te verhogen, waardoor robuuste vermeerdering en uitbreiding naar multi-well-formaten mogelijk wordt die nodig zijn voor stroomafwaartse experimenten16.
Bovendien zijn de zuiverheid en kwaliteit van de monsters die tijdens de operatie worden verzameld van cruciaal belang voor het translationele potentieel van organoïden voor eierstokkanker in fundamenteel onderzoek en moleculaire diagnostiek. De complexiteit van de klinische presentatie van HGSOC vereist nauwe samenwerking tussen de chirurgen, oncologen en de wetenschappers in het laboratorium om ervoor te zorgen dat relevant materiaal correct wordt geïdentificeerd, de transportomstandigheden constant worden gehouden en organoïdelijnen worden gegenereerd met een hoge efficiëntie die de belangrijkste kenmerken van de ziekte van elke patiënt vertegenwoordigen. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd maar aanpasbaar raamwerk om het volledige potentieel van eierstokkankerorganoïden vast te leggen, rekening houdend met de heterogeniteit die eierstokkanker kenmerkt16,17. Dit protocol maakt met name een betrouwbare biobank mogelijk van het brede spectrum van de klinische presentatie van eierstokkanker, inclusief verschillende histologische typen (hooggradige en laaggradige eierstokkanker, LGSOC), verschillende afzettingen van dezelfde patiënten die verschillen vertonen in stamregulatie, weefsels van operaties in post-neoadjuvante setting, biopsiemateriaal en monsters van operaties in de terugkerende fase van ziekteprogressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorweefselmonsters van eierstokkankeroperaties werden verzameld en van patiënten afgeleide organoïden werden gegenereerd in overeenstemming met de ethische commissie van LMU University (17-471), in overeenstemming met de bestaande toepasselijke EU-, nationale en lokale regelgeving. Elke patiënt die bij het onderzoek betrokken is, heeft schriftelijk toestemming gegeven. Bij het werken met verse weefselmonsters zijn Biosafety Level 2 veiligheidstoestemming en Laminar Flow kasten vereist. Gezien de potentieel besmettelijke aard van de weefselmonsters, die niet kan worden uitgesloten vanwege het ontbreken van routinematige tests van relevante infectieziekten, moet ervoor worden gezorgd dat de institutionele bioveiligheidsvoorschriften strikt worden nageleefd en dat er adequate persoonlijke beschermingsmiddelen beschikbaar zijn voor het personeel dat de experimenten uitvoert.
1. Voorbereidingen
- Medium voorbereiding
- Bereid de 2D- en 3D-media één keer per week vers voor en bewaar ze bij 4 °C.
OPMERKING: De exacte samenstelling van de ingrediënten voor elk medium staat vermeld in tabel 1. Zowel eierstokkanker medium 1 (OCM1) als OCM2 kunnen bovendien worden aangevuld met HER1ß (eindconcentratie: 50 ng/ml), wat resulteert in vier verschillende aandoeningen: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß. - Creëer voorraadoplossingen van de groeifactorreagentia en bewaar deze bij 20 °C en van A83-01 en nicotinamide (opslag bij +4 °C). Vanwege de temperatuurgevoeligheid van de groeifactoren, moet ontdooide voorraadoplossingen onmiddellijk worden gebruikt voor de mediumbereiding en herhaalde ontdooicycli worden vermeden door aliquots te maken.
OPMERKING: Mediavoorbereiding is een cruciale stap die strikt moet worden gecontroleerd. - Bereiding van RSPO-1 geconditioneerd medium
- Ontdooi HA-R-Spondin1-Fc 293 T-cellen (opslag bij -80 °C) snel bij 37 °C. Was ze met 10 ml basaal kweekmedium, aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), hierna basaal kweekmedium++ genoemd.
- Resuspendeer de celpellet in 12 ml basaalkweekmedium++ en zaai deze in een T75-kolf.
- Splits de cellen in een verhouding van 1:6 met een dissociatiereagens dat trypsine bevat (4 min bij 37 °C) wanneer de cellen samenvloeien. Zaai ze in een nieuwe T75-kolf.
- Voeg de volgende dag fleomycine D1 (1,25 μL/ml) toe aan het medium.
- Splits de cellen in een verhouding van 1:20 met trypsine (4 min bij 37 °C) wanneer de cellen samenvloeien. Zaai de cellen in meerdere T75-kolven (aantal kolven volgens het beoogde eindvolume) in 30 ml basaalkweekmedium++ (met 10 % FCS) aangevuld met fleomycine D1.
- Start de productie van geconditioneerde media wanneer de cellen ongeveer 50% van de samenvloeiing bereiken: vervang het medium door 40 ml basaalkweekmedium aangevuld met 5% FCS zonder fleomycine D1.
- Verzamel het eerste supernatans na 3 dagen. Om het vuil te verwijderen, centrifugeert u gedurende 10 minuten op 1.200 × g. Bewaar het supernatans in een steriele verpakking bij 4 °C.
