Stratégie de mise en banque d’organoïdes du cancer de l’ovaire : Aborder l’hétérogénéité interpatiente entre les sous-types histologiques et les stades de la maladie

Summary

Ce protocole offre un cadre systématique pour l’établissement d’organoïdes du cancer de l’ovaire à différents stades de la maladie et relève les défis de la variabilité spécifique à la patiente pour augmenter le rendement et permettre une expansion robuste à long terme pour des applications ultérieures. Il comprend des étapes détaillées pour le traitement des tissus, l’ensemencement, l’ajustement des exigences en matière de milieux et la coloration par immunofluorescence.

Abstract

Bien que la création d’une biobanque du cancer de l’ovaire à partir d’organoïdes dérivés de patientes et de leurs informations cliniques de base promette des avancées dans la recherche et les soins aux patients, la normalisation reste un défi en raison de l’hétérogénéité de cette tumeur maligne mortelle, combinée à la complexité inhérente à la technologie des organoïdes. Ce protocole adaptable fournit un cadre systématique pour réaliser le plein potentiel des organoïdes du cancer de l’ovaire en tenant compte de la variabilité des progéniteurs spécifique à la patiente. En mettant en œuvre un flux de travail expérimental structuré pour sélectionner des conditions de culture et des méthodes de semis optimales, avec des tests parallèles de semis 3D direct par rapport à une voie 2D/3D, nous obtenons, dans la plupart des cas, des lignes d’expansion à long terme robustes adaptées à une large gamme d’applications en aval.

Notamment, le protocole a été testé et s’est avéré efficace dans un grand nombre de cas (N = 120) de matériel de départ très hétérogène, y compris le cancer de l’ovaire de haut et de bas grade et les stades de la maladie avec réduction tumorale primaire, maladie récurrente et échantillons chirurgicaux post-néoadjuvants. Dans un environnement de signalisation exogène à faible Wnt et à BMP élevé, nous avons observé que les progéniteurs étaient différemment sensibles à l’activation de la voie Heregulin 1 ß (HERß-1), HERß-1 favorisant la formation d’organoïdes chez certains tout en l’inhibant chez d’autres. Pour un sous-ensemble d’échantillons du patient, la formation optimale d’organoïdes et la croissance à long terme nécessitent l’ajout du facteur de croissance des fibroblastes 10 et de la R-Spondine 1 au milieu.

De plus, nous soulignons les étapes critiques de la digestion tissulaire et de l’isolement des progéniteurs et indiquons des exemples où une brève culture en 2D sur du plastique est bénéfique pour la formation ultérieure d’organoïdes dans la matrice de type 2 de l’extrait de membrane basale. Dans l’ensemble, une biobanque optimale nécessite des tests systématiques de toutes les principales conditions en parallèle afin d’identifier un environnement de croissance adéquat pour les lignées individuelles. Le protocole décrit également la procédure de manipulation pour un enrobage, une coupe et une coloration efficaces afin d’obtenir des images haute résolution des organoïdes, ce qui est nécessaire pour un phénotypage complet.

Introduction

La prise en charge clinique des patientes atteintes d’un cancer épithélial de l’ovaire reste difficile en raison de sa présentation clinique hétérogène à des stades avancés et de ses taux de récidive élevés¹. Pour mieux comprendre le développement du cancer de l’ovaire et le comportement biologique, il faut des approches de recherche qui tiennent compte de la variabilité spécifique à la patiente au cours de la maladie, de la réponse au traitement et des caractéristiques histopathologiques et moléculaires².

La biobanque, caractérisée par la collecte systématique et la conservation à long terme d’échantillons tumoraux provenant de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire ainsi que de leurs informations cliniques, offre la préservation d’une large cohorte de patientes à différents stades de la maladie, y compris des échantillons tumoraux provenant de chirurgies primaires de réduction tumorale, après une chimiothérapie néoadjuvante et d’une maladie récurrente. Il présente un potentiel précieux pour faire progresser la recherche sur le cancer en tant que ressource de biomarqueurs pronostiques prometteurs et de cibles thérapeutiques³. Cependant, les méthodes conventionnelles de biobanque, telles que la fixation et la congélation du formol, ne se prêtent pas à la réalisation d’études fonctionnelles sur les échantillons tumoraux d’origine en raison de la perte de viabilité et de la perturbation de l’architecture tissulaire tridimensionnelle native ^4,5.

Les études des mécanismes moléculaires, en oncologie et au-delà, dépendent de manière cruciale de l’utilisation de modèles expérimentaux appropriés qui reflètent fidèlement la biologie de la maladie et maintiennent les propriétés in vitro du tissu observé in vivo. Les organoïdes dérivés du patient, basés sur la préservation du potentiel de renouvellement, reproduisent en laboratoire la structure et la fonction d’origine de l’épithélium et permettent des tests dans un contexte spécifique au patient. Par conséquent, ils sont devenus des outils très prometteurs pour la recherche sur le cancer et la médecine personnalisée, comblant le fossé entre la diversité clinique et la recherche en laboratoire 6,7,8,9. Des stratégies thérapeutiques sur mesure basées sur les réponses médicamenteuses individuelles des lignées organoïdes et l’évaluation de la pertinence fonctionnelle des profils moléculaires peuvent potentiellement être appliquées directement aux soins aux patients^10,11. La possibilité d’une culture à long terme incluant des caractéristiques spécifiques au patient et la collecte de données cliniques prospectives pertinentes au fil du temps est très prometteuse pour identifier de nouveaux facteurs pronostiques et prédictifs impliqués dans la progression de la maladie et les mécanismes de résistance ^3,9.

Néanmoins, la construction d’une biobanque comprenant des organoïdes provenant de différents échantillons tumoraux nécessite une combinaison de respect strict d’une méthodologie complexe et de mise en place de protocoles pour une maintenance facile¹². La standardisation des processus garantit que la biobanque peut être établie et entretenue efficacement par du personnel formé, même en cas de chiffre d’affaires élevé, tout en respectant les normes de qualité les plus élevées¹³. Plusieurs études ont rapporté la génération réussie de lignées organoïdes stables pour le cancer de l’ovaire correspondant au profil mutationnel et phénotypique de la tumeur d’origine avec des taux d’efficacité variables. Pourtant, la biobanque de routine reste difficile dans la pratique, en particulier pour la croissance stable à long terme des lignées, qui est une condition préalable à une expansion à grande échelle ou à une édition génomique réussie.

