Rilevamento dei microrganismi ambientali tramite PCR ed elettroforesi su gel

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica biologica fondamentale che viene ampiamente applicata per rilevare e identificare i microrganismi presenti nel suolo, nell’acqua e in altri campioni ambientali.

Classicamente, i microrganismi vengono coltivati in laboratorio utilizzando mezzi di crescita specializzati. Tuttavia, molti microbi nell’ambiente naturale sono “non coltivabili” – sia perché hanno un’attività metabolica o un tasso di crescita molto bassi, sia perché hanno requisiti di crescita molto rigorosi che potrebbero non essere replicabili in un piatto di coltura. Le differenze nella coltivabilità tra i microbi significano anche che, quando i microrganismi di un campione ambientale vengono coltivati, la loro relativa abbondanza in coltura potrebbe non riflettere i loro livelli effettivi nell’ambiente.

L’avvento della PCR, che può amplificare in modo specifico anche piccole quantità di DNA presenti in un campione misto, permette di rilevare e identificare rapidamente specifici microbi di interesse, anche non coltivabili, all’interno del complesso assortimento di organismi presenti in un campione ambientale.

Questo video introdurrà i principi della PCR. Si discuterà poi di un protocollo generale per l’esecuzione della PCR su DNA isolato da un campione ambientale al fine di rilevare la presenza di un organismo di interesse. Infine, verranno esplorate diverse applicazioni dell’identificazione microbiche basata sulla PCR.

La premessa di base della PCR è quella di utilizzare cicli ripetuti di variazioni di temperatura sequenziali per ottenere l’amplificazione esponenziale del DNA, di solito con una macchina nota come termociclatore per passare automaticamente attraverso le diverse temperature. La sintesi del DNA viene effettuata da enzimi dna polimerasi che sono ottenuti da batteri che vivono in sorgenti termali, come Thermus aquaticus o “Taq”. Queste polimerasi sono stabili al calore, consentendo loro di resistere alle alte temperature utilizzate durante la PCR.

La sequenza bersaglio, nota come amplicon, viene amplificata dal modello di DNA utilizzando due brevi tratti di nucleotidi noti come “primer”. A causa dell’elevata specificità del legame degli acidi nucleici complementari, i primer consentono l’amplificazione mirata di sequenze di interesse molto specifiche. Progettando primer che amplifichino solo una sequenza unica, o una combinazione unica di sequenze, da un organismo di interesse, la PCR può essere utilizzata per rilevare in modo differenziale la presenza del DNA di quell’organismo tra tutti i materiali genetici presenti in un campione ambientale complesso.

Ogni ciclo di PCR è diviso in tre fasi. La prima, nota come “denaturazione”, è solitamente impostata sopra i 92 °C e dura circa 30 s. La denaturazione viene utilizzata per rompere le molecole di DNA in singoli filamenti, per consentire alla reazione di amplificazione di procedere.

La seconda fase, la “ricottura”, è impostata da 2 a 3 °C al di sotto della temperatura di fusione più bassa dei due primer, di solito tra 50 e 65 °C, e dura anche circa 30 s. La temperatura di fusione è la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA a doppio filamento si sono separate in singoli filamenti, e quindi la fase di ricottura consente ai primer di legarsi ai loro siti bersaglio nel modello di DNA.

La terza fase di un ciclo PCR è “allungamento” o “estensione”, quando la DNA polimerasi si lega al duplex primer-template e catalizza la sintesi dei nuovi filamenti. Impostata a 72 °C per la PCR polimerasi più comunemente usata, Taq, la durata di questa fase dipende dalla lunghezza dell’amplicon, di solito 30 s per 500 parti di base. Dopo ogni ciclo, il DNA amplificato viene nuovamente denaturato e funge da nuovo modello, portando ad un aumento esponenziale della quantità di prodotti PCR.

