Ingegnerizzazione di cellule simili alla microglia indotte dal sangue umano per la ricerca cerebrale traslazionale inversa

Negli ultimi anni, è stato suggerito che l'infiammazione cerebrale assuma un ruolo fondamentale nella fisiopatologia di vari disturbi cerebrali e neuropsichiatrici; le microglia sono state evidenziate come cellule immunomodulatorie chiave dall'analisi cerebrale post mortem umana e dalle tecniche di bio-imaging basate sulla tomografia a emissione di positroni (PET) 1,2,3,4. Le analisi di imaging cerebrale e PET postmortem rivelano risultati significativi; Tuttavia, questi approcci sono inefficienti in termini di cattura delle attività molecolari dinamiche delle microglia umane nel cervello nella loro interezza. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per consentire la valutazione completa delle funzioni e delle disfunzioni della microglia umana a livello molecolare e cellulare.

Nel 2014, abbiamo originariamente ingegnerizzato una nuova tecnica per produrre cellule simili alla microglia indotte direttamente (iMG) ^5,6, prima della prima pubblicazione di cellule simili alla microglia derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) nel 2016⁷. In sole 2 settimane, abbiamo convertito con successo i monociti del sangue periferico umano in cellule iMG ottimizzando le citochine, il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e l'interleuchina 34 (IL-34). Quando abbiamo sviluppato questa tecnica, l'innovativo metodo di riprogrammazione per indurre cellule neuronali da cellule iPS o fibroblasti stava appena iniziando a prevalere nel mondo 8,9,10,11. Tuttavia, a quel tempo, non era ancora stato riportato un metodo per indurre cellule microgliali derivate da iPS e si desiderava la generazione di un modello microgliale derivato da cellule somatiche umane. Poiché citochine come GM-CSF e IL-34, fattore stimolante le colonie di macrofagi, sono state riportate come necessarie per lo sviluppo e il mantenimento della microglia 12,13,14,15, abbiamo ipotizzato che una combinazione di queste citochine potrebbe essere applicata direttamente per generare un modello cellulare microgliale da monociti del sangue. Infine, siamo riusciti a sviluppare un modello di microglia derivato dai monociti combinando GM-CSF e IL-34⁵. Inoltre, alcune di queste combinazioni di citochine sono impiegate anche per indurre la microglia dalle cellule iPS ^7,16 e si presume che siano un fattore importante nell'acquisizione delle caratteristiche microgliali.

A differenza dei metodi iPSC, le cellule iMG non richiedono alcuna modificazione genetica e possono essere generate in brevissimo tempo mediante semplice induzione chimica, con conseguente riduzione dei tempi e dei costi finanziari. Inoltre, le cellule iMG non richiedono la riprogrammazione genetica, quindi riteniamo che le cellule iMG siano potenti cellule surrogate per valutare non solo i tratti ma anche gli stati della microglia umana. Nell'articolo iniziale sulla tecnica iMG nel 2014, abbiamo confermato che le cellule iMG mostrano un fenotipo di microglia umana, che può essere distinto dai monociti e dai macrofagi. Ad esempio, le cellule iMG hanno mostrato un rapporto di sovraespressione del recettore delle chemochine CX3C 1 (CX3CR1) e del recettore delle chemochine C-C di tipo 2 (CCR2) rispetto ai monociti e ai tipici marcatori della microglia, tra cui la proteina transmembrana 119 (TMEM 119) e il recettore purinergico P2RY12 ^5,17. Recentemente, abbiamo convalidato che le cellule iMG derivate dal sangue periferico assomigliano alla microglia cerebrale nel loro profilo di espressione genica di marcatori microgliali ben noti nello stesso paziente che ha subito interventi chirurgici al cervello¹⁸. Le cellule iMG possono essere analizzate per funzioni dinamiche a livello molecolare, come la fagocitosi e la produzione di citochine, e si prevede che compensino gli svantaggi della ricerca cerebrale post-mortem e degli studi PET.

Abbiamo scoperto meccanismi fisiopatologici dinamici precedentemente sconosciuti che coinvolgono la microglia in pazienti con diagnosi di malattia di Nasu-Hakola⁵, fibromialgia¹⁹, disturbo bipolare^20,21 o malattia di Moyamoya²². Inoltre, sulla base della nostra metodologia originale, vari laboratori hanno impiegato le cellule iMG (alcuni laboratori hanno designato nomi alternativi a queste cellule) come strumento cruciale di ricerca traslazionale inversa 23,24,25,26,27. Sellgren et al. hanno generato con successo cellule iMG in conformità con le nostre raccomandazioni e hanno condotto un'analisi di microarray, che ha rivelato che queste cellule assomigliano molto alla microglia cerebrale umana²³. Recentemente, abbiamo confermato la somiglianza tra le cellule iMG umane e la microglia primaria cerebrale utilizzando il sequenziamento dell'RNA¹⁸.