En particulier, la question de l’extensibilité reste vaguement définie sur le terrain car les organoïdes qui présentent un potentiel de croissance lent et limité sont parfois comptés comme des lignées établies. Comme l’ont initialement démontré Hoffmann et al., une étude dont les principaux résultats ont servi de base à ce protocole plus développé, la manipulation optimale du tissu cancéreux de l’ovaire nécessite une stratégie unique pour s’adapter à l’hétérogénéité¹⁴. La caractérisation phénotypique des organoïdes obtenus par cette méthode et l’étroite similitude avec le tissu tumoral parental ont été confirmées par le séquençage de l’ADN et l’analyse transcriptomique des cultures matures (4-10 mois de culture) démontrant la stabilité du modèle 8,9,12,14.

Contrairement à l’environnement paracrine qui régule l’homéostasie dans les trompes de Fallope saines, la couche épithéliale, qui produit probablement un cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC), un potentiel de régénération du cancer et une capacité de formation d’organoïdes, est moins dépendante de la supplémentation exogène en Wnt. De plus, la signalisation active de la protéine morphogénétique osseuse (BMP), caractérisée par l’absence de Noggin dans le milieu organoïde, s’est avérée bénéfique pour l’établissement de cultures à long terme à partir de dépôts de tissus solides du cancer de l’ovaire^14,15. Au cours de la biobanque systématique de dépôts solides de cancer de l’ovaire, nous avons confirmé ces résultats et mis en place le pipeline, avec des détails décrits dans ce protocole qui assure une expansion soutenue à long terme dans la majorité des cas. Nous constatons que les tests parallèles de différentes compositions de milieux et modalités d’ensemencement lors de l’utilisation d’isolats primaires sont essentiels pour améliorer l’établissement de lignées organoïdes stables à long terme et pour augmenter les rendements permettant une propagation robuste et une expansion vers des formats multipuits requis pour les expériences en aval¹⁶.

En outre, la pureté et la qualité des échantillons prélevés lors de la chirurgie sont d’une importance cruciale pour le potentiel translationnel des organoïdes du cancer de l’ovaire dans la recherche fondamentale et le diagnostic moléculaire. La complexité de la présentation clinique du HGSOC nécessite une coopération étroite entre les chirurgiens, les oncologues et les scientifiques du laboratoire pour s’assurer que le matériel pertinent est correctement identifié, que les conditions de transport sont maintenues constantes et que les lignées organoïdes sont générées avec une grande efficacité représentant les caractéristiques les plus importantes de la maladie de chaque patient. Ce protocole fournit un cadre standardisé mais adaptable pour saisir tout le potentiel des organoïdes du cancer de l’ovaire, compte tenu de l’hétérogénéité qui caractérise le cancer de l’ovaire^16,17. Ce protocole permet notamment une biobanque fiable du large spectre de la présentation clinique du cancer de l’ovaire, y compris différents types histologiques (cancer de l’ovaire de haut grade et de bas grade, LGSOC), différents dépôts provenant des mêmes patientes qui présentent des différences dans la régulation de la souche, des tissus provenant de chirurgies en contexte post-néoadjuvant, du matériel de biopsie et des échantillons de chirurgies dans la phase récurrente de progression de la maladie.

Protocol

Des échantillons de tissus tumoraux provenant de chirurgies du cancer de l’ovaire ont été collectés et des organoïdes dérivés de patientes ont été générés conformément au comité d’éthique de l’Université LMU (17-471), conformément aux réglementations européennes, nationales et locales applicables. Chaque patient participant à l’étude a donné son consentement par écrit. Lorsque vous travaillez avec des échantillons de tissus frais, une autorisation de sécurité de niveau de biosécurité 2 et des armoires à flux laminaire sont requises. Compte tenu de la nature potentiellement infectieuse des échantillons de tissus, qui ne peut être exclue en raison de l’absence de tests de routine pour les maladies infectieuses pertinentes, il est nécessaire de veiller à ce que les réglementations institutionnelles en matière de biosécurité soient strictement respectées et à ce que des équipements de protection individuelle adéquats soient disponibles pour le personnel menant les expériences.