- Voeg een nieuw basaalkweekmedium aangevuld met 5% FCS toe aan de cellen. Verzamel het tweede supernatans na 3-4 dagen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.200 × g. Voeg het tweede supernatans toe aan het eerste supernatant.
- Zeef het geconditioneerde medium met behulp van een flessendopfilter van 0,2 μm.
- Voor kwaliteitscontrole en RSPO1-kwantificering voegt u het geproduceerde medium toe aan een 293T-cellijn (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, stabiel getransduceerd met GFP-plasmide dragende Wnt-reporter18.
OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid en intensiteit van het GFP-signaal, wordt de activiteit van RSPO1 als agonist van de Wnt-route getest door de kwantificering van de Wnt-reportercellijn. - Bewaar aliquots van 15 ml voor onmiddellijk gebruik (binnen 1 week) bij 4 °C. Voor langere opslag (6 maanden) het geconditioneerde medium bij -20 °C bewaren.
- Bereid de 2D- en 3D-media één keer per week vers voor en bewaar ze bij 4 °C.
2. Initiatie van een organoïdekweek van eierstokkanker
- Primaire weefselisolatie
- Vers en levensvatbaar weefsel bij voorkeur direct na de operatie vervoeren en binnen maximaal 20 uur na afname isoleren. Zorg voor een goede transporttoestand in het weefselafnamemedium met een transportbox die is uitgerust met coldpacks bij ongeveer 4 °C.
- Bereid in het laboratorium de nodige reagentia en apparatuur voor om een tijdige monsterverwerking mogelijk te maken:
- Ontdooi Basement Membrane Extract Type II matrix (BME 2 matrix) op ijs (ongeveer 2 uur).
- Bereid wegwerpscalpels, gesteriliseerde dissectiegereedschappen (scharen en pincetten) en filterinzetstukken van 400 μm voor op buisjes van 50 ml.
- Bereid een bak met een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof voor op snel invriezen en een voorverwarmd waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Werk binnen een laminaire stroomkap voor celkweek.
- Was het verse weefsel in een petrischaaltje grondig in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (zonder Ca++ en Mg++). Fragmenteer het weefsel in de petrischaal met behulp van de wegwerpscalpels en/of schaar in kleine stukjes van 3-5 mm.
- Scheid het verkregen weefsel in drie secties voor de volgende doeleinden:
- Verzamel weefsel in cryogene buisjes. Breng de cryogene buisjes over in de voorbereide container gevuld met vloeibare stikstof voor schokbevriezing.
- Verzamel weefsel (2-3 mm) in een histologische monstercontainer gevuld met formaline voor fixatie (24 uur) en plaats ze in paraffine voor kleuringsdoeleinden19,20.
- Homogeniseer verder het weefsel vóór enzymatische vertering. Maximaliseer de mechanische dissociatie met een scalpel en breng deze over in een weefselbuis van 50 ml.
NOTITIE: Zorg ervoor dat het weefsel tijdens het homogeniseren altijd in PBS is gedrenkt om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
- Combineer het gehomogeniseerde weefsel met een verteringsmengsel dat PBS (zonder Ca++ en Mg++), collagenase I (stockoplossing 5 E/μL, eindconcentratie 1 E/μL) en een selectieve ROCK1- en 2-remmer (eindconcentratie van 3 μM) bevat (componenten vermeld in tabel 1). Gebruik 15 ml verteringsmengsel in een buisje van 50 ml voor elke 2cm3 van de tumor.
OPMERKING: Beperkt materiaal (bijv. biopsiemonsters) vereist slechts kleine hoeveelheden (ongeveer 2-3 ml) digestiemengsel om enzymatische dissociatie te garanderen. - Voor enzymatische dissociatie de buis gedurende 1,5 uur incuberen in een waterbad van 37 °C. Voer sporadische en krachtige vortexen uit (ongeveer elke 20 minuten gedurende 10-15 s) om mechanische dissociatie te ondersteunen.
- Voeg na incubatie 15 ml koud basaalkweekmedium++ toe aan de buis. Centrifugeer 5 minuten op 300 × g.
- Voeg na het verwijderen van het supernatant 5 ml nieuw basaalkweekmedium++ toe. Zeef de celsuspensie met behulp van een filter van 400 μm in een vers buisje van 50 ml.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g. Verwijder het supernatans en bewaar de celkorrel.
- Voeg voor het verwijderen van erytrocyten 5 ml Red Blood Cell Lysing (RBC) Buffer toe aan de celkorrel. Incubeer in een waterbad gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voeg 5 ml basaalkweekmedium++ toe voor lysisinactivering. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g. Voeg 3 ml basaalkweekmedium++ toe aan de celkorrel.
- Tel levensvatbare cellen na 1:1 verdunning met trypanblauwe kleuroplossing (bijv. 10 μL van het monster + 10 μL trypanblauwe kleuroplossing) in een automatische cellenteller of handmatig in een Neubauer-kamer.
