La combinazione di innesto del nervo periferico e Matrix modulazione di riparare il cavo feriti Rat spinale

La preparazione per il trapianto di un nervo periferico in un sito di lesione del midollo spinale inizia con la pre-degenerazione del PNG da sette a dieci giorni prima del trapianto. Il ramo del nervo tibiale di un ratto donatore viene sezionato. Una emisezione a livello cervicale cinque o C cinque viene eseguita mediante aspirazione.

Il PNG viene rimosso dal ratto donatore e posizionato contro la parete rostrale della cavità della lesione, fissandolo mediante sutura d'oro alla dura madre. Tre settimane dopo, viene realizzata una lesione nel quadrante dorsale a livello di C sette; una spugna gelatinosa saturata con C-H-A-B-C viene inserita nella cavità per 15 minuti al fine di digerire i proteoglicani della cicatrice gliale. Due giorni dopo, il C-H-A-B-C viene microiniettato adiacente al sito della lesione e l'estremità distale del PNG viene posizionata contro la lesione del quadrante dorsale.

Ciao, sono John Hula. Sono il direttore del Centro di Ricerca sulle Lesioni del Midollo Spinale presso la Facoltà di Medicina della Drexel University. Sono la dottoressa Veronica Tom del laboratorio Hula e sono Martha Mean.

Del laboratorio Hula. Oggi dimostreremo una procedura di trapianto di un segmento di nervo periferico nel midollo spinale leso di un ratto adulto. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la rigenerazione degli assoni e il recupero della funzione dopo una lesione del midollo spinale.

Ok, iniziamo. Per prepararsi all'intervento microchirurgico, sanificare la postazione chirurgica e sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici. Preparare la barriera termica e i piccoli pezzi di spugna gelatinosa, di dimensioni inferiori a due millimetri cubi, per l'emostasi microchirurgica.

Preparare bastoncini di cotone, garze e strumenti chirurgici. Posizionare il ratto anestetizzato sul tavolo operatorio dopo aver verificato, mediante pizzicamento del dito del piede, che l'animale sia completamente anestetizzato. Rasare un'ampia area di pelo dal campo chirurgico previsto e lavare la zona chirurgica seguendo la tecnica di disinfezione asettica descritta nel protocollo testuale allegato.

Successivamente, posizionare il ratto sulla barriera termica, coprirne il naso e la bocca con il cono per inalazione e ridurre l'isoflurano al 3% e la portata a 0,2 litri al minuto. Somministrare la dose appropriata dell'antibiotico ampicillina mediante iniezione sottocutanea e del farmaco analgesico buprenorfina mediante iniezione intramuscolare. Il nervo periferico, o PN, viene sezionato da sette a dieci giorni prima del suo prelievo per favorire la degenerazione, il che crea un ambiente più adatto alla crescita assonale rispetto a una preparazione fresca del nervo.

Per iniziare la sezione del pn, posizionare l'animale su un fianco. Passare a guanti sterili e posizionare un telo chirurgico sterile intorno al sito operatorio. Eseguire un'incisione lineare retta dalla testa del femore al ginocchio, mantenendosi paralleli e a circa tre millimetri dal femore, tagliando attraverso i muscoli bicipiti femorali superficiali lungo la stessa linea dell'incisione cutanea per esporre il muscolo vasto laterale sottostante.

Una volta esposto il muscolo vasto laterale, utilizzare le forbici per praticare un piccolo taglio vicino al ginocchio ed estenderlo verso la testa del femore. Separare delicatamente con dei retrattori il vasto laterale fino a quando i rami nervosi tibiale e perineale congiunti del nervo sciatico risultano visibili e paralleli al femore. Successivamente, seguire questi rami nervosi verso la testa del femore fino a identificare il tronco principale del nervo sciatico.

Appena sotto la biforcazione del nervo sciatico, utilizzare pinzette fini per separare con attenzione il tessuto connettivo o l'epinevrio che circonda il ramo del nervo tibiale. Questo è il ramo più grande. Una volta isolato il ramo del nervo tibiale, far scivolare intorno ad esso un ligamento di seta da sei-oh e stringerlo.

Utilizzare forbici microchirurgiche per sezionare il nervo appena al di sopra del legaccio. Far passare il filo di sutura attraverso il muscolo vasto laterale e annodarlo. Questo fornirà un riferimento per individuare facilmente l'estremità tagliata del nervo tibiale.

Quando il nervo viene prelevato. Successivamente, chiudere il muscolo vasto laterale con sei punti di sutura in seta 6-0. Dopo di ciò, chiudere il muscolo PMOs del bicipite con sei punti di sutura in seta 6-0.

Infine, chiudere la cute con clip per ferite di Michelle. Spegnere il flusso di isoflurano e rimuovere il cono per inalazione. Posizionare l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica.

