Rilevamento dei microrganismi ambientali tramite PCR ed elettroforesi su gel

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogli il terreno usando una coclea o una pala fino a una determinata profondità. Se si raccoglie il terreno dalla rizosfera (la stretta regione del suolo circostante e influenzata dalle radici delle piante e dai loro microbi associati), raccogliere solo direttamente dalle radici delle piante colpendo il terreno in un barile di raccolta.
2. Raccogliere il campione d'acqua immergendo una bottiglia di plastica sterile nell'acqua tenendo l'estremità del bastoncino di immersione.

2. Estrazione e preparazione degli acidi nucleici

1. Raccogli organismi e virus dal campione ed estrai DNA e RNA da loro. Per i dettagli, si prega di fare riferimento al video Di JoVE Science Education sull'estrazione dell'acido nucleico della comunità.
2. Conservare il DNA estratto in tubi di microfuga etichettati. Se il DNA deve essere conservato durante la notte o per periodi di tempo più lunghi, congelarlo a -20 °C e scongelare i tubi a temperatura ambiente quando sono pronti per l'uso.
3. Se il materiale genetico da dosare è l'RNA (che si tratti del genoma dei virus a RNA o dell'RNA trascritto degli organismi cellulari), eseguire la trascrizione inversa (RT) sul campione per creare DNA complementare (cDNA) prima di procedere alla PCR. Per i dettagli, fare riferimento al video JoVE Science Education su RT-PCR.

3. Reazione a catena della polimerasi

1. Posizionare l'enzima PCR(ad esempio, Taq polimerasi) sul ghiaccio e scongelare gli altri reagenti (tampone PCR, dNTP, primer) all'interno di una cappa "pulita" designata a temperatura ambiente. L'enzima viene immagazzinato a -20 °C ma non si congela mai. È sensibile alla temperatura e quindi deve essere mantenuto fresco e la sua esposizione alla temperatura ambiente ridotta al minimo
2. Calcolare il volume di ciascun reagente necessario per fare un "master mix" di tutti i reagenti che sono costanti tra tutte le reazioni (Tabella 1). Assicurati di tenere conto dei controlli positivi(ad esempio,un modello noto per contenere la regione di destinazione) e negativi(ad esempio,nessun modello) nei calcoli. Aggiungere un ulteriore 10% al volume finale per tenere conto dell'errore di pipettaggio. I volumi di primer dipendono dai saggi per organismi specifici; fare riferimento alla letteratura pubblicata per i valori appropriati.
3. Utilizzando un tubo di microfuga a bassa legatura, che riduce al minimo l'adesione delle molecole di reagente alle pareti di plastica, aggiungere i volumi calcolati di ciascun reagente per assemblare la miscela principale. Vortice delicato e centrifuga ogni reagente prima di aggiungerlo. Una volta preparata la miscela master, vortice per mescolare e raccogliere per centrifugazione
4. Preparare strisce PCR a 8 tubi. Designare una provetta per ciascun campione, compresi i controlli positivi e negativi
5. Erogare il volume appropriato di miscela PCR in ciascun tubo della striscia
6. Aggiungere il volume appropriato di modello di DNA dai campioni, così come 5 μL del modello positivo e 5 μL di acqua di grado molecolare come controllo negativo, nei rispettivi tubi PCR.
7. Posizionare saldamente il tappo sulla striscia a 8 tubi e centrifugare per alcuni secondi utilizzando una minicentrifuga
8. Posizionare la striscia a 8 tubi in un termociclatore
9. Impostare il programma PCR appropriato per l'esecuzione sul termociclatore. Un programma tipico è costituito dai seguenti
   1. Denaturazione a 94 °C per 3 min.
   2. 30-40 cicli di amplificazione: denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura a temperatura specifica del primer (di solito tra 50-60 °C) per 30 s ed estensione a 72 °C per 30 s / 500 bp.
   3. Estensione finale a 72 °C per 7-10 min.