- Bereken het aantal cellen dat nodig is voor direct 3D-zaaien. Zaai voor elke tumorafzetting in een plaat met 48 putjes ten minste 2-3 putjes per ovariumkankermedium, wat overeenkomt met een totaal van 8-12 putjes in een zaaimatrix (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Bereken 30.000 cellen voor elk putje in een druppel van 25 μL BME Type 2-matrix. Kies optioneel voor een formaat met 24 putjes met 50 μL BME 2-matrix en 50.000 zaadcellen per putje.
- Zaai de resterende cellen in 2D (zie stap 2.1.13).
- Pipetteer de hoeveelheid basaalkweekmedium++ suspensie die het totale aantal benodigde cellen bevat in een nieuwe buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g. Verwijder het supernatans en bewaar de celkorrel.
- Voeg op het ijs de totale hoeveelheid koude BME 2-matrix (25 μL voor elk putje in een plaat met 48 putjes; dus 100 μL voor 4 putjes) toe aan de pellet en meng goed om een gelijkmatige verdeling van cellen per putje te bereiken door de pellet voorzichtig op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.
- Zaai de cellen in druppeltjes BME 2-matrix (25 μL) op de voorverwarmde, lege plaat met 48 putjes. Om een gelijkmatige verdeling tussen de putjes te bereiken, beweegt u de pipet voorzichtig en langzaam op en neer (3-4x) in de buis voordat u de BME 2-matrixdruppel in elk putje overbrengt om celneerslag tijdens de distributie te voorkomen.
- Na het incuberen van de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten om de druppeltjes van de BME 2-matrix te consolideren, pipetteert u 250 μL van elk van de vier eierstokkankermedia (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) in de overeenkomstige putjes.
- Parallel aan de directe 3D-zaaiprocedure, bewaart u de resterende geïsoleerde cellen door een 2D-kweek te starten.
- Voeg na 5 minuten centrifugeren bij 300 × g de pellet toe aan het 2D-medium. Selecteer het formaat (T75-kolf of T25-kolf), afhankelijk van het aantal cellen dat beschikbaar is na 3D-zaaien.
- Incubeer de kolf gedurende 3-5 dagen bij 37 °C voor celhechting. Houd de eerste 72 uur hetzelfde medium aan.
- Wanneer de cellen samenvloeien, breng je de kweek over naar de BME 2-matrix. Breid primaire isolaten in 2D-cultuur niet uit door te splitsen, aangezien langdurige vermeerdering op 2D schadelijk is voor het stamheidspotentieel.
- Overdracht van 2D-cultuur naar 3D-cultuur
- Was in de T75- of T25-kolf de monolaag 2x met 5 ml PBS om de cellen los te maken van het bodemoppervlak. Incubeer met 1 ml trypsine gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Voeg 5 ml koud basaalkweekmedium++ toe voor inactivering van het dissociatiereagens. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g.
- Voeg 3 ml basaalkweekmedium++ toe aan de pellet. Tel de cellen zoals beschreven in de stappen 2.1.12-2.1.13. Zaad voor de verschillende mediasamenstellingen (zie figuur 1) zoals beschreven in de stappen 2.1.16-2.1.18.
- Evaluatie van de groei van organoïden
- Breng de putten minstens één keer per week in beeld om de groei van organoïden te documenteren. Maak hoogwaardige vergelijkbare beelden van 2D/3D-cultuur en directe zaaiplaten met een fasecontrastmicroscoop. Zorg voor consistentie in vergroting en gebruik 4x voor een overzicht van de putjes (kwantificering) en 10x en 20x om de morfologie van organoïden te documenteren.
- Organiseer de opslag van afbeeldingen in mappen die zijn gewijd aan afzonderlijke regels.
- Selecteer de beste organoïdelijn voor langdurige teelt door vergelijkende beoordeling van organoïdevorming bij de verschillende zaaimodaliteiten (2D gevolgd door 3D-zaaien versus direct 3D-zaaien) en verschillende mediasamenstellingen (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 en OCM2+ HER1ß).
- Evalueer gemiddeld 14-21 dagen na isolatie het organoïdevormend potentieel (hoeveelheid) en de grootte en het cellulaire fenotype van organoïden die onder verschillende omstandigheden worden gekweekt. Let op de volgende kenmerken: afwezigheid van vacuolen, membraanblebbing of verlies van adhesie, en afronding van cellen.
3. Organische oïdenteelt op lange termijn
- Organoïde passaging
- Vermijd het te vaak splitsen van organoïden en tijdens de proliferatieve fase. Voer mechanische en enzymatische verteringsprocedures uit met tussenpozen van meer dan 10 dagen.
- Om elke BME 2-matrixdruppel te verstoren, voegt u 250 μL (48-wells-formaat) of 500 μL (24-wells-formaat) ijskoud basaalkweekmedium++ toe. Zorg ervoor dat de druppel en pipet met tussenpozen op en neer volledig oplossen en schraap de bodem van de plaat. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en plaats deze op ijs. Voeg 1 ml ijskoud basaalkweekmedium++ toe.