1. Préparatifs

1. Préparation moyenne
   1. Préparez les médias 2D et 3D une fois par semaine et conservez-les à 4 °C.
      REMARQUE : La composition exacte des ingrédients pour chaque milieu est indiquée dans le tableau 1. Le milieu 1 du cancer de l’ovaire (OCM1) et l’OCM2 peuvent être complétés par HER1ß (concentration finale : 50 ng/mL), ce qui entraîne quatre conditions différentes : OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß.
   2. Créer des solutions mères de réactifs de facteur de croissance et les conserver à 20 °C et de A83-01 et de nicotinamide (stockage à +4 °C). En raison de la sensibilité à la température des facteurs de croissance, utiliser immédiatement des solutions mères décongelées pour la préparation du milieu et éviter les cycles de décongélation répétés en créant des aliquotes.
      REMARQUE : La préparation des supports est une étape critique qui doit être strictement contrôlée.
   3. Préparation du milieu conditionné RSPO-1
      1. Décongeler rapidement les lymphocytes T HA-R-Spondin1-Fc 293 (stockage à -80 °C) à 37 °C. Lavez-les avec 10 mL de milieu de culture basal, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF), ci-après appelé milieu de culture basal++.
      2. Remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu de culture basal++ et l’ensemencer dans une fiole T75.
      3. Diviser les cellules dans un rapport de 1 :6 avec un réactif de dissociation contenant de la trypsine (4 min à 37 °C) lorsque les cellules atteignent la confluence. Semez-les dans une nouvelle fiole T75.
      4. Le lendemain, ajouter la phléomycine D1 (1,25 μL/mL) au milieu.
      5. Divisez les cellules dans un rapport de 1 :20 avec la trypsine (4 min à 37 °C) lorsque les cellules atteignent la confluence. Ensemencer les cellules dans plusieurs fioles T75 (nombre de fioles en fonction du volume final visé) dans 30 mL de milieu de culture basal++ (contenant 10 % de FCS) complété par de la phléomycine D1.
      6. Démarrer la production de milieux conditionnés lorsque les cellules atteignent environ 50 % de confluence : remplacer le milieu par 40 mL de milieu de culture de base complété par 5 % de FCS sans phléomycine D1.
      7. Récupérez le premier surnageant après 3 jours. Pour éliminer les débris, centrifugez pendant 10 min à 1 200 × g. Conserver le surnageant dans un récipient stérile à 4 °C.
      8. Ajouter un nouveau milieu de culture basal complété par 5 % de FCS dans les cellules. Récupérez le deuxième surnageant après 3-4 jours. Centrifuger pendant 10 min à 1 200 × g. Ajoutez le deuxième surnageant au premier surnageant.
      9. Filtrer le milieu conditionné à l’aide d’un filtre à bouchon de 0,2 μm.
      10. Pour le contrôle de la qualité et la quantification de RSPO1, ajoutez le milieu produit à une lignée cellulaire 293T (293T WntR, 7xTcf-eGFP)¹⁴, transduite de manière stable avec un plasmide GFP portant le rapporteur^{Wnt 18}.
          REMARQUE : En fonction de la quantité et de l’intensité du signal GFP, l’activité de RSPO1 en tant qu’agoniste de la voie Wnt est testée par la quantification de la lignée cellulaire rapporteuse Wnt.
      11. Conserver des aliquotes de 15 mL pour une utilisation immédiate (dans un délai de 1 semaine) à 4 °C. Pour une conservation plus longue (6 mois), maintenez le fluide conditionné à -20 °C.

