La combinazione di innesto del nervo periferico e Matrix modulazione di riparare il cavo feriti Rat spinale

Lesione traumatica al midollo spinale interrompe la comunicazione con il cervello. Per ripristinare la connettività perso utilizziamo un innesto del nervo periferico di fornire un substrato per la rigenerazione delle fibre in combinazione con fattori neurotrofici e matrice di modulazione degli enzimi per rimuovere molecole inibitrici per promuovere la crescita a lunga distanza.

La preparazione per l'innesto di un nervo periferico in un sito di lesione del midollo spinale inizia con la pre-degenerazione del PNG da sette a 10 giorni prima dell'innesto. Il ramo del nervo tibiale di un ratto donatore viene sezionato. Una sezione cervicale di livello cinque o C cinque emi viene eseguita mediante aspirazione.

Il PNG viene rimosso dal ratto donatore e contrapposto alla parete rostrale della cavità della lesione e fissato mediante sutura aurum alla dura madre. Tre settimane dopo, viene praticata una lesione del quadrante dorsale a C sette schiuma di gel satura di C-H-A-B-C viene posta nella cavità per 15 minuti per digerire i proteoglicani della cicatrice gliale. Due giorni dopo, C-H-A-B-C viene microiniettato adiacente al sito della lesione e l'estremità distale del PNG si oppone alla lesione del quadrante dorsale.

Ciao, sono John Hula. Sono il direttore del Centro di ricerca sulle lesioni del midollo spinale presso il Drexel University College of Medicine. Sono la dottoressa Veronica Tom del laboratorio di hula e sono Martha Mean.

Dal laboratorio di hula. Oggi dimostreremo una procedura di trapianto di un segmento di nervo periferico nel midollo spinale danneggiato di un ratto adulto. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la rigenerazione degli assoni e il recupero della funzione dopo una lesione del midollo spinale.

Ok, iniziamo. Per prepararsi alla chirurgia microscopica, sanificare la postazione chirurgica e autoclavare tutti gli strumenti chirurgici. Preparare la barriera termica e i piccoli pezzi di schiuma gel a cubetti di meno di due millimetri per la micro emostasi.

Prepara tamponi di cotone, garze e strumenti chirurgici. Posizionare il ratto anestetizzato sul tavolo di preparazione dopo aver confermato con un pizzico di dita dei piedi che l'animale è completamente anestetizzato. Radere un'ampia area di pelo dal sito chirurgico di lavaggio del campo chirurgico previsto seguendo la tecnica di scrub asettico descritta nel protocollo di testo allegato.

Successivamente, posizionare il ratto sulla barriera termica, coprire il naso e la bocca con il cono di inalazione e ridurre l'isof di fluoro al 3% e la portata a 0,2 litri al minuto. Somministrare la dose appropriata di antibiotico ampicillina per iniezione sottocutanea e analgesico buprenorfina per iniezione intramuscolare. Il nervo periferico o PN viene sezionato da sette a 10 giorni prima della sua rimozione per promuovere la degenerazione, il che fornisce un ambiente più adatto alla crescita assonale rispetto a una preparazione nervosa fresca.

Per iniziare la transezione del pn, adagiare l'animale su un fianco. Passa ai guanti sterili e posiziona un telo chirurgico sterile intorno al sito dell'intervento. Praticare un'incisione in linea retta dalla testa del femore al ginocchio mantenendo parallela e a circa tre millimetri dal femore, tagliare i muscoli bicipiti femminali superficiali lungo la stessa linea dell'incisione cutanea per esporre il muscolo vasto laterale sottostante.

Una volta che il muscolo vasto laterale è esposto, usa le forbici per fare un piccolo taglio vicino al ginocchio ed estendilo verso la testa del femore. Separare delicatamente con i divaricatori i vasti laterali fino a visualizzare i rami congiunti del nervo tibiale e perineale del nervo satico che corrono paralleli al femore. Successivamente, traccia questi rami nervosi verso la testa del femore fino a identificare il tronco principale del nervo sciatico.

Appena sotto la biforcazione del nervo satico, usa una pinza sottile per separare accuratamente il tessuto connettivo o l'epinevrio che circonda il ramo del nervo tibiale. Questo è il ramo più grande. Una volta isolato il ramo del nervo tibiale, infilaci attorno una legatura di seta da sei oh e stringi.

Usa le micro forbici per sezionare la passeggiata nervosa cruda verso la legatura. Passare la linea di sutura attraverso il muscolo vasto laterale e legare in un nodo. Questo fornirà una linea per una facile localizzazione dell'estremità tagliata del nervo tibiale.

Quando il nervo viene raccolto. Successivamente, chiudere il vasto muscolo laterale con sei punti di sutura di seta. Successivamente, chiudi il muscolo PMO del bicipite con sei suture di seta.