OPMERKING: De verwijderingsefficiëntie van de BME 2-matrix is sterk afhankelijk van de mediumtemperatuur, aangezien de beste oplossing wordt bereikt onder 4 °C. - Pool 2-3 technische repliceerputten voor gelijkmatige uitbreiding. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g. Inspecteer de inhoud van de suspensie ten opzichte van de lichtbron om te zien of de BME 2-gel nog zichtbaar is. Verwijder het supernatans en herhaal het wassen met een ijskoud medium als de BME 2-matrix nog zichtbaar is.
- Incubeer met 1 ml trypsine (bewaard bij 20-25 °C) in een waterbad van 37 °C gedurende 7-10 minuten. Vortex sporadisch gedurende 10 s om dissociatie te verbeteren. Inspecteer de buis regelmatig visueel om te zien of de dissociatie vordert.
- Trek de celsuspensie op en neer met een spuit door een naald met een grootte variërend van 23 G tot 27 G. Controleer of er nog grote celklonten aanwezig zijn en herhaal de procedure indien nodig.
OPMERKING: Fragmentatie via een spuit is optioneel en de naalddikte is afhankelijk van de vereiste dissociatie-efficiëntie. Een homogene celsuspensie leidt tot een gelijkmatige verdeling over de putjes. - Voeg 1 ml koud basaalkweekmedium++ toe om de reactie te inactiveren.
- OPTIONEEL: Tel de cellen zoals beschreven in de stappen 2.1.12-2.1.13 en bepaal de splitsingsverhouding ten opzichte van de ouderlijke doorgang (bijv. 1:3 putjes).
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g. Verwijder het supernatant.
- Voer het zaaien uit zoals beschreven in de stappen 2.1.16-2.1.18 en breng het respectieve optimale organoïdemedium voor eierstokkanker aan volgens de reeds gevestigde langetermijnkweek. Vervang het eierstokkankermedium elke 3-4 dagen.
- In geval van verstoring van de BME 2-matrixdruppel tijdens de mediumverandering, overweeg dan opnieuw in te zaaien zonder enzymatische vertering. Om verstoring van de druppel te voorkomen, voert u de mediumwisselprocedure zorgvuldig uit zonder direct pipetteren op de BME 2-matrixdruppel. Laat bovendien geen overmatige hoeveelheid resterend basaalkweekmedium++ op de pellet achter voordat deze wordt verdund met de BME 2-matrix in stap 2.1.16, omdat dit de kwetsbaarheid van de druppels kan beïnvloeden.
- Cryopreservatie van organoïden
OPMERKING: Voer cryopreservatie van de organoïden uit tijdens de proliferatiefase in de eerste week na passage.- Verstoor de BME 2 matrixdruppel met ijskoud basale kweekmedium++ volgens stap 3.1.2. Na het centrifugeren en het weggooien van het supernatans zoals beschreven in stap 3.1.3., op ijs werken en de celpellet resuspenderen in 1 ml ijskoud cryopreservatiemedium. Breng de celsuspensie over in vooraf gelabelde cryogene buisjes van 1,8 ml.
- Bewaar de buisjes in een voorgekoelde isopropylalcoholhoudende vriescontainer en plaats ze een nacht bij -80 °C.
- Bewaar de voorraadbuizen maximaal 2 maanden bij -80 °C. Overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige stabiele opslag.
- Ontdooien van organoïdevoorraden
- Verwarm 9 ml basaalkweekmedium++ voor in een waterbad van 37 °C in een gelabelde buis van 15 ml.
- Breng de gewenste voorraadflacon over van de opslag bij -80 °C of vloeibare stikstof in een transportcontainer gevuld met vloeibare stikstof.
- Breng de cryobuis over naar een waterbad van 37 °C en schud deze voorzichtig totdat het bevroren materiaal bij de wanden van de buis begint te ontdooien.
- Verdeel de organoïdussuspensie langzaam in de geëtiketteerde buis gevuld met 9 ml medium. Schud de buis voorzichtig. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g en verwijder het supernatant.
- Voer het zaaien uit zoals beschreven in de stappen 2.1.16-2.1.18 en breng het respectieve optimale organoïdemedium voor eierstokkanker aan volgens de reeds bepaalde kweekomstandigheden op lange termijn voor de afzonderlijke lijn.
- Fixatie van organoïden
- Voer het verzamelen van organoïden uit zoals beschreven in de stappen 3.1.2-3.1.3.
- Voeg 3 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan PBS (pH 7,4) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was 2x met 5 ml PBS, centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g en verwijder het supernatant. Voeg 4 ml verse PBS toe aan de pellet en houd deze op 4 °C tot het inbedden.
OPMERKING: Vaste organoïden zijn stabiel en opslag bij 4 °C is mogelijk gedurende 1 maand voordat ze worden ingebed. - Verwarm de histologische gel (bewaard bij -20 °C) bij 65 °C tot deze vloeibaar is.
- Detecteer de vaste organoïden die zich op de bodem van de buis hebben gevestigd en zichtbaar zijn. Verwijder het supernatant. In het geval van een verstoorde celpellet, centrifugeren gedurende 3 minuten bij 300 × g en het supernatans PBS weggooien.
