Utilizzo sinergico delle cellule neurali e precursori peptidi autoassemblanti in Sperimentale Cervical Spinal Cord Injury

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre un modello di clip di compressione della contusione della lesione spinale cervicale nei ratti e un protocollo per il trattamento combinato che coinvolge l'iniezione di SAP e il trapianto di NPC. In primo luogo, una clip per aneurisma viene posizionata attorno al midollo spinale e mantenuta in posizione per un minuto. Ciò si traduce in una lesione da compressione da contusione bilaterale.

Successivamente, i SAP vengono iniettati nell'epicentro della lesione, gli NPC vengono iniettati immediatamente dopo l'iniezione di SAP. Viene inserita una pompa osmotica con catetere subdurale per l'erogazione prolungata dei fattori di crescita. Questa procedura si traduce nella consegna di NPC al midollo spinale danneggiato.

La sopravvivenza e l'attecchimento delle NPC sono supportati dal trattamento combinatorio con SAPs e fattori di crescita. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una terapia per la lesione traumatica del midollo spinale perché fornisce un modello clinicamente rilevante che può essere utilizzato per studiare terapie COMBINATOR basate su cellule che promuovono la rigenerazione del midollo spinale. Il seguente protocollo sperimentale è stato approvato dall'Animal Care Committee della University Health Network, Toronto, Canada, ed è conforme alle politiche stabilite nella guida alla cura e all'uso degli animali da esperimento preparata dal Canadian Council of Animal Care.

Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite in condizioni sterili utilizzando attrezzature e soluzioni sterili e, secondo le linee guida delle istituzioni e del governo, questa procedura utilizza ratti di peso compreso tra 250 e 270 grammi prima di iniziare la procedura. Fornire agli animali antibiotici nell'acqua potabile per due giorni il giorno della procedura. Dopo aver posizionato il ratto in una camera di anestesia e aver indotto l'anestesia con fluoro ISO al 5% in ossigeno e protossido di azoto uno a uno per un minuto, ridurre il fluoro ISO dall'1,8 al 2,2%Applicare l'unguento lambic sugli occhi e confermare l'anestesia chirurgica eseguendo un pizzico della zampa.

Quindi posiziona il ratto su un cuscino riscaldato e fissa la testa in una cornice stereotassica con un cono per il naso. Dopo aver rasato la pelliccia intorno al rachide cervicale, disinfettare la pelle tamponando con iodio povidone, seguito da etanolo al 70% dopo aver praticato un'incisione sulla linea mediana dalla regione delle due vertebre cervicali C al processo prominente del corpo vertebrale toracico T due. Usa le forbici chirurgiche per tagliare lo strato esterno dei muscoli vertebrali direttamente sulla linea mediana in una direzione cranio coddle, usa le forbici chirurgiche per smussare gli strati muscolari più profondi fino a raggiungere i processi, l'osi e la laminazione.

Inserire i goniometri e tenerli premuti. Aprire gli strati muscolari, quindi orientare il processo prominente del corpo della vertebra T due e identificare i livelli mirati per la laminectomia. Quindi utilizzare un bisturi numero 15 per tagliare il legamento scorticato per allentare i lamini e il processo di posis.

Successivamente, usa un tagliaossa per tagliare i lamini lateralmente al midollo spinale e rimuovi delicatamente i lamini senza comprimere il midollo spinale. Ora prenditi un momento per identificare le radici nervose emergenti per evitare che vengano tagliate. Quindi utilizzare un gancio per allentare la dura ventrale dal lato dorsale dei corpi vertebrali e preparare un corridoio per la clip.

Assicurarsi che la molla ad anello della clip sia impostata in modo da erogare la forza desiderata. La forza della clip determina l'entità del trauma e della compressione. Inserire la clip aperta attorno al midollo spinale e lasciarla chiudere a scatto per indurre una lesione contusiva.

Spesso vengono utilizzate forze di clip comprese tra 15 e 35 grammi con una durata di clipping di un minuto dopo l'esecuzione della lesione del midollo spinale. Rimuovere la clip e chiudere i muscoli in due strati, seguiti dalla chiusura della pelle. Una volta che la ferita è stata chiusa correttamente, interrompere l'anestesia e osservare il topo mentre si sveglia.

Dopo che l'animale ha riacquistato sufficiente coscienza per lo sternale, sdraiato, metti il ratto in una gabbia pulita. A causa della gravità di questo tipo di lesione, è imperativo seguire i seguenti trattamenti postoperatori. Innanzitutto, assicurati di somministrare antidolorifici come buprenorfina e meloxicam per tre o cinque giorni a seconda dei sintomi.

Prevenire anche la disidratazione per via sottocutanea. Iniettare da cinque a 10 millilitri di soluzione salina due volte al giorno per tre giorni e continuare a fornire antibiotici nell'acqua potabile per cinque giorni. Post-operatorio. Spremere la vescica urinaria due o tre volte al giorno fino a quando il recupero costante della funzione vescicale è evidente anche dopo che gli animali sembrano guariti.