2. Initiation d’une culture d’organoïdes du cancer de l’ovaire

1. Isolement des tissus primaires
   1. Transporter les tissus frais et viables, de préférence immédiatement après la chirurgie, et effectuer l’isolement dans un délai maximum de 20 heures après le prélèvement. Assurez-vous de bonnes conditions de transport dans le milieu de prélèvement de tissus avec une boîte de transport équipée de compresses froides à environ 4 °C.
   2. En laboratoire, préparez les réactifs et l’équipement nécessaires pour faciliter le traitement rapide des échantillons :
      1. Matrice d’extrait de membrane basale de type II (matrice BME 2) sur glace (environ 2 h).
      2. Préparez des scalpels jetables, des outils de dissection stérilisés (ciseaux et pince à épiler) et des inserts filtrants de 400 μm pour des tubes de 50 ml.
      3. Préparez un récipient avec une petite quantité d’azote liquide pour la congélation instantanée et un bain-marie préchauffé à 37 °C.
         REMARQUE : Travailler dans une hotte à flux laminaire de culture cellulaire.
   3. Lavez soigneusement le tissu frais dans une boîte de Pétri dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (sans Ca⁺⁺ ni Mg⁺⁺). À l’intérieur de la boîte de Pétri, fragmentez le tissu à l’aide des scalpels et/ou des ciseaux jetables en petits morceaux de 3 à 5 mm.
   4. Séparez le tissu obtenu en trois sections aux fins suivantes :
      1. Prélever les tissus dans des tubes cryogéniques. Transférez les tubes cryogéniques dans le récipient préparé rempli d’azote liquide pour la congélation choc.
      2. Prélever des tissus (2-3 mm) dans un récipient histologique rempli de formol pour la fixation (24 h) et les incorporer dans de la paraffine à des fins de coloration ^19,20.
      3. De plus, homogénéisez le tissu avant la digestion enzymatique. Maximisez la dissociation mécanique avec un scalpel et transférez-la dans un tube de tissu de 50 ml.
         REMARQUE : Assurez-vous que le tissu est toujours trempé dans du PBS pendant l’homogénéisation pour éviter le dessèchement du tissu.
   5. Combiner le tissu homogénéisé avec un mélange digestif contenant du PBS (sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺), de la collagénase I (solution mère 5 U/μL, concentration finale 1 U/μL) et un inhibiteur sélectif de ROCK1 et 2 (concentration finale de 3 μM) (composants énumérés dans le tableau 1). Utilisez 15 ml de mélange de digestion dans un tube de 50 ml pour chaque 2 cm³ de la tumeur.
      REMARQUE : Un matériel limité (p. ex., échantillons de biopsie) ne nécessite que de petites quantités (environ 2 à 3 ml) de mélange de digestion pour assurer la dissociation enzymatique.
   6. Pour la dissociation enzymatique, incuber le tube pendant 1,5 h dans un bain-marie à 37 °C. Effectuer des tourbillons sporadiques et vigoureux (environ toutes les 20 minutes pendant 10 à 15 s) pour favoriser la dissociation mécanique.
   7. Après l’incubation, ajouter 15 mL de milieu de culture basal froid++ dans le tube. Centrifuger 5 min à 300 × g.
   8. Après avoir retiré le surnageant, ajouter 5 mL de nouveau milieu de culture basal++. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre de 400 μm dans un tube frais de 50 mL.
   9. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
   10. Pour éliminer les érythrocytes, ajoutez 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR) à la pastille cellulaire. Incuber au bain-marie pendant 5 min à 37 °C.
   11. Ajouter 5 mL de milieu de culture basal++ pour l’inactivation de la lyse. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Ajouter 3 mL de milieu de culture basal++ à la pastille cellulaire.
   12. Compter les cellules viables après dilution 1 :1 avec une solution de coloration au bleu de trypan (par exemple, 10 μL de l’échantillon + 10 μL de solution de coloration au bleu de trypan) dans un compteur de cellules automatique ou manuellement dans une chambre de Neubauer.
   13. Calculez le nombre de cellules nécessaires pour l’ensemencement direct en 3D. Pour chaque dépôt tumoral, ensemencer dans une plaque de format 48 puits au moins 2-3 puits par milieu de cancer de l’ovaire, ce qui correspond à un total de 8-12 puits dans une matrice d’ensemencement (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß). Calculez 30 000 cellules pour chaque puits dans une gouttelette de 25 μL de matrice BME de type 2. En option, choisissez un format de 24 puits avec 50 μL de matrice BME 2 et 50 000 cellules ensemencées par puits.
   14. Ensemencez les cellules restantes en 2D (voir étape 2.1.13).
   15. Pipeter la quantité de milieu de culture basal++ en suspension contenant le nombre total de cellules nécessaires dans un nouveau tube et centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
   16. Sur la glace, ajouter la quantité totale de matrice BME 2 froide (25 μL pour chaque puits dans une plaque de format 48 puits ; donc, 100 μL pour 4 puits) à la pastille et bien mélanger pour obtenir une répartition uniforme des cellules par puits en pipetant doucement la pastille de haut en bas sans créer de bulles.
   17. Ensemencer les cellules dans des gouttelettes de matrice BME 2 (25 μL) dans la plaque vide préchauffée à 48 puits. Pour obtenir une distribution uniforme entre les puits, déplacez doucement et lentement la pipette de haut en bas (3-4x) à l’intérieur du tube avant de transférer la gouttelette de la matrice BME 2 dans chaque puits pour éviter la précipitation des cellules pendant la distribution.
   18. Après avoir incubé la plaque à 37 °C pendant au moins 30 min pour consolider les gouttelettes de la matrice BME 2, pipeter 250 μL de chacun des quatre milieux du cancer de l’ovaire (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) dans les puits correspondants.
   19. Parallèlement à la procédure d’ensemencement 3D direct, préserver les cellules isolées restantes en commençant une culture 2D.
       1. Après centrifugation pendant 5 min à 300 × g, ajoutez le granulé au milieu 2D. Sélectionnez le format (fiole T75 ou fiole T25), en fonction du nombre de cellules disponibles après l’ensemencement 3D.
       2. Incuber le ballon pendant 3 à 5 jours à 37 °C pour l’adhérence des cellules. Gardez le même milieu pendant les 72 premières heures.
       3. Lorsque les cellules atteignent la confluence, transférez la culture dans la matrice BME 2. Ne pas développer les isolats primaires en culture 2D en les fractionnant, car la propagation à long terme en 2D nuit au potentiel de souche.
2. Transfert de la culture 2D à la culture 3D
   1. Dans la fiole T75 ou T25, laver la monocouche 2x avec 5 mL de PBS pour détacher les cellules de la surface inférieure. Incuber avec 1 mL de trypsine pendant 10 min à 37 °C.
   2. Ajouter 5 mL de milieu de culture basal froid++ pour l’inactivation du réactif de dissociation. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g.
   3. Ajouter 3 mL de milieu de culture basal++ à la pastille. Comptez les cellules comme décrit aux étapes 2.1.12-2.1.13. Semences pour les différentes compositions de milieux (voir figure 1) comme décrit aux étapes 2.1.16 à 2.1.18.
3. Évaluation de la croissance des organoïdes
   1. Imagez les puits au moins une fois par semaine pour documenter la croissance des organoïdes. Réalisez des images comparables de haute qualité de la culture 2D/3D et des plaques d’ensemencement direct par microscope à contraste de phase. Veillez à la cohérence du grossissement et utilisez 4x pour une vue d’ensemble des puits (quantification) et 10x et 20x pour documenter la morphologie des organoïdes.
   2. Organisez le stockage des images dans des dossiers dédiés à des lignes individuelles.
   3. Sélectionner la meilleure lignée d’organoïdes pour la culture à long terme par évaluation comparative de la formation d’organoïdes aux différentes modalités de semis (2D suivi d’un semis 3D versus semis 3D direct) et à différentes compositions de milieux (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 et OCM2+ HER1ß).
      1. En moyenne, 14 à 21 jours après l’isolement, évaluer le potentiel de formation d’organoïdes (quantité) ainsi que la taille et le phénotype cellulaire des organoïdes cultivés dans différentes conditions. Recherchez les caractéristiques suivantes : absence de vacuoles, bulle membranaire ou perte d’adhérence et arrondi des cellules.