- Suspendeer de pellet in 100 μL warme gel door zachtjes op en neer te pipetteren. Breng de druppel over op een stuk afdichtingsfolie en laat stollen na ~15 minuten bij kamertemperatuur.
- Verplaats de vaste geldruppel naar de weefselparaffinecassette. Voer standaard weefselinbeddingsprotocollenuit 19,20.
- Snijd plakjes van 5-10 μm dik met een snijgereedschap voor microsecties. Breng de sneden over op histologieglaasjes. Droog de objectglaasjes gedurende 1 uur bij 65 °C; Bewaar ze op een droge plaats.
- Immunofluorescentiekleuring van organoïde secties
- Verplaats de voorbereide objectglaasjes door glazen trays met de volgende verdunningsreeks: 2 x 15 min klaringsmiddel voor histologie; 15 min 100% ethanol; 1 min 100% ethanol; 10 min 96% ethanol; 5 min 70% ethanol; 5 min 50% ethanol.
- Voeg PBS toe en houd 5 minuten op de shaker op 100 tpm. Herhaal de was 2x.
- Voeg een antigeenoplossing (Tris(hydroxymethyl)aminomethaan-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-buffer [pH 9.0] of citraat [pH 6.0]) toe aan de objectglaasjes die in de thermostabiele kamer worden geplaatst. Bewaar de container met de glaasjes 30 minuten in een stomer, gevolgd door afkoelen tot kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.5.2.
- Breng de kamer met de objectglaasjes gedurende 15 minuten over in een 1% permeabilisatie-wasmiddeloplossing (in PBS).
- Herhaal stap 3.5.2.
- Contour de locatie van organoïden op de objectglaasjes met een immunokleurende waspen om de druppel tijdens de volgende stappen te behouden.
- Voeg op elk glaasje 100 μL 10% serum toe in een verdunningsmedium, afhankelijk van de soort van het secundaire antilichaam.
- Herhaal stap 3.5.2.
- Verdun de primaire antilichamen in een medium, wat leidt tot een eindvolume van 100 μL. Bewaren bij 4 °C gedurende ten minste 16 uur in een incubatiebak/vochtigheidskamer.
- Herhaal stap 3.5.2.
- Verdun de secundaire antilichamen in een medium, wat leidt tot druppeltjes van 100 μL, en bewaar gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in een incubatiebak.
- Herhaal stap 3.5.2.
- Voeg nucleaire tegenvlekoplossing DAPI (4',6-diamidine-2-fenylindol, dihydrochloride) verdund in een verdunningsmedium 1:1,000 toe. 10 minuten bewaren bij kamertemperatuur voor incubatie.
- Herhaal stap 3.5.2.
- Voeg montagemedium toe en dek af met het dekglaasje. Zet de glaasjes na droging vast met transparante nagellak (ongeveer na 8-12 uur).
- Beeld met een confocale microscoop of andere fluorescentiemicroscoop. Maak overzichtsfoto's en gedetailleerde afbeeldingen van subcellulaire structuren die de belangrijkste kenmerken van organoïdemorfologie vastleggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de eerste weefseldissociatie, filtratie en telling worden cellen parallel direct in 3D-formaat gezaaid, zoals hierboven uitgelegd, evenals de suspensie in de kolf voor korte 2D-expansie. In sommige gevallen heeft de voorbijgaande 2D-expansie een positieve invloed op de organoïdevorming en wordt de langetermijnlijn via deze route met succes tot stand gebracht, terwijl vergelijkende parallelle 3D-zaaiing kan leiden tot groeistilstand (Figuur 1). Voor elk donorweefsel dat wordt verwerkt, worden de cellen getest volgens de mediamatrix. In navolging van deze strategie bevat onze biobank nu lijnen die representatief zijn voor elke standaard groeiconditie, zoals weergegeven in figuur 2. Door strikte implementatie van dit mini-screeningplatform voor het testen van verschillende media en manieren van zaaien, hebben we met succes organoïdelijnen gegenereerd van verschillende histologische typen en stadia van ziekteontwikkeling van eierstokkanker (Figuur 3) van primaire hooggradige sereuze, post-neoadjuvante intervaloperaties en van recidiverende ziekte. Fenotypische karakterisering van de organoïdelijnen door immunofluorescentiekleuring van hoofdmarkers in vergelijking met ouderweefsel toont overtuigend aan dat kenmerken van het epitheliale tumorcompartiment behouden blijven in het organoïdemodel: epitheliale architectuur en adhesie gemarkeerd door (EpCAM), afstammingsidentiteit (PAX8) en typische TP53-puntmutatie die kenmerkend is voor HGSOC die leidt tot accumulatie in de kern (Figuur 4).