4. Preparazione del gel di agarose

1. In base al volume di gel desiderato e alla concentrazione di gel (Tabella 2), pesare la quantità appropriata di acarosio in polvere in un matraccio Erlenmeyer da 125 mL.
2. Aggiungere il volume appropriato di tampone gel-running nel matraccio e ruotare il pallone a mano.
3. Riscaldare la miscela tampone-agarose in un forno a microonde ad alta potenza per 1 minuto.
4. Togliere il pallone dal microonde e ruotare a mano per assicurarsi che tutto l'agarose si sia sciolto. Se l'agarose non si è completamente dissolto, ripetere il microonde con incrementi di 30 secondi.
5. Dopo aver fissato saldamente il tappo sul matraccio, raffreddarlo a 50 °C ruotando sotto l'acqua corrente fredda.
6. Aggiungere 1 μL di bromuro di etidio (EtBr) alla miscela di agarose usando una micropippetta designata per EtBr. EtBr è un colorante che lega gli acidi nucleici a doppio filamento e l'arancione quando illuminato con luce UV. Si noti che EtBr è potenzialmente cancerogeno, quindi i dispositivi di protezione individuale (occhiali, camice da laboratorio, guanti resistenti all'EtBr) devono essere indossati.
7. Versare il gel fuso in un vassoio di fusione del gel per elettroforesi. Assicurati che nessuna bolla sia intrappolata all'interno dell'agarose. Mettere un pettine nel gel e bloccare saldamente. Attendere circa 20-30 minuti affinché il gel si solidifichi.
8. Una volta che il gel si è solidificato, rimuovere il pettine con attenzione senza causare strappi nel gel. Il pettine crea dei pozzi nel gel per il caricamento dei campioni.

5. Elettroforesi su gel

1. Posizionare il gel di agarose solidificato nella camera di elettroforesi.
2. Aggiungere il buffer di corsa appropriato nella camera fino a quando il gel non è appena immerso.
3. Su un pezzo di Parafilm, punti di pipetta di carico del colorante concentrato. Includere anche una scala DNA di una gamma adatta per le dimensioni previste dei prodotti PCR. In alternativa, utilizzare un nuovo set di provette per microfughe, una per ogni campione.
4. Una volta completata la PCR, recuperare quella striscia di 8 tubi dal termociclatore e centrifugare brevemente per raccogliere eventuali condensati. Aggiungere un volume appropriato di prodotto DNA al colorante di carico e pipettare su e giù per mescolare. Ad esempio, 2 μL di colorante di carico 10x vengono miscelati con 8 μL di campione per dare un volume finale di 10 μL, con il colorante a 1x.
5. Pipettare ogni miscela colorante-campione nei pozzette designati nel gel di agarose, facendo attenzione a non forare i pozzette.
6. Collegare gli elettrodi alla camera di elettroforesi. Il DNA è caricato negativamente, quindi "corre" verso l'elettrodo positivo. Pertanto, collegare l'elettrodo positivo al lato opposto della camera, dove sono stati caricati i pozzi. Impostare l'alimentatore su una tensione appropriata per il sistema tampone e le dimensioni della camera gel e impostarlo per funzionare. Piccole bolle dovrebbero essere visibili spostandosi verso l'alto i lati della camera se l'elettroforesi procede correttamente.
7. Una volta che il fronte del colorante è avanzato abbastanza in basso nel gel, spegnere l'alimentatore. Trasportare con attenzione il gel nel transilluminatore o nell'imager visivo e accendere la luce UV per visualizzare le bande di DNA sul gel.
8. Analizzare la dimensione della banda e le posizioni sul gel. Confrontare le posizioni delle bande dei campioni con il controllo positivo per determinare se il DNA dell'organismo di interesse è presente nel campione (Figura 1).

Componente	Volume per tubo(μL)	Volume per 5 tubi (μL)	Concentrazione finale
10x buffer Ex Taq	5.0	25	1x
2,5 mM dNTPs	4.0	20	0,2 mM
Primer in avanti*	2.0	10	400 nM
Primer inverso*	2.0	10	400 nM
Molecolare H2O	31.75	158.75	-
Ex Taq	0.25	1.25	2,5 U
Miscela PCR	45	225

Tabella 1. Volumi di reagenti per miscela master PCR. *I volumi di primer variano a seconda del test dell'organismo. Regolare il volume di acqua di grado molecolare per rendere il volume finale 45 μL. I volumi di altri componenti non dovrebbero variare.

% raccomandata di Agarose	Risoluzione ottimale per frammenti lineari di DNA (coppie di basi)
0.5	1,000-30,000
0.7	800-12,000
1.0	500-10,000
1.2	400-7,000
1.5	200-3,000
2.0	50-2,00

Tabella 2. Le dimensioni del frammento di DNA variano in modo ottimale da diverse percentuali di gel di agarose.