3. Culture d’organoïdes à long terme

1. Passage d’organoïdes
   1. Évitez de diviser les organoïdes trop fréquemment et pendant la phase proliférative. Effectuer des procédures de digestion mécanique et enzymatique à des intervalles de plus de 10 jours.
   2. Pour perturber chaque gouttelette de matrice BME 2, ajoutez 250 μL (format 48 puits) ou 500 μL (format 24 puits) de milieu de culture basal glacé ++. Assurez-vous de la dissolution complète de la gouttelette et pipetez par intermittence de haut en bas et raclez le fond de la plaque. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et placez-la sur de la glace. Ajouter 1 mL de milieu de culture basale glacé++.
      REMARQUE : L’efficacité d’élimination de la matrice BME 2 dépend fortement de la température du fluide, car la meilleure dissolution est obtenue en dessous de 4 °C.
   3. Pool 2-3 puits techniques de réplication pour une expansion uniforme. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Inspectez le contenu de la suspension par rapport à la source de lumière pour voir si le gel BME 2 est toujours visible. Retirez le surnageant et répétez le lavage avec un milieu glacé si la matrice BME 2 est toujours visible.
   4. Incuber avec 1 mL de trypsine (conservée à 20-25 °C) dans un bain-marie à 37 °C pendant 7-10 min. Vortex sporadiquement pendant 10 s pour améliorer la dissociation. Inspectez le tube périodiquement visuellement pour voir si la dissociation progresse.
   5. Tirez la suspension cellulaire de haut en bas avec une seringue à travers une aiguille d’une taille allant de 23 G à 27 G. Vérifiez si de gros amas cellulaires sont toujours présents et répétez la procédure si nécessaire.
      REMARQUE : La fragmentation à travers une seringue est facultative et la taille de l’aiguille dépend de l’efficacité de dissociation requise. Une suspension cellulaire homogène conduit à une répartition uniforme entre les puits.
   6. Ajouter 1 mL de milieu de culture basal froid++ pour inactiver la réaction.
   7. FACULTATIF : Comptez les cellules comme décrit aux étapes 2.1.12-2.1.13 et décidez du rapport de division par rapport au passage parental (par exemple, puits 1 :3).
   8. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirez le surnageant.
   9. Effectuer l’ensemencement comme décrit aux étapes 2.1.16 à 2.1.18 et appliquer le milieu organoïde optimal pour le cancer de l’ovaire en fonction de la culture à long terme déjà établie. Changez le milieu du cancer de l’ovaire tous les 3-4 jours.
   10. En cas de perturbation de la gouttelette de la matrice BME 2 lors du changement de milieu, envisager un réensemencement sans digestion enzymatique. Pour éviter toute perturbation de la gouttelette, effectuez soigneusement la procédure de changement de milieu sans pipetage direct sur la gouttelette de matrice BME 2. De plus, évitez de laisser une quantité excessive de milieu de culture basal résiduel++ sur la pastille avant la dilution avec la matrice BME 2 à l’étape 2.1.16 car cela pourrait affecter la fragilité des gouttelettes.
2. Cryoconservation des organoïdes
   REMARQUE : Effectuer la cryoconservation des organoïdes pendant la phase de prolifération au cours de la première semaine après le passage.
   1. Perturber la gouttelette de la matrice BME 2 avec un milieu de culture basal glacé ++ selon l’étape 3.1.2. Après centrifugation et élimination du surnageant comme décrit à l’étape 3.1.3., travailler sur de la glace et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de cryoconservation glacé. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques prémarqués de 1,8 ml.
   2. Conservez les tubes dans un récipient de congélation contenant de l’alcool isopropylique prérefroidi et placez-les à -80 °C pendant la nuit.
   3. Conservez les tubes d’origine à -80 °C pendant 2 mois maximum. Transfert à l’azote liquide pour un stockage stable à long terme.
3. Dégel des stocks d’organoïdes
   1. Préchauffer 9 mL de milieu de culture basal++ dans un bain-marie à 37 °C dans un tube de 15 mL marqué.
   2. Transférez le flacon de stockage souhaité du stockage à -80 °C ou à l’azote liquide dans un récipient de transport rempli d’azote liquide.
   3. Transférez le cryotube dans un bain-marie à 37 °C et agitez-le doucement jusqu’à ce que le matériau congelé près des parois du tube commence à dégeler.
   4. Répartir lentement la suspension organoïde dans le tube étiqueté rempli de 9 mL de milieu. Secouez doucement le tube. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g et retirer le surnageant.
   5. Effectuer l’ensemencement comme décrit aux étapes 2.1.16 à 2.1.18 et appliquer le milieu organoïde optimal pour le cancer de l’ovaire en fonction des conditions de culture à long terme déjà déterminées pour la lignée individuelle.
4. Fixation des organoïdes
   1. Effectuez le prélèvement d’organoïdes comme décrit aux étapes 3.1.2-3.1.3.
   2. Ajouter 3 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS (pH 7,4) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
   3. Laver 2 fois avec 5 mL de PBS, centrifuger pendant 3 min à 300 × g et retirer le surnageant. Ajouter 4 ml de PBS frais à la pastille et la maintenir à 4 °C jusqu’à l’incorporation.
      REMARQUE : Les organoïdes fixes sont stables et le stockage à 4 °C est possible pendant 1 mois avant l’enrobage.
   4. Chauffer le gel histologique (conservé à -20 °C) à 65 °C jusqu’à liquéfaction.
   5. Détectez les organoïdes fixes installés et visibles au fond du tube. Retirez le surnageant. En cas de boulette de cellule perturbée, effectuer une centrifugation pendant 3 min à 300 × g et jeter le PBS surnageant.
   6. Suspendre la pastille dans 100 μL de gel chaud en pipetant doucement de haut en bas. Transférez la gouttelette sur un morceau de film d’étanchéité et laissez la solidification se produire après ~15 min à température ambiante.
   7. Déplacez la gouttelette de gel fixe vers la cassette de paraffine tissulaire. Appliquer des protocoles d’enrobage tissulaire standard^19,20.
   8. Coupez des tranches de 5 à 10 μm d’épaisseur avec un outil de coupe de microsection. Transférer les coupes sur des lames d’histologie. Sécher les lames pendant 1 h à 65 °C ; Conservez-les dans un endroit sec.
5. Coloration par immunofluorescence de coupes organoïdes
   1. Déplacer les lames préparées à travers des plateaux en verre avec les séries de dilution suivantes : 2 x 15 min d’agent d’élimination pour l’histologie ; 15 min 100% éthanol ; 1 min 100% éthanol ; 10 min d’éthanol à 96 % ; 5 min d’éthanol à 70 % ; 5 min 50% d’éthanol.
   2. Ajouter le PBS et garder 5 min sur le shaker à 100 tr/min. Répétez le lavage 2 fois.
   3. Ajouter une solution de récupération d’antigène (tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) [pH 9,0] ou citrate [pH 6,0]) aux lames placées dans la chambre thermostable. Dans un cuiseur vapeur, conservez le récipient avec les lames pendant 30 min, puis laissez refroidir à température ambiante.
   4. Répétez l’étape 3.5.2.
   5. Transférez la chambre contenant les lames pendant 15 min dans une solution détergente de perméabilisation à 1% (dans du PBS).
   6. Répétez l’étape 3.5.2.
   7. Tracez le contour de l’emplacement des organoïdes sur les lames avec un stylo à cire immunomarquant pour maintenir la gouttelette pendant les étapes suivantes.
   8. Ajouter sur chaque lame 100 μL de sérum à 10 % dans un milieu de dilution, selon l’espèce de l’anticorps secondaire.
   9. Répétez l’étape 3.5.2.
   10. Diluer les anticorps primaires dans un milieu pour obtenir un volume final de 100 μL. Conserver à 4 °C pendant au moins 16 h dans un plateau d’incubation ou une chambre d’humidité.
   11. Répétez l’étape 3.5.2.
   12. Diluer les anticorps secondaires dans un milieu, jusqu’à obtenir des gouttelettes de 100 μL, et conserver pendant 2 h à température ambiante dans un plateau d’incubation.
   13. Répétez l’étape 3.5.2.
   14. Ajouter une solution de contrecoloration nucléaire DAPI (4',6-Diamidin-2-phénylindol, dichlorhydrate) diluée dans un milieu de dilution 1 :1 000. Conserver 10 min à température ambiante pour l’incubation.
   15. Répétez l’étape 3.5.2.
   16. Ajoutez un support de montage et couvrez avec la lamelle. Fixez les lames avec du vernis à ongles transparent une fois sèches (environ après 8-12 h).
   17. Image avec un microscope confocal ou un autre microscope à fluorescence. Faites des images d’ensemble ainsi que des images détaillées des structures subcellulaires qui capturent les principales caractéristiques de la morphologie des organoïdes.