Infine, chiudere la pelle con le clip per ferite Michelle. Chiudere il flusso di fluoro e rimuovere il cono di inalazione. Posizionare l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica.

Rimetti l'animale nella sua gabbia di casa. Una volta che è vigile e attivo, da sette a 10 giorni dopo, il segmento PN è pronto per essere raccolto. Per iniziare il trapianto, posizionare l'animale anestetizzato sulla barriera termica.

Dopo aver confermato che l'animale è completamente anestetizzato, rimuovere le clip della ferita e separare l'incisione cutanea. La rasatura prima dell'area potrebbe non essere necessaria poiché la pelle dovrebbe staccarsi facilmente evitando la contaminazione. Eliminando la necessità di tagliare il pelo, tagliare la sutura del muscolo superficiale per esporre i lati del vasto e tagliare la sutura in questo muscolo.

Tracciare la linea di sutura fino all'estremità tagliata del nervo tibiale e rimuovere la sutura dal nervo. Usa una pinza fine per sezionare l'epinevrio da una lunghezza di 15 millimetri del nervo tibiale e tagliare questa estremità distale. Rimuovere il segmento nervoso e immergerlo nella soluzione salina bilanciata sterile della matassa.

Ora siamo pronti per il passo successivo, che è quello di indurre una lesione del midollo spinale per il trapianto di PN può essere autologo o eterologo. Posizionare il ratto anestetizzato sulla barriera termica e somministrare antibiotici e analgesici come descritto nella sezione precedente per indurre una lesione del midollo spinale della sezione HEMI. Innanzitutto, individua la tacca occipitale e il prominente processo vertebrale dorsale T due.

Fai un'incisione per tutta la lunghezza tra questi punti di riferimento esterni. Taglia la linea mediana del muscolo trapezio superficiale e separa i muscoli dell'ardos cervicale sottostanti. Inserire uno spandiconcime per tenere i muscoli divaricati.

I muscoli sopraspinali profondi dovrebbero essere tagliati dai processi vertebrali dorsali C quattro, C cinque e C sei. Utilizzando R, i giurati eseguono una laminectomia parziale di C 5 per esporre l'intero lato destro e la porzione mediale del lato sinistro del midollo spinale. Usa la vena dorsale prominente come punto di riferimento per la linea mediana del midollo spinale.

Successivamente, utilizzare una lama di micro bisturi per perforare la dura madre ed estendere l'incisione sul midollo spinale C cinque. Praticare una piccola incisione nel subaracnoide sottostante e nella madre P con una micro cannula di vetro tirata. Inizia ad aspirare il lato dorsale destro del midollo spinale usando una leggera pressione e micro pinze per separare il tessuto e facilitarne la rimozione.

Continuare attraverso le porzioni intermedie e ventrali del midollo spinale per creare una cavità lunga due millimetri che è completa dalla dorsale alla ventrale e dalla linea mediana alle meningi laterali. Posizionare la schiuma di gel imbevuta di soluzione salina nella cavità della lesione della sezione HEMI. Per ottenere l'emostasi, rimuovere il segmento precedentemente raccolto del nervo periferico dalla soluzione di Hank.

Sentire delicatamente l'epi dai tre millimetri prossimali del segmento nervoso e opporre questa estremità alla parete rostrale della cavità della lesione della sezione HEMI. Fissare il segmento con 10 punti di sutura attraverso l'epi uum fino alla dura madre. Quindi sutura la dura madre chiusa sopra l'estremità impiantata dell'innesto, inserendo l'innesto tra due pezzi di membrana elastica cel.

Posizionare l'innesto accanto ai processi vertebrali C sei, C sette e T uno. Non opporre l'estremità del nervo distale al midollo spinale o al tessuto muscolare. Chiudere i muscoli a strati con quattro suture oh e chiudere l'incisione cutanea con clip per ferite.

Infine, posizionare l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica e riportarlo nella sua gabbia di casa. Una volta che è vigile e attivo, gli assoni rigenerati che raggiungono l'estremità distale dell'innesto di PN spesso non riescono a estendersi nuovamente nel midollo spinale. Quindi usiamo micro iniezioni di condroitina ACE per degradare il tessuto cicatriziale che circonda l'area della lesione.

Questa procedura viene eseguita 21 giorni dopo l'inizio del trapianto di PN, confermare che l'animale è completamente anestetizzato. Quindi rimuovere le clip della ferita e somministrare antibiotici e analgesici come mostrato in precedenza. Tagliare le suture superficiali per esporre la membrana elastica che circonda l'innesto nervoso utilizzando una pinza fine e forbici a molla.

Liberare con cura la lunghezza del nervo dalle membrane elastiche cel. Riflettere il nervo dal campo chirurgico. Eseguire una laminectomia parziale sul lato destro del processo vertebrale C sette.