Questo studio mirava a documentare la metodologia per generare cellule iMG dal sangue periferico umano per facilitare la ricerca traslazionale inversa incentrata sulle malattie neuropsichiatriche. Questa tecnica presenta il potenziale come uno strumento analitico ragionevole in grado di produrre senza sforzo modelli cellulari microgliali in un breve periodo, anche in laboratori mal attrezzati che mancano di apparecchiature di trasferimento genico o personale competente.

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Kyushu e ha rispettato tutte le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti, compresi i volontari sani e i pazienti, per analizzare il loro sangue e pubblicare i loro dati. I materiali e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei materiali e le composizioni delle soluzioni sono dettagliate nella Tabella 1.

1. Preparazione di terreni e tamponi per esperimenti

1. Preparare il mezzo di isolamento integrando RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (56 °C, 30 min) e l'1% di penicillina-streptomicina.
2. Preparare il tampone di isolamento integrando la soluzione tampone basica con una soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e sterilizzarla mediante filtrazione (0,22 μm).

2. Isolamento di cellule mononucleate da sangue intero

1. Trasferire 15 mL del terreno a gradiente di densità in una provetta da centrifugazione a gradiente di densità da 50 mL e centrifugare a 1.000 × g per 1 minuto a 20 °C.
   NOTA: Isolare 15 mL di sangue per provetta da centrifugazione a gradiente di densità da 50 mL. Aumentare il numero di provette quando il volume del sangue è elevato.
2. Omogeneizzare il sangue raccolto nelle provette per eparina mediante inversione e rimuovere il coperchio dalla provetta per la raccolta del sangue con una pinzetta sterilizzata a fuoco.
3. Erogare un volume uguale (10-15 mL) di sangue al mezzo del gradiente di densità nella provetta per centrifugazione a gradiente di densità.
4. Impostare il livello di decelerazione della centrifuga su 1 dei 4 livelli e centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: A questa velocità di decelerazione, una velocità di rotazione di 180 × g (1.000 giri/min) si arresta in 3 minuti.
5. Preparare un numero di provette da centrifuga da 50 mL uguale a quello delle provette da centrifugazione a gradiente di densità da 50 mL e riempire ciascuna provetta con 10 mL di PBS (-).
6. Rimuovere lo strato superiore di plasma fino a circa 1 cm sopra il buffy coat dopo la centrifugazione.
   NOTA: Inserire una pipetta di aspirazione verticalmente nella provetta e aspirare con cautela dal centro della superficie del liquido. Non aspirare eccessivamente per evitare di disturbare il buffy coat.
7. Decantare tutto il surnatante rimanente dalla provetta per centrifugazione in gradiente di densità da 50 mL in una provetta da centrifuga contenente 10 mL di PBS (-).
8. Ripristinare il livello di decelerazione della centrifuga su 3 livelli su 4 e centrifugare a 250 × g per 10 minuti a RT. Durante questa fase, preparare una provetta da centrifuga da 50 ml e due da 15 ml e un filtro cellulare da 100 μm.
9. Dopo la centrifugazione, stabilire la temperatura della centrifuga a 4 °C. Cerca un pellet bianco con una periferia rossa sul fondo del tubo da centrifuga. Rimuovere il surnatante per aspirazione e allentare delicatamente il pellet picchiettando.
10. Posizionare un filtro cellulare da 100 μm sulla provetta conica da 50 ml utilizzando una pinzetta sterilizzata a fuoco.
11. Incorporare 13 mL di terreno isolante in una delle provette centrifugate e lavare la parete interna per raccogliere correttamente le cellule. Prelevare la sospensione cellulare e lavare le restanti provette da centrifuga in modo consecutivo. Dopo aver raccolto le cellule da tutte le provette, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare nella provetta conica da 50 mL.
    NOTA: Il mezzo di isolamento deve essere raffreddato durante tutto il processo di isolamento (passaggi 2.11-2.16).
12. Lavare nuovamente ogni provetta con 13 mL di terreno isolante come descritto al punto 2.11. Raccogliere un totale di 26 mL di sospensione cellulare.
13. Erogare quantità uguali in due provette coniche da 15 mL, enumerare le cellule e calcolare la concentrazione appropriata di tampone di isolamento (60 μl di tampone per 10⁷ cellule totali) per il passaggio 2.16.
    NOTA: È meglio lavorare con la provetta conica da 15 mL perché il volume del liquido è piccolo e il liquido bolle facilmente durante il pipettaggio al punto 2.16.
14. Centrifugare a 250 × g per 10 min a 4 °C.
15. Durante la centrifugazione, disinfettare accuratamente il supporto magnetico (soprattutto la parte a contatto con la colonna) con etanolo al 70% e posizionarlo sul banco ad asciugare all'aria. Mantenere il buffer di isolamento sul ghiaccio.
16. Rimuovere il surnatante per aspirazione (in questa fase, cercare pellet rossi di ~1 mm di spessore a causa della presenza di globuli rossi), aggiungere la quantità appropriata di tampone di isolamento e allentare delicatamente il pellet pipettando ~20x.