Representative Results

Après la dissociation tissulaire initiale, la filtration et le comptage, les cellules sont ensemencées en parallèle directement au format 3D, comme expliqué ci-dessus, ainsi que la suspension dans le flacon pour une brève expansion 2D. Dans certains cas, l’expansion 2D transitoire influence positivement la formation de l’organoïde, et la lignée à long terme est établie avec succès par cette voie, tandis qu’un ensemencement 3D parallèle comparatif peut entraîner un arrêt de la croissance (Figure 1). Pour chaque tissu de donneur traité, les cellules sont testées selon la matrice du milieu. Suivant cette stratégie, notre biobanque contient maintenant des lignes représentatives de chaque condition de croissance standard, comme le montre la figure 2. Grâce à la mise en œuvre rigoureuse de cette mini-plateforme de criblage testant différents milieux et modes d’ensemencement, nous avons réussi à générer des lignées organoïdes de différents types histologiques et stades de développement de la maladie du cancer de l’ovaire (Figure 3) des chirurgies primaires séreuses de haut grade, des chirurgies d’intervalle post-néoadjuvant et de la maladie récurrente. La caractérisation phénotypique des lignées organoïdes par coloration par immunofluorescence des principaux marqueurs par rapport au tissu parental démontre de manière convaincante que les caractéristiques du compartiment tumoral épithélial sont préservées dans le modèle organoïde : architecture épithéliale et adhésion marquées par (EpCAM), identité de lignée (PAX8) et mutation ponctuelle TP53 typique caractéristique du HGSOC conduisant à une accumulation dans le noyau (Figure 4).

Certains points méthodologiques importants sont également à prendre en compte pour une prise de décision efficace lors de la biobanque d’organoïdes. Le potentiel de croissance des organoïdes n’est pas seulement déterminé par l’augmentation du diamètre des organoïdes. De plus, les caractéristiques phénotypiques déterminent les potentiels d’expansion tels que la couleur, l’obscurité et l’intégrité des contours. La formation de vacuoles de stress cytoplasmique indique des conditions sous-optimales. Des problèmes initiaux en ce qui concerne la croissance et le potentiel de formation d’organoïdes peuvent survenir en raison de conditions de transport inappropriées et d’un retard de la procession tissulaire. Comme une grande variabilité interindividuelle du potentiel d’expansion est observée dans les lignées tumorales, nous recommandons d’attendre au moins 14 jours avant de prendre une décision finale sur le potentiel de croissance. Si des schémas de croissance similaires sont initialement observés dans différents milieux, plusieurs conditions doivent être étendues. D’après notre expérience, une distinction claire du potentiel de croissance stable à long terme n’est souvent possible qu’après une culture de plusieurs semaines ou mois.

Figure 1 : Avantages d’un bref ensemencement en 2D d’isolats primaires pour la génération ultérieure d’organoïdes. (A) Schéma du plan expérimental montrant une stratégie d’ensemencement parallèle bidirectionnel : 2D/3D, et ensemencement direct 3D dans quatre milieux différents. (B) Image des isolats primaires adhérents avant trypsinisation et transfert 3D. (C) Un exemple de gisement primaire où l’ensemencement parallèle a révélé l’avantage évident de la voie 2D/3D car l’expansion organoïde à long terme n’était possible qu’à partir de progéniteurs initialement isolés sur du plastique. L’image en haut à gauche montre une culture 3D 7 jours après l’isolement au passage 0 (appelé P0) avec une formation insuffisante d’organoïdes après le premier passage (appelé P1) sur l’image en bas à gauche. Après un ensemencement 2D sur plastique (voir Figure 1B) suivi d’un transfert dans une culture 3D, une meilleure formation organoïde est déjà apparente à P0, tandis que le potentiel d’expansion à long terme est confirmé au passage 4 (P4). Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Besoin de milieu spécifique au patient. Exemples de quatre lignées expansées stables à long terme différentes, chacune poussant dans un milieu différent. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviations : OCM = milieu pour le cancer de l’ovaire ; her = heregulin 1β ; HGSO = cancer de l’ovaire séreux de haut grade. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Génération d’organoïdes à tous les stades de la maladie. Images de lignes d’expansion stables à long terme, d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade et d’un cancer de l’ovaire séreux de bas grade dans la présentation de la maladie primaire, d’une chirurgie d’intervalle (post-chimiothérapie néoadjuvante) et de tissus cancéreux récurrents. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviations : HGSOC = cancer de l’ovaire séreux de haut grade ; LGSOC = cancer de l’ovaire séreux de bas grade ; NACT = chimiothérapie néoadjuvante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Correspondance étroite du phénotype des organoïdes et du tissu cancéreux parental. Les images confocales de la coloration par immunofluorescence du tissu cancéreux (A) et de la ligne organoïde appariée (B) montrent une très grande similitude dans le motif de coloration et le niveau d’expression de tous les marqueurs, EpCAM (vert), PAX8 (rouge), TP53 (magenta). Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition du milieu et du mélange de digestion utilisés dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Le protocole conçu répond aux défis précédents de la biobanque d’organoïdes du cancer de l’ovaire en ce qui concerne la formation d’organoïdes et le potentiel de passage à long terme et garantit la génération de lignées entièrement extensibles à partir de la majorité des dépôts tumoraux solides. Le processus de collecte chirurgicale d’échantillons tumoraux à utiliser pour la génération d’organoïdes a un impact significatif sur le rendement et le potentiel d’expansion. Des échantillons de tissu tumoral peuvent être obtenus lors de diverses procédures, notamment la chirurgie multiviscérale, la laparoscopie diagnostique ou la biopsie. Le chirurgien gynéco-oncologique expérimenté doit donner la priorité à l’obtention d’échantillons de tumeurs propres à partir de localisations péritonéales. Il a notamment été observé que les zones macroscopiquement nécrotiques dans les grands dépôts tumoraux sont moins adaptées à la génération réussie de cultures d’organoïdes. Comme la pureté de l’échantillon est cruciale pour refléter les caractéristiques moléculaires et phénotypiques pour les applications en aval, des efforts synchronisés des équipes cliniques et de laboratoire sont nécessaires pour une biobanque optimale, garantissant que les lignées sont créées à partir des régions les plus pertinentes de la tumeur.