Riportare l'animale nella sua gabbia di mantenimento. Una volta che è sveglio e attivo, dopo sette-dieci giorni, il segmento del nervo periferico è pronto per essere prelevato. Per iniziare il trapianto, posizionare l'animale anestetizzato sulla barriera termica.

Dopo aver confermato che l'animale è completamente anestetizzato, rimuovere le clip della ferita e separare l'incisione cutanea. La rasatura dell'area potrebbe non essere necessaria poiché la pelle dovrebbe aprirsi facilmente, evitando contaminazioni. Eliminando la necessità di tagliare attraverso il pelo, tagliare attraverso la sutura del muscolo superficiale per esporre il vasto laterale e tagliare attraverso la sutura in questo muscolo.

Seguire la linea di sutura fino all'estremità tagliata del nervo tibiale ed estrarre la sutura dal nervo. Utilizzare pinzette fini per dissezionare l'epinevrio da un tratto lungo 15 millimetri del nervo tibiale e recidere questa estremità distale. Rimuovere il segmento nervoso e immergerlo in soluzione salina equilibrata di Hank sterile.

Siamo ora pronti per il passaggio successivo, che consiste nell'indurre una lesione del midollo spinale per il trapianto del PN, che può essere autologo o eterologo. Posizionare il ratto anestetizzato sulla barriera termica e somministrare antibiotici e analgesici come descritto nella sezione precedente per indurre una lesione spinale di tipo HEMI. In primo luogo, individuare la scanalatura occipitale e l'apofisi vertebrale dorsale prominente del T2.

Eseguire un'incisione per tutta la lunghezza compresa tra questi punti di riferimento esterni. Tagliare lungo la linea mediana del muscolo trapezio superficiale e separare i muscoli cervicali ardis sottostanti. Inserire un divaricatore per mantenere i muscoli separati.

I muscoli profondi sopraspinali devono essere recisi a partire dai processi vertebrali dorsali di C4, C5 e C6. Utilizzando R jurors, eseguire una laminectomia parziale di C5 per esporre l'intero lato destro e la porzione mediale del lato sinistro del midollo spinale. Utilizzare la vena dorsale prominente come punto di riferimento per la linea mediana del midollo spinale.

Successivamente, utilizzare una lama microchirurgica per forare la dura madre ed estendere l'incisione sul midollo spinale C cinque. Praticare un piccolo incisione nel sottile aracnoide e nella pia madre sottostante mediante una micropipetta di vetro affilata. Iniziare ad aspirare il lato dorsale destro del midollo spinale applicando una pressione delicata e utilizzando pinzette microchirurgiche per separare il tessuto e facilitarne la rimozione.

Procedere attraverso le porzioni intermedie e ventrali del midollo spinale per creare una cavità lunga due millimetri, completa dal dorso al ventro e dalla linea mediana alle meningi laterali. Inserire nella cavità della lesione della sezione EMISEZIONE della schiuma di gel inumidita con soluzione salina. Per ottenere l'emostasi, rimuovere il segmento precedentemente prelevato di nervo periferico dalla soluzione di Hank.

Palpare delicatamente l'epi nei tre millimetri prossimali del segmento nervoso e apporre questa estremità alla parete rostrale della cavità della lesione nella sezione HEMI. Fissare il segmento con suture da 10 oh attraverso l'epi uum alla dura madre. Quindi suturare la dura chiudendola sopra l'estremità innestata del trapianto, inserendo il trapianto tra due pezzi di membrana elastica cel.

Posizionare l'innesto accanto ai processi vertebrali C6, C7 e T1. Non apporre l'estremità distale del nervo al midollo spinale o al tessuto muscolare. Chiudere i muscoli per strati con punti di sutura 4-0 e chiudere l'incisione cutanea con clip per ferite.

Infine, posizionare l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica e riportarlo nella sua gabbia di provenienza. Una volta che l'animale è vigile e attivo, gli assoni rigenerati che raggiungono l'estremità distale dell'innesto del nervo periferico spesso non riescono a estendersi nuovamente nel midollo spinale. Pertanto, utilizziamo microiniezioni di condroitinasi ABC per degradare il tessuto cicatriziale che circonda la zona lesa.

Questa procedura viene eseguita 21 giorni dopo il trapianto di PN per iniziare, verificando che l'animale sia completamente anestetizzato. Rimuovere quindi le clip della ferita e somministrare antibiotici e analgesici come mostrato in precedenza. Tagliare le suture superficiali per esporre la membrana elastica che circonda l'innesto nervoso utilizzando pinzette fini e forbici a molla.

Separare con attenzione l'intera lunghezza del nervo dalle membrane elastiche celomatiche. Allontanare il nervo dal campo chirurgico. Eseguire una laminectomia parziale sul lato destro dell'apofisi vertebrale di C7.

