La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l'imaging tutto il cuore

Per eseguire una tomografia ottica a proiezione normalizzata, il campione viene prima fissato e incluso in un cilindro di agarosio. Il campione viene quindi ruotato lungo un asse verticale e illuminato uniformemente con una lunghezza d'onda di eccitazione, mentre la trasmissione viene misurata mediante un sistema ottico CCD adeguato. Il segnale fluorescente a tale lunghezza d'onda viene misurato in modalità transilluminazione.

Le immagini fluorescenti e di assorbimento acquisite vengono utilizzate per determinare il rapporto di Born normalizzato e ricostruire la distribuzione dei fluorocromi all'interno del campione. Ciao, mi chiamo Claudia Naone e lavoro presso i Centri per la Biologia dei Sistemi del Mass General Hospital, della Harvard Medical School. Sono Danielle Raki dell'Istituto per l'Imaging Biologico e Medico presso l'Università Tecnica di Monaco e Al Center Monaco.

Sono Giselle Fido. Sono la direttrice dell'Experimental su Co qui al C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging in tempo reale ex vivo di organi interi mediante l'approccio normalizzato di Born per la tomografia a proiezione ottica.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la distribuzione di sonde molecolari fluorescenti in organi cavi. Cominciamo dunque. Questo video illustrerà la procedura per l'uso della tomografia a proiezione ottica per l'acquisizione di immagini di tessuti o organi preparati e un video allegato.

Spieghiamo come utilizzare questo sistema per eseguire l'acquisizione di immagini in time-lapse su drosophila in via di sviluppo. La tecnica di imaging tridimensionale denominata tomografia a proiezione ottica richiede una combinazione unica di ottiche e di un piatto rotante. In questo segmento del video, verrà chiarita la procedura di acquisizione delle immagini.

Per iniziare, la sorgente luminosa principale funge da fonte sia per le misurazioni di illuminazione e di assorbimento, sia per fornire l'eccitazione fluorescente necessaria alle misurazioni di fluorescenza; a tale scopo, la luce della sorgente principale viene inizialmente filtrata mediante un filtro interferenziale a banda passante stretta. Successivamente, la luce attraversa un insieme di filtri neutri fissi e variabili. Questi, combinati con la presenza di un otturatore automatico, consentono di controllare l'intensità luminosa sul campione mantenendola sufficientemente bassa da evitare qualsiasi fenomeno di fotobiancamento.

L'illuminazione uniforme del campione viene ottenuta utilizzando un espansore del fascio e una lente combinata di telescopio Glan con una lente diffusore. Infine, filtri ottici interferenziali a banda stretta sono utilizzati per purificare otticamente la luce della sorgente di eccitazione. Il campione viene immerso in una soluzione trasparente e mantenuto in posizione per l'acquisizione all'interno di un tubo di vetro.

Il campione viene ruotato lungo il suo asse verticale mediante una piattaforma di rotazione ad alta velocità con un'accuratezza assoluta di 0,05 gradi. Tre regolatori manuali distinti permettono di inclinare e regolare l'asse verticale del campione nel suo piano ortogonale. Il segnale assorbente viene acquisito in trasilluminazione ed è rilevato direttamente da una telecamera CCD.

Il segnale fluorescente viene filtrato attraverso un filtro interferenziale a banda stretta, abbinato a un filtro passa-lungo, e successivamente raccolto mediante una lente telecentrica. Le lenti tele offrono il vantaggio di fornire caratteristiche uniche che le rendono ideali per la tomografia a proiezione ottica.

La presenza di un diaframma di apertura posizionato all'interno del gruppo ottico nel punto focale della lente è fondamentale. Garantisce che l'immagine viaggi in parallelo all'asse ottico. Ciò elimina la distorsione prospettica e fornisce un'ingrandimento uniforme su diversi piani focali all'interno della profondità telecentrica.

Il prossimo segmento video descrive una tecnica per la preparazione dei campioni. Seguirà la metodologia utilizzata per l’imaging. La preparazione del tessuto o dell’organo campione per l’imaging tomografico si basa su una disidratazione con etanolo del campione che evita un restringimento asimmetrico.

Questo processo richiede molti giorni per essere completato. In questo video, viene preparato un cuore di topo, ma il protocollo può essere applicato a qualsiasi tessuto o organo. Illustreremo il nostro metodo di imaging a fluorescenza utilizzando il cuore di un animale che ha subito un'infarto controllato.

In altre parole, una perdita dell'apporto ematico che porta a una evidente necrosi tissutale in atto. Il topo è stato iniettato con pro da sei 80 sensori fluorescenti inattivi che segnalano l'attività delle catepsine durante il processo di guarigione. Anestetizzare il miocardio del topo per la perfusione ed estrusione del cuore mediante iniezione intraperitoneale di chetamina e xilazina. Quindi iniettare 50 unità di eparina per via intraperitoneale per prevenire la coagulazione.