Er moet ook rekening worden gehouden met enkele belangrijke methodologische punten voor een efficiënte besluitvorming tijdens organoïde-biobanking. Het groeipotentieel van organoïden wordt niet alleen bepaald door de toename van de organoïdediameter. Bovendien bepalen fenotypische kenmerken expansiepotentiaal zoals kleur, duisternis en contourintegriteit. De vorming van cytoplasmatische stressvacuolen duidt op suboptimale omstandigheden. Aanvankelijke problemen met betrekking tot groei en organoïdevormingspotentieel kunnen optreden als gevolg van ongeschikte transportomstandigheden en vertraging van weefselprocessie. Aangezien er een hoge interindividuele variabiliteit in expansiepotentiaal wordt waargenomen binnen de tumorlijnen, raden we aan om ten minste 14 dagen te wachten voordat u een definitieve beslissing neemt over het groeipotentieel. Als in eerste instantie vergelijkbare groeipatronen worden waargenomen in verschillende media, moeten meerdere aandoeningen worden uitgebreid. Uit onze ervaring blijkt dat een duidelijk onderscheid tussen stabiel groeipotentieel op lange termijn vaak pas mogelijk is na een teelt van enkele weken of maanden.
Figuur 1: Voordelen van kort zaaien in 2D van primaire isolaten voor latere organoïdegeneratie. (A) Schema van de experimentele lay-out met een tweerichtingsstrategie voor parallel zaaien: 2D/3D en direct 3D-zaaien in vier verschillende media. (B) Beeld van aanhangende primaire isolaten vóór trypsinisatie en 3D-overdracht. (C) Een voorbeeld van de primaire afzetting waarbij parallel zaaien het duidelijke voordeel van de 2D/3D-route aan het licht bracht, aangezien expansie van organoïden op lange termijn alleen mogelijk was met voorlopercellen die aanvankelijk op plastic waren geïsoleerd. De afbeelding linksboven toont een 3D-cultuur 7 dagen na isolatie bij passage 0 (aangeduid als P0) met onvoldoende organoïdevorming na de eerste passage (aangeduid als P1) op de afbeelding linksonder. Na 2D-zaaien op plastic (zie figuur 1B) gevolgd door overdracht naar een 3D-cultuur, is een betere organoïdevorming al zichtbaar bij P0, terwijl het expansiepotentieel op lange termijn wordt bevestigd bij passage 4 (P4). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Patiëntspecifieke mediumbehoefte. Voorbeelden van vier verschillende stabiele expansielijnen op lange termijn, elk in een ander medium. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: OCM = ovarian cancer medium; her = heregulin 1β; HGSO = hooggradige sereuze eierstokkanker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Organoïdevorming uit alle stadia van de ziekte. Beelden van stabiele expansielijnen op lange termijn, van hooggradige sereuze en laaggradige sereuze eierstokkanker in primaire ziektepresentatie, van intervalchirurgie (postneoadjuvante chemotherapie) en van recidiverend kankerweefsel. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: HGSOC = hooggradige sereuze eierstokkanker; LGSOC = laaggradige sereuze eierstokkanker; NACT = neoadjuvante chemotherapie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Nauwe overeenkomst tussen het fenotype van organoïden en ouderlijk kankerweefsel. Confocale beelden van immunofluorescentiekleuring van (A) kankerweefsel en (B) gepaarde organoïdelijn vertonen een zeer hoge gelijkenis in kleuringspatroon en expressieniveau van alle markers, EpCAM (groen), PAX8 (rood), TP53 (magenta). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van het medium en het digestiemengsel dat in dit protocol wordt gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontworpen protocol pakt eerdere uitdagingen aan van de biobanking van eierstokkankerorganoïden met betrekking tot organoïdevorming en doorgangspotentieel op lange termijn en zorgt voor het genereren van volledig uitbreidbare lijnen uit de meeste solide tumorafzettingen. Het chirurgische verzamelproces van tumormonsters die worden gebruikt voor het genereren van organoïden heeft een aanzienlijke invloed op de opbrengst en het uitbreidingspotentieel. Tumorweefselmonsters kunnen worden verkregen tijdens verschillende procedures, waaronder multiviscerale chirurgie, diagnostische laparoscopie of biopsie. De ervaren gynaeco-oncologische chirurg moet prioriteit geven aan het verkrijgen van schone tumormonsters van peritoneale locaties. Er is met name waargenomen dat macroscopisch necrotische gebieden binnen grote tumorafzettingen minder geschikt zijn voor het succesvol genereren van organoïdeculturen. Aangezien de zuiverheid van het monster cruciaal is om moleculaire en fenotypische kenmerken voor stroomafwaartse toepassingen weer te geven, zijn gesynchroniseerde inspanningen van zowel de klinische als de laboratoriumteams vereist voor een optimale biobanking, zodat de lijnen worden gemaakt vanuit de meest relevante regio's van de tumor.