Perforare le meningi con una lama di microbisturi e, mediante aspirazione, preparare una cavità lesionale dorsale quadrante di un millimetro cubo nel midollo spinale C7. Inserire nella cavità lesionale della schiuma di gel inzuppata di soluzione salina per ottenere l'emostasi. Successivamente, sostituire la schiuma di gel con una inzuppata di condroitinasi.

A BC. Trattare la sede della lesione per 15 minuti, fornendo ogni cinque minuti una schiuma di gel imbevuta di condroitina fresca. Coprire l'intera lunghezza esterna del trapianto nervoso con membrana scolastica. Chiudere i muscoli superficiali con quattro punti di sutura oh e l'incisione cutanea con clip per ferite.

Posizionare l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica e riportarlo nella sua gabbia originaria una volta che è vigile e attivo. Due giorni dopo, 23 giorni dopo il trapianto di PN, viene nuovamente eseguita un'operazione chirurgica sull'animale per microiniettare chondroitin NA nel midollo spinale. Come in precedenza, le clip della ferita vengono rimosse dall'animale anestetizzato e vengono somministrati antibiotici e analgesici.

Tagliare le suture superficiali per esporre la membrana elastica che circonda l’innesto nervoso. Esporre il sito dell’innesto C7 senza disturbare l’innesto stesso. Quindi utilizzare una siringa Hamilton con una cannula di vetro tirata per microiniettare un microlitro di condroitinasi ABC nel lato destro del midollo spinale, approssimativamente un millimetro a valle rispetto al punto di apposizione dell’innesto al midollo spinale.

Stacca delicatamente l'EUR dai due millimetri distali del segmento nervoso e avvicina questa estremità alla cavità della lesione del settimo nervo cervicale. Fissa il segmento con suture 10 oh attraverso l'epinevrio alla dura madre. Chiudi i muscoli superficiali con suture 4 oh e l'incisione cutanea con clip per ferite.

Posizionare l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica e riportarlo nella sua gabbia originaria una volta che è vigile e attivo. Quando questa procedura è ottimizzata, il segmento del nervo periferico si integrerà strettamente con il midollo spinale dell'ospite, permettendo di visualizzare gli assoni spinali che rigenerano all'interno dell'innesto. Abbiamo riempito per diffusione l'innesto con destina amminata biotinilata o BDA ascendente e discendente.

Gli assoni spinali in genere entreranno nell'innesto, cresceranno in linea relativamente retta parallela alla lunghezza dell'innesto ed estenderanno fino all'estremità distale dell'innesto a un ritmo di circa un millimetro al giorno. Gli assoni dei nervi periferici penetreranno nel midollo spinale adiacente. Se il NACE di condroitina è stato utilizzato per rimuovere i proteoglicani inibitori dal tessuto cicatriziale circostante al raggiungimento dell'estremità distale, un numero molto ridotto di assoni dei nervi periferici si estende nel tessuto ospite dopo il trattamento quando viene somministrato il veicolo.

Tuttavia, se l'interfaccia distale è stata trattata con condroitina, un numero significativamente maggiore di assoni emerge dall'innesto per reinnervare il midollo spinale. Come mostrato in questa singola sezione rappresentativa su 15-20 sezioni per animale in cui si osserva la fuoriuscita assonale, questo istogramma dimostra un aumento significativo della fuoriuscita assonale dopo il trattamento con condrontinasi ABC. Il rilevamento immunoistochimico di marcatori sinaptici sui neuroni del midollo spinale in risposta alla stimolazione elettrica degli assoni all'interno dell'innesto può essere utilizzato per valutare la connettività funzionale tra l'innesto trapiantato e il midollo spinale dell'ospite.

Questa regione del midollo spinale contenente il sito di apposizione distale è stata colorata immunocitochimicamente sia per la dextrina amminica biotinilata in verde che per il marcatore sinaptico sinapsina in rosso; le frecce indicano aree in cui si è verificata la codistribuzione dei marcatori, a indicare che alcune fibre rigenerate a partire dall'innesto hanno formato contatti sinaptici funzionali. La connettività funzionale tra neuroni dell'innesto e del midollo spinale è stata inoltre dimostrata mediante saggio per l'espressione di CFOs. Dopo la stimolazione sinaptica dei neuroni dell'ospite al di là dell'interfaccia distale, questo marcatore di attivazione transsinaptica può essere identificato in numerosi neuroni positivi per CFOs nel tessuto controlaterale rispetto al sito dell'innesto, mentre, in ingrandimento maggiore, si osservano pochissimi neuroni positivi per CFOs nel tessuto controlaterale all'innesto.

È stato appena mostrato come preparare un sito di lesione del midollo spinale in previsione del trapianto di un innesto di nervo periferico per favorire la rigenerazione dopo una lesione del midollo spinale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di disporre di una lunghezza sufficiente del nervo prima dell'innesto e di posizionare l'innesto in stretta adiacenza al sito della lesione del midollo spinale. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.