3. Isolamento dei monociti mediante microsfere CD11b

1. Vortex umano Reagente bloccante FcR per 10 s prima dell'applicazione. Incorporare la quantità necessaria di reagente (20 μl di reagente bloccante FcR per 10-7 cellule totali) e incubare in una camera a 4 °C per 5 minuti.
2. Agitare le microsfere CD11b per 10 s prima dell'applicazione. Incorporare la quantità necessaria di reagente (20 μl di microsfere CD11b per 10⁷ cellule totali) e incubare in una camera a 4 °C per 20 minuti, agitando a mano ogni 5 minuti.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 mL di tampone di isolamento, sospendere con pipettaggio delicato e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
4. Durante la centrifugazione, posizionare la colonna magnetica sul supporto magnetico e sciacquarla con 3 mL di tampone isolante.
   NOTA: Astenersi dal toccare la parte magnetica della colonna e posizionare correttamente la colonna. Se le bolle entrano nella colonna, rimuoverle con una pipetta. Il tampone di isolamento deve essere raffreddato durante tutto il processo di isolamento (passaggi 3.4-3.9).
5. Rimuovere il surnatante post-centrifugazione mediante aspirazione, incorporare 1 mL di tampone isolante, miscelare pipettando delicatamente e applicare la sospensione sulla colonna.
6. Lavare la colonna 3 volte aggiungendo 3 mL di tampone di isolamento ogni volta che il serbatoio della colonna è vuoto.
7. Posizionare la colonna in una provetta conica da 15 mL senza toccare la parte magnetica; incorporare 5 mL di tampone di isolamento nella colonna e forzare il liquido fuori attraverso la colonna con uno stantuffo inserito nella provetta.
8. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta nella provetta a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
9. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di isolamento. Poiché verrà recuperato ~5-10% del numero di cellule contate nel passaggio 2.13, regolare il volume della sospensione in base al numero di cellule.
   NOTA: Il mezzo di isolamento deve essere utilizzato a RT e non riscaldato per evitare un rapido cambiamento di temperatura da 4 °C.
10. Enumerare le cellule e aliquotare 500 μl di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti a una concentrazione di 40 × 10⁴ cellule/mL e incubare durante la notte.
    NOTA: Le sospensioni cellulari devono essere pipettate in modo appropriato in base al volume di semina regolato richiesto per le diverse piastre. Ad esempio, 1 mL per un pozzetto in una piastra a 12 pozzetti e 250 μL per un pozzetto in un vetrino a camera a 8 pozzetti.
11. Infine, smaltire o disinfettare le apparecchiature contaminate in conformità con la politica per la gestione dei rifiuti infettivi stabilita dallo stabilimento.

4. Induzione di cellule iMG da monociti

1. Preparare il terreno di induzione integrando il terreno di induzione basale con una soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 10 ng/mL di GM-CSF umano ricombinante e 100 ng/mL di IL-34 umano ricombinante.
2. Sostituire il terreno isolante della semina del giorno precedente con un mezzo di induzione. Inclinare la piastra in avanti e aspirare prontamente il terreno esaurito dal bordo anteriore del fondo del pozzetto con una pipetta Pasteur. Sostituire il fluido al ritmo di un massimo di 1 piastra (= 24 pozzetti) alla volta e incorporare immediatamente delicatamente 500 μl di terreno di induzione.
   NOTA: In questo passaggio è necessario selezionare i monociti aderiti.
3. Incubare le cellule per 14 giorni per completare l'induzione.
4. Sostituire nuovamente il terreno con 500 μl di terreno di induzione dopo 14 giorni. Successivamente, per il mantenimento post-induzione delle cellule, sostituire il terreno di induzione con 500 μL di terreno di induzione fresco ogni settimana.