Hoewel dit protocol betrekking heeft op variaties in groeifactorafhankelijkheden die we hebben waargenomen tijdens 2 jaar biobankieren, is het duidelijk dat aanvullende verfijning gerechtvaardigd is om de werkzaamheid verder te verhogen, aangezien we in 20% van de gevallen nog steeds geen organoïdegroei hebben waargenomen en het aantal lijnen dat een beperkt expansiepotentieel vertoonde, suggereerde suboptimaal behoud van de stamheid. Hoewel onze organoïde-biobank momenteel alleen eierstokkankermonsters van sereuze histologie (HGSOC en LGSOC) bevat, vertoonde onze ervaring met monsters van verschillende epitheliale eierstokkankerhistologieën voorafgaand aan het gestructureerde biobanking-programma vergelijkbare slagingspercentages zonder specifieke verschillen. Met name de meerderheid van de subtypes van epitheliale eierstokkanker delen een vergelijkbare kolomvormige pseudogestratificeerde morfologie met weefsels die zich hebben ontwikkeld uit het Mulleriaan-kanaal (eileider, baarmoeder, baarmoederhals), terwijl daarentegen het eierstokepitheel zelf ontwikkelingsgericht afkomstig is van de genitale kam en mesonefros en bedekt is met een enkele laag kubusvormig epitheel. Aangezien ontwikkelingstrajecten die epitheliale homeostase reguleren een centrale rol spelen bij de controle van het potentieel van volwassen stamcellen, moet rekening worden gehouden met de verschillen in embryonale oorsprong bij het ontwikkelen van protocollen voor biobankieren van organoïden. Daarom zijn we van mening dat voorlopercellen van het oppervlak van de eierstok waarschijnlijk orgaanspecifieke kweekomstandigheden nodig hebben om een stabiele groei op lange termijn te ondersteunen.
Met name in ons laboratorium is het protocol ook succesvol gebleken voor post-neoadjuvante eierstokkankermonsters, hoewel de neoadjuvante chemotherapie de levensvatbaarheid van de cel en het weefselfenotype beïnvloedt. Deze monsters vertonen meer puin en extracellulaire weefselaggregaten in vergelijking met monsters die afkomstig zijn van chemotherapie-naïef weefsel van primaire debulking-operaties die het organoïdevormingspotentieel kunnen beïnvloeden. In deze gevallen hebben we ervaren dat een geschikte hoeveelheid chirurgisch weefsel en strikte naleving van de aanbevolen transportomstandigheden cruciaal zijn voor een succesvolle generatie van organoïden, aangezien de post-neoadjuvante monsters gevoeliger kunnen zijn.
Een zeer interessant fenomeen van het gunstige effect van korte expansie op plastic in 2D van vers geïsoleerde voorlopercellen op de daaropvolgende groei van organoïden, dat we herhaaldelijk hebben waargenomen en daarom hebben opgenomen in de gestandaardiseerde experimentele procedure, is een belangrijke aanvulling op de methodologie van het onderzoeksveld van kankerorganoïden, dat grotendeels afhankelijk is van directe zaaistrategieën. Het is verleidelijk om te speculeren dat de gevoeligheid van voorlopers na enzymatische vertering en het vermogen van groeifactoren om ze adequaat te primen, de onderliggende mechanismen achter dit verschil zouden kunnen zijn, wat in sommige gevallen een doorslaggevende factor is als de lijn kan worden vastgesteld. Er is echter meer onderzoek nodig om duidelijke afhankelijkheden vast te stellen.
Bij het aangaan van de uitdagingen die worden gesteld door hoge celadhesie en functionele verbindingen in 3D-eierstokkankerorganoïden, die moeilijk te verteren zijn, kan een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie met naald en spuit helpen wanneer er grote klonten overblijven na trypsinisatie. Experimenteren met verschillende enzymatische condities zou tot verdere verbeteringen kunnen leiden.
Na langdurige opslag kunnen organoïdelijnen worden ontdooid en volgens het experimentele ontwerp in cultuur worden gebracht en voor latere toepassingen worden gebruikt. Dit maakt het mogelijk om op elk moment toegang te krijgen tot reeds gegenereerde organoïdelijnen voor specifieke onderzoeksdoeleinden en is met name interessant voor het onderzoeken van het langetermijngedrag van bepaalde lijnen in het licht van de ziekteprogressie van de patiënt. Cryopreservatie van organoïden van eierstokkanker blijft echter een uitdaging. Temperatuurschommelingen tijdens vries- en dooicycli kunnen een negatieve invloed hebben op de levensvatbaarheid, functionaliteit en expansiemogelijkheden van organoïden. Langdurige opslag is stabieler in vloeibare stikstof, waar zeer lage temperaturen het risico op afbraak minimaliseren, zodat de integriteit van de organoïden kan worden behouden. Voortdurende optimalisatie is echter gerechtvaardigd om consistente procedures voor invriezen, opslag en ontdooien vast te stellen, om deze processen verder te verbeteren.
