Rilevamento dei microrganismi ambientali tramite PCR ed elettroforesi su gel

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica biologica fondamentale ampiamente applicata per rilevare e identificare i microrganismi presenti nel suolo, nell'acqua e in altri campioni ambientali.

Classicamente, i microrganismi vengono coltivati in laboratorio utilizzando terreni di crescita specializzati. Tuttavia, molti microbi nell'ambiente naturale sono "non coltivabili", sia perché hanno un'attività metabolica o un tasso di crescita molto bassi, sia perché hanno requisiti di crescita molto rigorosi che potrebbero non essere replicabili in un piatto di coltura. Le differenze nella coltivabilità tra i microbi significano anche che, quando i microrganismi di un campione ambientale vengono coltivati, la loro abbondanza relativa in coltura potrebbe non riflettere i loro livelli effettivi nell'ambiente.

L'avvento della PCR, in grado di amplificare in modo specifico anche piccole quantità di DNA presenti in un campione misto, consente di rilevare e identificare rapidamente specifici microbi di interesse, anche non coltivabili, all'interno del complesso assortimento di organismi presenti in un campione ambientale.

Questo video introdurrà i principi della PCR. Verrà quindi discusso un protocollo generale per l'esecuzione della PCR su DNA isolato da un campione ambientale al fine di rilevare la presenza di un organismo di interesse. Infine, verranno esplorate diverse applicazioni dell'identificazione dei microbi basata sulla PCR.

La premessa di base della PCR è quella di utilizzare cicli ripetuti di variazioni di temperatura sequenziali per ottenere l'amplificazione esponenziale del DNA, di solito con una macchina nota come termociclatore per scorrere automaticamente le diverse temperature. La sintesi del DNA è effettuata dagli enzimi DNA polimerasi che si ottengono da batteri che vivono nelle sorgenti termali, come il Thermus aquaticus o "Taq". Queste polimerasi sono stabili al calore, consentendo loro di resistere alle alte temperature utilizzate durante la PCR.

La sequenza bersaglio, nota come amplicona, viene amplificata dal modello di DNA utilizzando due brevi tratti di nucleotidi noti come "primer". A causa dell'elevata specificità del legame complementare degli acidi nucleici, i primer consentono l'amplificazione mirata di sequenze molto specifiche di interesse. Progettando primer che amplificheranno solo una sequenza unica, o una combinazione unica di sequenze, da un organismo di interesse, la PCR può essere utilizzata per rilevare in modo differenziale la presenza del DNA di quell'organismo tra tutti i materiali genetici presenti in un campione ambientale complesso.

Ogni ciclo di PCR è suddiviso in tre fasi. La prima, nota come "denaturazione", è solitamente impostata sopra 92 ? C e dura circa 30 s. La denaturazione viene utilizzata per rompere le molecole di DNA in singoli filamenti, per consentire alla reazione di amplificazione di procedere.

La seconda fase, "ricottura", è impostata da 2 a 3 ? C al di sotto della temperatura di fusione più bassa dei due inneschi, di solito tra 50 e 65 ? C, e dura anche circa 30 s. La temperatura di fusione è la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA a doppio filamento si sono separate in singoli filamenti, e quindi la fase di ricottura consente ai primer di legarsi ai loro siti target nel modello di DNA.

La terza fase di un ciclo di PCR è l'"allungamento" o "estensione", quando la DNA polimerasi si lega al duplex primer-stampo e catalizza la sintesi dei nuovi filamenti. Impostato a 72 ? C per la polimerasi PCR più comunemente usata, Taq, la durata di questa fase dipende dalla lunghezza dell'amplicona, solitamente 30 s per 500 paia di basi. Dopo ogni ciclo, il DNA amplificato viene nuovamente denaturato e funge da nuovo modello, portando a un aumento esponenziale della quantità di prodotti PCR.