Forare le meningi con una lama di micro bisturi e, mediante aspirazione, preparare una cavità della lesione del quadrante dorsale cubica di un millimetro nel midollo spinale C sette. Posizionare la schiuma di gel imbevuta di soluzione salina nella cavità della lesione per ottenere l'emostasi. Successivamente, sostituisci la schiuma di gel con una imbevuta di condroitina nace.

A BC. Trattare il sito della lesione per 15 minuti, fornendo condroitina fresca, una schiuma di gel imbevuta ogni cinque minuti. Coprire la lunghezza esterna dell'innesto nervoso con membrana scolastica. Chiudere i muscoli superficiali con quattro punti di sutura e l'incisione cutanea con clip per ferite.

Metti l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica e rimettilo nella sua gabbia di casa una volta che è vigile e attivo. Due giorni dopo, 23 giorni dopo il trapianto di PN, viene eseguito nuovamente un intervento chirurgico sull'animale per microiniettare la condroitina NA nel midollo spinale. Come in precedenza, le clip della ferita vengono rimosse dall'animale anestetizzato e vengono somministrati antibiotici e analgesici.

Tagliare le suture superficiali per esporre la membrana elastica che circonda l'innesto nervoso. Esporre il sito dell'innesto C sette senza disturbare l'innesto. Quindi utilizzare una siringa di Hamilton con una cannula di vetro tirata per microiniettare un microlitro di condroitina ace A BC nel lato destro del midollo spinale, a circa un millimetro distale rispetto all'apposizione dell'innesto nel midollo spinale.

Staccare delicatamente l'EUR dai due millimetri distali del segmento nervoso e opporre questa estremità alla cavità della lesione C sette. Fissare il segmento con 10 suture OH attraverso l'epineario fino alla dura madre. Chiudere i muscoli superficiali con quattro suture oh e l'incisione cutanea con clip per ferite.

Metti l'animale in una gabbia di contenimento su una barriera termica e rimettilo nella sua gabbia di casa una volta che è vigile e attivo. Quando questa procedura è ottimizzata, il segmento del nervo periferico si integrerà strettamente con il midollo spinale ospite per visualizzare gli assoni spinali che si rigenerano nell'innesto. Abbiamo riempito per diffusione l'innesto con destrina ammina biotinilata o BDA ascendente e discendente.

Gli assoni spinali generalmente entrano nell'innesto, crescono in una linea relativamente retta parallela alla lunghezza dell'innesto e si estendono fino all'estremità distale dell'innesto a una velocità di circa un millimetro al giorno. Gli assoni dei nervi periferici penetrano nel midollo spinale adiacente. Se la NACE di condroitina è stata utilizzata per rimuovere i proteoglicani inibitori dal tessuto cicatriziale circostante al raggiungimento dell'estremità distale, pochissimi assoni nervosi periferici si estendono nel tessuto ospite dopo il trattamento quando trattati con veicolo.

Tuttavia, se l'interfaccia distale è stata trattata con condroitina, dall'innesto emergono un numero significativamente maggiore di assoni per reinnovare il midollo spinale. Come mostrato qui in questa sezione di rappresentazione su 15-20 sezioni per animale in cui si osserva la crescita assonale, questo grafico a barre dimostra un aumento significativo della crescita assonale dopo il trattamento con nace A BC congiunto. La rilevazione immunochimica di marcatori sinaptici sui neuroni del midollo spinale in risposta alla stimolazione elettrica degli assoni all'interno dell'innesto può essere utilizzata per valutare la connettività funzionale tra l'innesto trapiantato e il midollo spinale dell'ospite.

Questa regione del midollo spinale contenente il sito di apposizione distale è stata immuno citochimicamente colorata sia per la destrina ammina biotinilata in verde che per il marcatore sinaptico sinapsina in punte di freccia rosse indicano aree in cui c'era una colocalizzazione di marcatori che indicavano che alcune fibre che si rigeneravano dall'innesto formavano contatti sinaptici funzionali. La connettività funzionale tra i neuroni dell'innesto e del midollo spinale è stata dimostrata anche mediante test per l'espressione dei CFO. A seguito della stimolazione sinaptica dei neuroni ospiti oltre l'interfaccia distale, questo marcatore di attivazione transsinaptica può essere identificato da molti neuroni positivi dei CFO nel tessuto omolaterale al sito del trapianto e, con un ingrandimento più elevato, si possono osservare pochissimi neuroni positivi dei CFO nel tessuto controlaterale al trapianto.

Ti abbiamo appena mostrato come preparare un sito di lesione del midollo spinale in preparazione al trapianto di un innesto di nervo periferico per promuovere la rigenerazione dopo una lesione del midollo spinale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di avere una lunghezza sufficiente del nervo prima dell'innesto e di avere una stretta apposizione dell'innesto sul sito della lesione del midollo spinale. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.