Una volta completata la reazione, i prodotti PCR possono essere risolti per dimensione su un “gel” solitamente costituito dal polimero agarose, un processo noto come elettroforesi. Un campo elettrico viene applicato attraverso il gel e le cariche negative nella spina dorsale delle molecole di DNA le fanno migrare verso l’estremità positiva del campo. In generale, le molecole di DNA lineare che sono più grandi impiegheranno più tempo a viaggiare attraverso la matrice del gel.

Ora che hai capito come funziona la PCR, diamo un’occhiata a come la reazione può essere utilizzata per identificare i microrganismi in un campione ambientale.

Per iniziare, calcola il volume di ciascun reagente necessario in base al numero di campioni da elaborare, più un ulteriore 10% per tenere conto degli errori di pipettaggio. Un modello di controllo positivo – che contiene la regione target – dovrebbe essere incluso per garantire che la reazione funzioni; così come un controllo negativo in cui non è incluso alcun modello di DNA, al fine di escludere la contaminazione in uno qualsiasi dei componenti della reazione. Mantenere l’enzima Taq polimerasi sul ghiaccio e scongelare il resto dei reagenti e i campioni di DNA a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare designata per prevenire la contaminazione.

Una volta che tutti i reagenti si sono scongelati, costituiscono il “master mix” del reagente aggiungendo il volume calcolato di ciascun reagente in un tubo microfugo a basso legame, che riduce al minimo le discrepanze nelle quantità di reagenti dovute all’adsorbimento delle molecole sulla superficie del tubo. Vortice delicato e centrifuga ogni reagente prima di aggiungerlo. Una volta preparata la miscela master, vortice per mescolare e raccogliere per centrifugazione.

Etichettare una striscia PCR a 8 tubi per designare una provetta per ogni campione, compresi i controlli. Erogare la quantità appropriata di miscela master PCR in ciascun tubo della striscia. Quindi, aggiungere ogni campione di DNA al rispettivo tubo.

Posizionare saldamente il tappo della striscia sul tubo della striscia e centrifugare brevemente in una mini-centrifuga con un adattatore per strisce. Quindi, posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire la reazione secondo il programma PCR appropriato.

Mentre la PCR viene eseguita, preparare un gel di agarose per l’elettroforesi dei prodotti PCR. Pesare una quantità appropriata di polvere di agarose per un gel con una concentrazione in grado di risolvere i prodotti PCR in base alle dimensioni previste. Aggiungere l’acarosio in un matraccio da 125 mL, quindi aggiungere il volume appropriato di tampone gel-running nel matraccio, in base al volume del gel fuso, e ruotare per mescolare. Microonde la soluzione di agarose ad alta potenza per 1 min. Una volta completato, verificare che l’agaroseo si sia completamente disciolto facendo roteare il pallone e ripetere il microonde con incrementi di 30 secondi, se necessario.

Fissare saldamente il tappo sul matraccio e raffreddare la soluzione di agarose a 50 °C facendo roteare il matraccio sotto l’acqua corrente fredda. Una volta raffreddato, aggiungere 1 μL di bromuro di etidio all’agarose. Poiché il bromuro di etidio è potenzialmente cancerogeno, assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale come occhiali, un cappotto da laboratorio e guanti resistenti al bromuro di etidio.

Versare la soluzione di agarose in un vassoio di fusione in gel per elettroforesi, assicurandosi che nessuna bolla d’aria sia intrappolata all’interno dell’agarose. Posizionare un pettine con il numero richiesto di pozzedi nella soluzione. Lasciare il gel a temperatura ambiente per 20-30 minuti per solidificare. Una volta impostato il gel, rimuovere con attenzione il pettine, assicurandosi di non strappare il gel nel processo.

Posizionare il gel solidificato nella camera di elettroforesi. Aggiungere il tampone LB nella camera fino a quando il gel non è appena immerso. Su un pezzo di Parafilm, pipettare un “punto” di scala di DNA di una gamma adatta per le dimensioni previste dei prodotti PCR. Recuperare i tubi PCR con le reazioni completate dal termociclatore. Raccogliere la condensa nei tubi PCR mediante breve centrifugazione e aggiungere 8 μL di ciascun campione sul parafilm. Aggiungere 2 μL di colorante di carico 10x in ogni punto del prodotto PCR, in modo che la concentrazione finale del colorante sia 2x.