Una volta completata la reazione, i prodotti della PCR possono essere risolti in base alle dimensioni su un "gel" solitamente costituito dal polimero agarosio, un processo noto come elettroforesi. Un campo elettrico viene applicato attraverso il gel e le cariche negative nella spina dorsale delle molecole di DNA le fanno migrare verso l'estremità positiva del campo. In generale, le molecole di DNA lineari più grandi impiegheranno più tempo a viaggiare attraverso la matrice gel.

Ora che hai capito come funziona la PCR, diamo un'occhiata a come la reazione può essere utilizzata per identificare i microrganismi in un campione ambientale.

Per iniziare, calcolare il volume di ciascun reagente necessario in base al numero di campioni da trattare, più un ulteriore 10% per tenere conto degli errori di pipettaggio. Dovrebbe essere incluso un modello di controllo positivo, che contiene la regione target, per garantire che la reazione funzioni; nonché un controllo negativo in cui non è incluso alcun modello di DNA, al fine di escludere la contaminazione in uno qualsiasi dei componenti della reazione. Mantenere l'enzima polimerasi Taq sul ghiaccio e scongelare il resto dei reagenti e i campioni di DNA a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare designata per prevenire la contaminazione.

Una volta che tutti i reagenti si sono scongelati, costituire la "miscela master" del reagente aggiungendo il volume calcolato di ciascun reagente in una provetta a microfuga a basso legante, che riduce al minimo le discrepanze nelle quantità di reagenti dovute all'adsorbimento delle molecole sulla superficie della provetta. Agitare delicatamente e centrifugare ogni reagente prima di aggiungerlo. Una volta preparata la miscela master, vorticare per mescolare e raccogliere per centrifugazione.

Etichettare una striscia PCR da 8 provette per designare una provetta per ogni campione, compresi i controlli. Erogare la quantità appropriata di miscela master PCR in ciascuna provetta della striscia. Quindi, aggiungere ciascun campione di DNA alla rispettiva provetta.

Posizionare saldamente il tappo della striscia sulla provetta della striscia e centrifugare brevemente in una mini-centrifuga con un adattatore per la striscia. Quindi, posizionare la provetta nel termociclatore ed eseguire la reazione secondo il programma PCR appropriato.

Durante l'esecuzione della PCR, preparare un gel di agarosio per l'elettroforesi dei prodotti PCR. Pesare una quantità appropriata di polvere di agarosio per un gel con una concentrazione in grado di risolvere i prodotti PCR in base alle dimensioni previste. Aggiungere l'agarosio in un pallone da 125 ml, quindi aggiungere il volume appropriato di tampone per la corsa del gel nel pallone, in base al volume del getto di gel, e agitare per mescolare. Microonde la soluzione di agarosio ad alta potenza per 1 minuto. Al termine, verificare che l'agarosio si sia completamente sciolto agitando il pallone e, se necessario, ripetere il microonde con incrementi di 30 secondi.

Fissare saldamente il tappo sul pallone e raffreddare la soluzione di agarosio a 50 ? C agitando il pallone sotto l'acqua fredda corrente. Una volta raffreddato, aggiungere 1 ? L di bromuro di etidio all'agarosio. Poiché il bromuro di etidio è potenzialmente cancerogeno, assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale come occhiali, camice da laboratorio e guanti resistenti al bromuro di etidio.

Versare la soluzione di agarosio in un vassoio di colata di gel per elettroforesi, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria all'interno dell'agarosio. Inserire un pettine con il numero richiesto di pozzetti nella soluzione. Lasciare il gel a temperatura ambiente per 20-30 minuti per solidificare. Una volta che il gel è solidificato, rimuovere con cura il pettine, assicurandosi di non strappare il gel durante il processo.

Posizionare il gel solidificato nella camera di elettroforesi. Aggiungere il tampone LB nella camera fino a quando il gel non è appena sommerso. Su un pezzo di Parafilm, pipettare un "punto" di scala di DNA di un intervallo adatto alle dimensioni previste dei prodotti PCR. Recuperare le provette per PCR con le reazioni completate dal termociclatore. Raccogliere le condense nelle provette per PCR mediante breve centrifugazione e aggiungere 8 ? L di ogni campione sul Parafilm. Aggiungere 2 ? L di 10x caricando il colorante in ogni punto del prodotto PCR, in modo che la concentrazione finale del colorante sia 2x.