Ondanks de genoemde openstaande problemen, toont dit protocol het vermogen aan om consequent stabiele organoïdelijnen te genereren uit solide tumormonsters van patiënten met eierstokkanker. In ons laboratorium hebben we tot op heden 120 primaire weefselmonsters van eierstokkanker verwerkt, waarbij we in ongeveer 50% van de gevallen succes boekten, waaronder een breed scala aan histologische subtypes en stadia van de ziekte met primaire debulking, recidiverende ziekte en postneoadjuvante chirurgische monsters. Door een gestructureerd raamwerk te bieden voor het genereren van organoïden afgeleid van verschillende patiëntmonsters, parallel zaaien in verschillende media en implementatie van verschillende zaaistrategieën, biedt dit protocol de mogelijkheid om individuele verschillen in stampotentieel te beoordelen, waardoor aanvullende informatie wordt verstrekt over tumorbiologie. Voor zover wij weten, volgt de overgrote meerderheid van de onderzoeken meestal de omgekeerde benadering van het testen van de mediumcomponenten op een klein aantal monsters en het kiezen van voor eenvoud meestal één optimaal medium. Onze systematische tests van het effect van HER1ß, het effect van RSPO1- en FGF10-suppletie en 2D/3D-zaaien tonen onomstotelijk aan dat eierstokkankerweefsel een zekere mate van variabiliteit tussen patiënten heeft in stameigenschappen, en dat het optimale medium inderdaad patiëntspecifiek is. Daarom is het systematisch parallel testen van verschillende mediasamenstellingen die verschillende exogene paracriene signaleringsomgevingen bieden, essentieel.
Het opzetten van een levende biobank met een uitgebreid panel van organoïden afkomstig van verschillende eierstokkankerpatiënten, samen met hun prospectief verzamelde klinische informatie, dient als een waardevolle bron voor een breed scala aan onderzoekstoepassingen en weerspiegelt het heterogene klinische landschap dat mogelijk van toepassing is op een grotere patiëntenpopulatie17. Langdurige kweek en cryopreservatie maken experimentele consistentie en de herhaalde toegankelijkheid van dezelfde organoïdelijn in de loop van de tijd mogelijk, en dienen als basis voor longitudinale experimentele ontwerpen met ongewijzigde cellulaire eigenschappen van de tumorlijn.
Door epitheliale architectuur en polarisatie te behouden, zijn de organoïdelijnen een adequaat model om cel-celcommunicatie en contextafhankelijke besluitvorming over het lot van cellen te bestuderen, gemedieerd door paracriene signaalroutes. Het inbedden van de organoïden in de histologische gel is een praktische en efficiënte tussenstap om materiaalverlies na fixatie te voorkomen en zorgt ervoor dat de nabewerking (inbedding in paraffine en doorsnede) parallel met weefselmonsters kan worden uitgevoerd. Het verlies van organoïden tijdens de fixatieprocedure is een kritiek punt wanneer het aantal organoïden zeer beperkt is. Dit verlies kan echter worden tegengegaan door de organoïden grondig uit de extracellulaire matrix te verwijderen door ze te wassen in een koud basaalkweekmedium en door ten minste twee volgroeide putjes van een plaat met 24 putjes te poolen voordat ze worden gefixeerd. Het immunofluorescentiekleuringsprotocol maakt confocale beeldvorming met hoge resolutie mogelijk om moleculaire en fenotypische kenmerken van de eierstokkankerorganoïden te corresponderen met het ouderlijke tumorweefsel, maar is ook een waardevol hulpmiddel om de cellulaire respons op chemische verbindingen of karakterisering van genetisch gemodificeerde lijnen te bestuderen. De methode is ook geschikt voor histologiekleuring zonder specifieke aanpassingen. Afhankelijk van het doel van het onderzoek moeten dunnere secties worden overwogen die met een microtoom (2-3 μm) zijn gesneden.
Belangrijk is dat een stabiele langetermijnkweek een voorwaarde is voor experimenten met genbewerking en functionele tests over geneesmiddelrespons en resistentie tegen nieuwe en standaardtherapieën 17,21. Met name organoïden die zijn gegenereerd uit herbiopten die worden uitgevoerd tijdens ziekteprogressie en recidief, bieden de mogelijkheid voor directe vergelijkende analyses tussen de therapie-naïeve oorspronkelijke tumor en de nieuw verworven kenmerken die tijdens terugval worden waargenomen. Identificatie van patiëntspecifieke behandelingsreacties en de vorming van therapieresistentie in vitro bevorderen het gebied van precisiegeneeskunde in onderzoek naar eierstokkanker21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.K. staat vermeld als uitvinder op een patent met betrekking tot een medium voor eierstokkankerorganoïden. F.T. ontving onderzoeksfinanciering, adviesraad, honoraria en reiskosten van AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics en Tesaro/GSK. S.M. ontving onderzoeksfinanciering, adviesraad, honorarium of reiskostenvergoeding: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Acknowledgments
De studie wordt gefinancierd door het Duitse kankeronderzoekscentrum DKTK, partnersite München, een samenwerkingsverband tussen DKFZ en het Universitair Ziekenhuis LMU München. De studie wordt ook ondersteund door de Duitse subsidie voor kankerhulp (#70113426 en #70113433). Paraffine-inbedding van weefsel en organoïden is uitgevoerd in de Core-faciliteit van het Instituut voor Anatomie, Faculteit der Geneeskunde, LMU München, München. Confocale beeldvorming is uitgevoerd in de kernfaciliteit Bioimaging in het Biomedisch Centrum (BMC). De auteurs willen Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink en Martina Rahmeh bedanken voor hun technische hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021).
- Thermo Scientific. Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