Caricare i campioni e la scala nei pozzeggi designati nel gel di acarosio, facendo attenzione a non colpire attraverso il gel. Una volta completato il caricamento, mettere sul coperchio la camera di elettroforesi e collegare gli elettrodi all’alimentazione. Poiché il DNA è caricato negativamente e migra verso l’elettrodo positivo, assicurarsi che i pozzi siano sul lato più vicino all’elettrodo negativo. Accendere l’alimentatore e impostarlo su una tensione appropriata per le dimensioni della camera di elettroforesi e del sistema tampone in uso. Impostare l’elettroforesi su “run”. Piccole bolle che si muovono verso i lati della camera saranno osservate se l’elettroforesi procede correttamente.

Una volta che il fronte del colorante è avanzato abbastanza in basso nel gel, spegnere l’alimentatore. Trasportare con cura il gel a un imager di gel per visualizzare i prodotti elettroforati. Con uno scudo protettivo, accendi la luce UV e visualizza le bande di DNA sul gel. Analizzare la posizione delle bande per vedere se corrisponde al modello previsto che indica la presenza della specie di interesse nel campione ambientale.

Ora che hai visto come viene eseguita la PCR, diamo un’occhiata ai vari modi in cui viene applicata per rilevare microrganismi di interesse per l’ambiente.

Un uso del rilevamento microbico ambientale basato sulla PCR è quello di identificare organismi che causano malattie come l'”ameba mangia-cervello” Naegleria fowleri, un organismo unicellulare trovato in corpi idrici dolci e piscine non clorurate che possono attaccare il sistema nervoso umano, spesso fatalmente. La presenza di questo microbo mortale in campioni di acqua o nel liquido cerebrospinale di pazienti sospetti può essere testata eseguendo la PCR utilizzando primer che mirano a sequenze di DNA uniche nel genoma dell’ameba.

Un’altra applicazione per l’identificazione microbica basata sulla PCR è quella di testare la presenza di batteri patogeni nelle mosche catturate nelle vicinanze degli stabilimenti alimentari, come parte del monitoraggio della salute pubblica e delle indagini sui focolai di malattie.

Qui, i ricercatori hanno cercato la presenza di batteri patogeni come Salmonella e Listeria, isolando prima i batteri sia dalla superficie corporea che dal canale digestivo delle mosche, e quindi utilizzando condizioni di coltura specie-specifiche per arricchire queste specie di interesse. Dopo aver estratto il DNA da tutti i batteri che sono stati coltivati, sono stati utilizzati kit PCR di rilevamento specie-specifici disponibili in commercio per testare la loro identità.

Infine, diversi ceppi di batteri patogeni resistenti agli antibiotici come lo Staphylococcus aureus, che presentano importanti problemi di salute pubblica, possono essere identificati e differenziati con la PCR.

In questo esempio, i ricercatori hanno isolato e coltivato S. aureus da campioni clinici, quindi estratto il DNA dalle colonie batteriche ed eseguito la PCR. Le reazioni di amplificazione qui sono state “multiplexate”, il che significa che più set di primer mirati a diverse regioni uniche del genoma batterico sono stati combinati nella stessa reazione. I singoli set di primer sono stati progettati in modo che i prodotti PCR derivino dal DNA solo di alcuni ceppi ma non di altri, in modo che in combinazione siano stati osservati modelli di bande di prodotto unici per ciascun ceppo.

Hai appena visto il video di JoVE sul rilevamento di microrganismi basati sulla PCR. Abbiamo esaminato i principi alla base della reazione a catena della polimerasi; un protocollo per l’esecuzione della PCR su DNA estratto da microrganismi ambientali; e infine, diverse applicazioni specifiche di questa tecnica per testare organismi di interesse in diversi tipi di campioni ambientali o clinici. Grazie per l’attenzione!