Bien que ce protocole couvre les variations de dépendance aux facteurs de croissance que nous avons observées au cours de 2 ans de biobanque, il est clair qu’un raffinement supplémentaire est justifié pour augmenter encore l’efficacité car nous n’avons toujours pas observé de croissance d’organoïdes dans 20% des cas et le nombre de lignées qui ont démontré un potentiel d’expansion limité suggère un maintien sous-optimal de la souche. Bien que notre biobanque d’organoïdes ne comprenne actuellement que des échantillons de cancer de l’ovaire d’histologie séreuse (HGSOC et LGSOC), notre expérience avec des échantillons de différentes histologies épithéliales du cancer de l’ovaire avant le programme de biobanque structurée a montré des taux de réussite comparables sans différences spécifiques. Notamment, la majorité des sous-types de cancer épithélial de l’ovaire partagent une morphologie pseudostratifiée colonnaire similaire avec des tissus qui se sont développés à partir du tractus müllérien (trompe de Fallope, utérus, col de l’utérus) tandis qu’en revanche, l’épithélium ovarien lui-même provient de la crête génitale et du mésonéphros, étant recouvert d’une seule couche d’épithélium cuboïdal. Étant donné que les voies de développement régulant l’homéostasie épithéliale jouent un rôle central dans le contrôle du potentiel des cellules souches adultes, les différences d’origine embryonnaire doivent être prises en compte lors de l’élaboration de protocoles de bio-banque d’organoïdes. Ainsi, nous pensons que les progéniteurs de la surface de l’ovaire ont probablement besoin de conditions de culture spécifiques à l’organe pour maintenir une croissance stable à long terme.

Notamment, dans notre laboratoire, le protocole s’est avéré efficace également pour les échantillons de cancer de l’ovaire post-néoadjuvant, bien que la chimiothérapie néoadjuvante ait un impact sur la viabilité cellulaire et le phénotype tissulaire. Ces échantillons présentent plus de débris et d’agrégats de tissus extracellulaires que les échantillons provenant de tissus naïfs de chimiothérapie de chirurgies de réduction tumorale primaires, ce qui pourrait affecter le potentiel de formation d’organoïdes. Dans ces cas, nous avons constaté qu’une quantité appropriée de tissu chirurgical et le strict respect des conditions de transport recommandées sont cruciaux pour une génération réussie d’organoïdes, car les échantillons post-néoadjuvants pourraient être plus sensibles.

Un phénomène très intéressant de l’effet bénéfique d’une brève expansion sur le plastique en 2D de progéniteurs fraîchement isolés sur la croissance ultérieure des organoïdes, que nous avons observé à plusieurs reprises et donc inclus dans la procédure expérimentale standardisée, est un ajout important à la méthodologie du domaine de recherche sur les organoïdes cancéreux, qui repose en grande partie sur des stratégies d’ensemencement direct. Il est tentant de spéculer que la sensibilité des progéniteurs après digestion enzymatique et la capacité des facteurs de croissance à les amorcer adéquatement pourraient être les mécanismes sous-jacents à l’origine de cette différence, qui est dans certains cas un facteur décisif si la lignée peut être établie. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour établir des dépendances claires.

Pour relever les défis posés par une forte adhésion cellulaire et des jonctions fonctionnelles dans les organoïdes 3D du cancer de l’ovaire, qui sont difficiles à digérer, une combinaison de dissociation mécanique et enzymatique avec une aiguille et une seringue peut aider lorsque de gros amas subsistent après la trypsinisation. L’expérimentation de différentes conditions enzymatiques pourrait conduire à d’autres améliorations.

Après un stockage à long terme, les lignées organoïdes peuvent être décongelées et mises en culture selon le plan expérimental et utilisées pour des applications ultérieures. Cela permet d’accéder à tout moment à des lignées organoïdes déjà générées à des fins de recherche spécifiques et est particulièrement intéressant pour étudier le comportement à long terme de certaines lignées à la lumière de la progression de la maladie du patient. Cependant, la cryoconservation des organoïdes du cancer de l’ovaire reste un défi. Les variations de température pendant les cycles de congélation et de décongélation peuvent affecter négativement la viabilité, la fonctionnalité et le potentiel d’expansion des organoïdes. Le stockage à long terme est plus stable dans l’azote liquide, où les températures très basses minimisent le risque de dégradation afin que l’intégrité des organoïdes puisse être maintenue. Cependant, une optimisation continue est justifiée pour établir des procédures cohérentes de congélation, d’entreposage et de décongélation, afin d’améliorer encore ces processus.