Caricare i campioni e la scala nei pozzetti designati nel gel di agarosio, facendo attenzione a non infilare il gel. Una volta completato il caricamento, mettere il coperchio della camera di elettroforesi e collegare gli elettrodi all'alimentazione. Poiché il DNA è caricato negativamente e migra verso l'elettrodo positivo, assicurati che i pozzetti siano sul lato più vicino all'elettrodo negativo. Accendere l'alimentatore e impostarlo su una tensione appropriata per le dimensioni della camera di elettroforesi e del sistema tampone in uso. Impostare l'elettroforesi su "run". Se l'elettroforesi procede correttamente, si osservano piccole bolle che si muovono lungo i lati della camera.

Una volta che il fronte del colorante è avanzato abbastanza in basso nel gel, spegnere l'alimentazione. Trasportare con cura il gel in un gel imager per visualizzare i prodotti elettroforizzati. Con uno scudo protettivo, accendi la luce UV e visualizza le bande di DNA sul gel. Analizzare la posizione delle bande per vedere se corrisponde al modello previsto che indica la presenza della specie di interesse nel campione ambientale.

Ora che hai visto come viene eseguita la PCR, diamo un'occhiata ai vari modi in cui viene applicata per rilevare i microrganismi di interesse nell'ambiente.

Un uso del rilevamento microbico ambientale basato sulla PCR è quello di identificare organismi patogeni come l'ameba mangia-cervello Naegleria fowleri, un organismo unicellulare che si trova nei corpi idrici dolci e nelle pozze non clorurate che può attaccare il sistema nervoso umano, spesso fatalmente. La presenza di questo microbo mortale nei campioni d'acqua o nel liquido cerebrospinale di pazienti sospetti può essere testata eseguendo la PCR utilizzando primer che mirano a sequenze di DNA uniche nel genoma dell'ameba.

Un'altra applicazione per l'identificazione microbica basata sulla PCR è quella di testare la presenza di batteri patogeni nelle mosche catturate nelle vicinanze degli stabilimenti alimentari, nell'ambito del monitoraggio della salute pubblica e delle indagini sui focolai di malattie.

Qui, i ricercatori hanno cercato la presenza di batteri patogeni come la Salmonella e la Listeria, isolando prima i batteri sia dalla superficie corporea che dal canale digestivo delle mosche, e poi utilizzando le condizioni di coltura specie-specifiche per arricchire queste specie di interesse. Dopo aver estratto il DNA da tutti i batteri coltivati, sono stati utilizzati kit PCR di rilevamento specie-specifici disponibili in commercio per testare la loro identità.

Infine, diversi ceppi di batteri patogeni resistenti agli antibiotici come lo Staphylococcus aureus, che presentano gravi problemi di salute pubblica, possono essere identificati e differenziati con la PCR.

In questo esempio, i ricercatori hanno isolato e coltivato S. aureus da campioni clinici, quindi hanno estratto il DNA dalle colonie batteriche e hanno eseguito la PCR. Le reazioni di amplificazione qui sono state "multiplexate", il che significa che più set di primer mirati a diverse regioni uniche del genoma batterico sono stati combinati nella stessa reazione. I singoli set di primer sono stati progettati in modo che i prodotti PCR derivino dal DNA solo di alcuni ceppi ma non di altri, in modo che in combinazione siano stati osservati modelli di bande di prodotto unici per ciascun ceppo.

Hai appena visto il video di JoVE sul rilevamento dei microrganismi basato sulla PCR. Abbiamo esaminato i principi alla base della reazione a catena della polimerasi; un protocollo per l'esecuzione di PCR su DNA estratto da microrganismi ambientali; e infine, diverse applicazioni specifiche di questa tecnica per testare organismi di interesse in diversi tipi di campioni ambientali o clinici. Grazie per l'attenzione!