5. Immunocitochimica

1. Estrarre il terreno dal vetrino della camera a 8 pozzetti seminato con le cellule al passaggio 3.10 mediante aspirazione e risciacquare con PBS (-).
2. Fissare le cellule per 20 minuti a RT con il 4% di paraformaldeide.
3. Rimuovere il reagente fissativo e sciacquare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS (-).
4. Permeabilizzare le cellule con PBS (-) contenente lo 0,1% di Triton X-100 a RT.
5. Incubare le cellule permeabilizzate con una soluzione bloccante (3% BSA/PBS (-)) per 1 ora a RT.
6. Incubare le cellule per una notte con anticorpi primari (Tabella dei materiali) a 4 °C.
   NOTA: Tutti gli anticorpi sono diluiti in soluzione bloccante.
7. Sciacquare le celle per 3 x 5 minuti con PBS (−) per 5 minuti ciascuna.
8. Incubare le cellule risciacquate con gli anticorpi secondari marcati in fluorescenza appropriati per 1 ora a RT (Table of Materials).
9. Sciacquare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS (-) per rimuovere gli anticorpi secondari.
10. Incubare le cellule con la soluzione DAPI (1:10.000) diluita con PBS (-) per 5 minuti a RT.
11. Sciacquare le celle per 3 x 5 minuti con PBS (-).
12. Montare il pozzetto utilizzando il mezzo di montaggio e visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza.

È importante sottolineare che esiste una grande eterogeneità a livello di persona e di temporizzazione nei caratteri delle cellule iMG, comprese le morfologie e le espressioni geniche. Le cellule iMG in alcuni individui assumono un aspetto ramificato numeroso (Figura 1A), mentre in altri rimangono sferiche (Figura 1B). Le caratteristiche dell'iMG possono differire anche all'interno di un singolo individuo, rendendo le cellule iMG uno strumento fondamentale per rilevare i biomarcatori dello stato della malattia. Al contrario, l'esame di tali differenze interindividuali giustifica la riduzione degli errori tecnici. Le cellule iMG sono definite come monociti indotti con GM-CSF e IL-34 per un minimo di 14 giorni. Per ridurre al minimo gli errori tecnici, si consiglia di standardizzare il tempo di induzione, utilizzare le stesse quantità di reagenti e astenersi dall'utilizzare reagenti scaduti.

La convalida dell'immunocolorazione conferma anche che le cellule iMG esprimono marcatori microgliali, tra cui P2RY12 e TMEM119 (Figura 2). Ricerche precedenti hanno dimostrato che le caratteristiche morfologiche e di espressione genica delle cellule iMG sono associate alla fisiopatologia del disturbo bipolare20,21. Le cellule ramificate più precoci sono state osservate il giorno 3 dopo il trattamento con GM-CSF e IL-34, e le cellule iMG in condizioni ottimali possono sopravvivere per più di 1 mese quando il cambio del terreno viene effettuato una volta alla settimana. Le cellule iMG possono essere utilizzate per l'analisi dell'espressione genica. Ad esempio, sotto stimolazione con interferone gamma o IL-4, le cellule iMG hanno modificato il modello di espressione genica, che può essere utilizzato per la valutazione funzionale delle microglia polarizzate M1 e M2 5,22. Inoltre, le perle FITC innescano modificazioni morfologiche simili alle ameboidi e sovraregolano l'espressione del TNFα e di altri geni5. Inoltre, la fagocitosi può essere valutata misurando l'intensità della fluorescenza delle perle 5,22. Inoltre, poiché le cellule iMG sono cellule vitali, il loro movimento effettivo e le alterazioni morfologiche possono essere osservate scattando foto cellulari (Figura 3) o attraverso la fotografia time-lapse (Video 1).

Figura 1: Morfologia delle cellule iMG . (A) Le tipiche iMG ramificate mostravano minuscoli corpi soma e numerosi collaterali ramificati. (B) Alcuni campioni variavano nell'aspetto, come il tipo ameboide. Barra graduata, 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immunocitocolorazione delle cellule iMG . Le cellule iMG esprimono marcatori microgliali tipici: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barra della scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Modificazioni morfologiche nelle cellule iMG . Le iMG alterano la loro morfologia durante il processo di induzione. Le protrusioni cellulari compaiono (A) intorno al giorno 3 e si allungano nei giorni (B) 7 e (C) 14 man mano che l'induzione procede. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Fotografia time-lapse di cellule iMG. La cellula iMG ramificata al centro sembrava stabilire un contatto con le cellule circostanti mentre estendeva e contraeva i loro processi. Inoltre, la cellula ha eseguito la fagocitosi delle cellule danneggiate. Gli intervalli di acquisizione delle immagini sono stati di 46 secondi e il tempo di ripresa è stato di circa 14 ore. Clicca qui per scaricare questo video.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.