Malgré les problèmes en suspens mentionnés, ce protocole démontre la capacité de générer de manière cohérente des lignées organoïdes stables à partir d’échantillons de tumeurs solides de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire. Dans notre laboratoire, nous avons traité à ce jour 120 échantillons de tissu cancéreux primitif de l’ovaire, réussissant dans environ 50 % des cas, y compris un large éventail de sous-types histologiques et de stades de la maladie avec des échantillons chirurgicaux primaires, récurrents et postnéoadjuvants. En fournissant un cadre structuré pour la génération d’organoïdes dérivés de divers échantillons de patients, l’ensemencement parallèle dans différents milieux et la mise en œuvre de différentes stratégies d’ensemencement, ce protocole offre la possibilité d’évaluer les différences individuelles dans le potentiel de souche, fournissant ainsi des informations supplémentaires sur la biologie tumorale. À notre connaissance, la grande majorité des études suivent généralement l’approche inverse consistant à tester les composants du milieu sur un petit nombre d’échantillons et à choisir pour simplifier principalement un milieu optimal. Nos tests systématiques de l’effet de HER1ß, de l’effet de la supplémentation en RSPO1 et FGF10 et de l’ensemencement 2D/3D démontrent de manière concluante que le tissu cancéreux de l’ovaire présente un degré de variabilité interpatiente dans les propriétés de souche, et que le milieu optimal est en effet spécifique à la patiente. Par conséquent, il est essentiel de tester systématiquement en parallèle différentes compositions de milieux fournissant différents environnements de signalisation paracrine exogènes.

La création d’une biobanque vivante avec un vaste panel d’organoïdes provenant de diverses patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire ainsi que leurs informations cliniques recueillies prospectivement constituent une ressource précieuse pour un large éventail d’applications de recherche et reflètent le paysage clinique hétérogène qui peut s’appliquer à une population de patients plus large¹⁷. La culture et la cryoconservation à long terme permettent une cohérence expérimentale et l’accessibilité répétée de la même lignée organoïde au fil du temps, servant de base à des conceptions expérimentales longitudinales avec des propriétés cellulaires de lignée tumorale inchangées.

En conservant l’architecture épithéliale et la polarisation, les lignées organoïdes constituent un modèle adéquat pour étudier la communication cellule-cellule et la prise de décision sur le destin cellulaire en fonction du contexte médiée par les voies de signalisation paracrine. L’enrobage des organoïdes dans le gel histologique est une étape intermédiaire pratique et efficace pour éviter la perte de matériau après la fixation et garantit que le traitement en aval (enrobage dans la paraffine et coupe) peut être effectué en parallèle avec les échantillons de tissus. La perte d’organoïdes pendant la procédure de fixation est un problème critique lorsque le nombre d’organoïdes est très limité. Cependant, cette perte peut être contrecarrée en éliminant complètement les organoïdes de la matrice extracellulaire en les lavant dans un milieu de culture basal froid et en mettant en commun au moins deux puits adultes d’une plaque de format 24 puits avant la fixation. Le protocole de coloration par immunofluorescence permet une imagerie confocale à haute résolution pour faire correspondre les caractéristiques moléculaires et phénotypiques des organoïdes du cancer de l’ovaire avec le tissu tumoral parental, mais constitue également un outil précieux pour étudier la réponse cellulaire aux composés chimiques ou caractériser les lignées génétiquement modifiées. La méthode convient également à la coloration histologique sans aucune modification spécifique. Selon le but de l’étude, des coupes plus minces découpées au microtome (2-3 μm) doivent être envisagées.

Il est important de noter qu’une culture stable à long terme est une condition préalable aux expériences d’édition de gènes et aux tests fonctionnels sur la réponse aux médicaments et la résistance aux thérapies nouvelles et standard^17,21. En particulier, les organoïdes générés à partir de biopsies effectuées au cours de la progression et de la récidive de la maladie, offrent la possibilité d’analyses comparatives directes entre la tumeur d’origine naïve de traitement et les caractéristiques nouvellement acquises observées lors de la rechute. L’identification des réponses thérapeutiques spécifiques aux patientes et la formation de résistance au traitement in vitro font progresser le domaine de la médecine de précision dans la recherche sur le cancer de l’ovaire²¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Sterican 26 G	Braun, Melsungen, Germany	4657683
100 Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
293T HA Rspo1-Fc	R&D systems, Minneapolis, USA	3710-001-01	Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)	Merck, Darmstadt, Germany	616454
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12634028
Anti-p53 antibody (DO1)	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-126
Anti-PAX8 antibody	Proteintech, Manchester, UK	10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm	Corning, Berlin, Germany	430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2	Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria	658175
Collagenase I	Thermo Scientific, Waltham, USA	17018029
Costar 48-well Clear TC-treated	Corning, Berlin, Germany	3548
Cryo SFM	PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany	C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear	R&D systems, Minneapolis, USA	3533-005-02	Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson Immuno	715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	C9999-1000ML
DAPI	Thermo Scientific, Waltham, USA	62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Scientific, Waltham, USA	A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel	Thermo Scientific, Waltham, USA	Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene	Corning, Berlin, Germany	351447
Feather scalpel	Pfm medical, Cologne, Germany	200130010
Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	10270106
Formalin 37% acid free, stabilized	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1019205000
GlutaMAX	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	35050038
HEPES (1 M)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody	R&D systems, Minneapolis, USA	AF960
Human FGF10	Peprotech, NJ, USA	100-26
Human recombinant BMP2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHC7146
Human recombinant EGF	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1	Peprotech, NJ, USA	100-03
LAS X core Software	Leica Microsystems		https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope	Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	17502-048
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	N0636
Omnifix 1 mL	Braun, Melsungen, Germany	3570519
Paraffin
Parafilm	Omnilab, Munich, Germany	5170002
Paraformaldehyd	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	1176201000
Pen Strep	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	P4333-100
PluriStrainer 400 µm	PluriSelect, Leipzig, Germany	43-50400-01
Primocin	InvivoGen, Toulouse, France	ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	11814389001
Roticlear	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	A538.5
Surgipath Paraplast	Leica, Wetzlar, Germany	39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials	Thermo Scientific, Waltham, USA	375418PK
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8787
Trypan Blue Stain	Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany	T8154
TrypLE Express Enzyme	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA	12604-013
Tween-20	PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany	A4974-0100
Y-27632	TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany	1254
Zeocin	Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA	R25001