Assicurati di osservare gli animali operati per deficit neurologici e condizioni fisiologiche. L'iniezione viene eseguita 14 giorni dopo la lesione del midollo spinale. Prima di iniziare l'intervento, preparare i SAPs a una concentrazione dell'1% in peso per volume in acqua sterile e riempire un capillare di vetro da 100 micrometri collegato a una siringa Hamilton.

Con la soluzione, collegare la siringa di Hamilton al telaio stereotassico. Dopo l'anestesia, il ratto fissa la testa nel telaio stereotassico e disinfetta il sito chirurgico con iodio povidone e alcol al 70%. Come prima, ancora una volta, dopo aver aperto la pelle, sezionare con cura la coppia di muscoli vertebrali e inserire i divaricatori.

Utilizzare un bisturi numero 15 per rimuovere il tessuto cicatriziale dalla dura madre e riesporre il sito della lesione. Quindi utilizzare la punta di un ago affilato per aprire con cautela la dura madre. Infine, stereotassicamente, inserire il capillare di vetro a una profondità di due millimetri nel midollo spinale traumatizzato e iniettare i SAP.

Dopo aver iniettato i SAP, lasciare che il capillare rimanga nel sito di iniezione per un minuto prima della rimozione per consentire l'allungamento del tessuto per accogliere la soluzione iniettata. Quindi ripetere l'iniezione nel sito successivo. Qui, le NPC sono state isolate dalla zona paraventricolare di un topo rosso DS adulto e coltivate secondo le procedure precedentemente pubblicate.

Poco prima della microiniezione, diluire le NPC nel terreno di crescita a una concentrazione di 50 volte 10 al terzo di cellule vive per microlitro per il trapianto di cellule e caricarle in un capillare di vetro su una siringa di Hamilton. Gli NPC vengono iniettati immediatamente dopo l'iniezione di SAP. Per fare ciò, inserire il capillare di vetro della siringa di Hamilton a 0,2 millimetri di rostrale dal sito della lesione e 1,5 millimetri sotto la superficie dorsale del midollo spinale.

Iniettare due microlitri della sospensione cellulare a una velocità di circa 0,5 microlitri al minuto. Al termine della prima iniezione, lasciare che il capillare rimanga nel midollo spinale per un minuto come prima, quindi ritrarre il capillare, spostarlo in un sito adiacente e ripetere la procedura di iniezione. Dopo aver atteso un minuto, come prima, ritrarre il capillare e spostarlo di due millimetri coccolare sul sito della lesione.

Eseguire due iniezioni da due microlitri in questa posizione. Questa immagine mostra tutti i siti di iniezione relativi alla lesione del midollo spinale. L'impianto di mini pompe osmotiche subdurali per il supporto del fattore di crescita viene eseguito immediatamente dopo le iniezioni di NPC.

Per prima cosa scegli un sito di impianto. Le sedi preferite sono i fianchi laterali della regione toracoaddominale per evitare fastidi causati dalla pompa stessa. Dopo aver disinfettato la regione come prima, viene preparata una rientranza sottocutanea per la pompa.

Successivamente, eseguire una laminectomia saltata delle vertebre superiori o inferiori adiacenti alla lesione del midollo spinale. Qui, la lesione del midollo spinale è stata eseguita a C sette T uno, e quindi la laminectomia viene eseguita a C cinque. Ora posiziona la pompa nell'incavo sottocutaneo, quindi taglia il catetere alla lunghezza necessaria e infine usa le suture 6.0 per fissarlo alla coppia di muscoli vertebrali.

Evitare qualsiasi lussazione associata al movimento. Usa la punta di un ago affilato per aprire la dura madre sotto la laminectomia. Quindi introdurre il catetere nello spazio subdurale e lasciarlo scivolare in una direzione di coccola senza resistenza e senza ferire il cordone.

Ora, controlla che il catetere funzioni senza intoppi e non abbia pieghe o pieghe come mostrato qui. Quindi chiudere i muscoli strato per strato usando suture o clip, quindi chiudere la pelle. Una volta che la ferita è ben chiusa, interrompere l'anestesia e osservare l'animale mentre si sveglia.

Dopo che l'animale ha riacquistato sufficiente coscienza per la sdraiata sternale, metti il ratto in una gabbia pulita. Assicurati di seguire tutte le procedure di trattamento postoperatorie, incluso il monitoraggio dell'animale e l'analgesia post-chirurgica. Somministrare il trattamento di immunosoppressione due giorni prima dell'iniezione di NPC e fino a sette giorni dopo il trapianto e fino al sacrificio, rispettivamente.

Questa immagine al microscopio a fluorescenza mostra una sezione longitudinale di un midollo spinale traumatizzato di un ratto. La colorazione è costituita da SAP a fluorescenza DPI marcati con QL sei. Le fitte appaiono verdi e si sono aggregate nell'epicentro della lesione.

Le NPC rossamente positive iniettate DS si sono diffuse nelle direzioni rostrale e coccola indicate dalla fluorescenza rossa. La barra della scala rappresenta cinque millimetri. Qui un'immagine al microscopio elettronico a scansione mostra la formazione di scaffold in nanofibra di SAP assemblati.

La barra della scala rappresenta un micrometro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle procedure chirurgiche coinvolte nella compressione della clip, SCI, e di come l'approccio promettente del trattamento combinato con SAPs e NPC possa essere studiato in questo modello.