Cinque minuti dopo, eseguire la laparotomia longitudinale sull'animale completamente anestetizzato per rimuovere il sangue. Aprire innanzitutto la vena renale sinistra. Ora iniettare lentamente 20 millilitri di soluzione salina nella vena cava inferiore.

La soluzione salina sposta il sangue dopo aver rimosso completamente il sangue sotto un microscopio stereoscopico. Proseguire utilizzando metodi operativi standard per aprire la cassa toracica ed estrarre il cuore. A questo punto, fissare il cuore per otto ore in PFA al 4% a quattro gradi Celsius.

Da questo momento in poi, le fasi di preparazione del tessuto devono essere eseguite al buio per evitare lo sbiancamento di eventuali agenti di contrasto fluorescenti o proteine applicati al tessuto. Al termine della fissazione, rimuovere il PFA con un risciacquo di 15 minuti in PBS; quindi il cuore pulito viene incorporato in una pozzetta di aros allo 0,8%. Una volta che l'aros si è asciugato, l'agarosio viene tagliato intorno al tessuto per ottenere una forma a blocco.

Successivamente, disidratare il cuore aros criptato mediante una serie di cinque passaggi che prevede l'immersione iniziale in etanolo al 20%, seguita da concentrazioni progressivamente più elevate di etanolo e, infine, etanolo puro. Questa procedura di disidratazione contribuisce ad evitare qualsiasi restringimento asimmetrico del campione. I primi quattro bagni in etanolo diluito devono essere effettuati per un'ora, mentre l'ultimo bagno in etanolo al 100% deve essere eseguito per almeno 10 ore.

Una volta completati i trattamenti con etanolo, collocare il campione nella soluzione di Murray fino a quando il campione diventa trasparente, un processo che può variare da alcune ore a diversi giorni. Questa soluzione chiarificante imita l'acqua cellulare e presenta un indice di rifrazione simile a quello delle membrane cellulari, rendendo così il tessuto trasparente. Tracce minime di etanolo possono essere ancora presenti al termine del processo di chiarificazione, causando diversi artefatti nelle ricostruzioni a causa del movimento termico dell'alcol all'interno della soluzione stessa.

Per evitare questo problema, si raccomanda un secondo ciclo di chiarificazione. Questo non dovrebbe richiedere più di quattro ore. Una volta completato, il campione è pronto per la proiezione ottica.

Tomografia assistita da computer. La ricostruzione dell'assorbimento ottico in assenza di scattering della luce può essere ottenuta utilizzando un comune algoritmo di retroproiezione filtrata di Radon. Questo processo è analogo alla tomografia computerizzata a raggi X bidimensionale.

Posizionare il blocco di aeros nella camera di imaging trasparente riempita con la soluzione di chiarificazione. Montare ora la camera sul palchetto e illuminare il campione con un fascio collimato per le misurazioni di eccitazione e di trasmissione. La scelta della sorgente di eccitazione dipende dalla proteina fluorescente o dall'agente di contrasto molecolare per imaging utilizzato.

È conveniente allineare l'asse verticale del campione parallelamente alla colonna di pixel del CCD. Ruotare il campione per 360 proiezioni utilizzando incrementi angolari di un grado, acquisendo immagini ad ogni angolo in illuminazione trasmessa alle lunghezze d'onda di assorbimento e di fluorescenza. Il software che gestisce l'acquisizione controlla automaticamente l'otturatore della sorgente luminosa primaria per evitare un'illuminazione continua e ridurre il fotoblesamento del campione.

L'otturatore è particolarmente importante quando sono necessari tempi di integrazione lunghi per creare una ricostruzione tridimensionale dai dati di assorbimento. Utilizzare semplicemente un algoritmo di retroproiezione di Radon filtrato per la ricostruzione 3D dalle immagini fluorescenti. Devono essere considerati altri contributi di assorbimento, che sono descritti nel prossimo segmento video.

Dopo aver completato i passaggi necessari per una ricostruzione di assorbimento, sono richiesti ancora alcuni passaggi per completare una ricostruzione fluorescente. La ricostruzione di una mappa ottica in assenza di scattering della luce può essere ottenuta utilizzando un comune algoritmo di retroproiezione di Radon filtrato. Il processo è analogo alla tomografia computerizzata a raggi X bidimensionale.

Quando si ricostruisce la distribuzione della fluorescenza, l'assorbimento variabile dipendente dallo spazio rende errato l'uso della trasformata inversa di Radon per la retroproiezione delle immagini di fluorescenza, compromettendo gravemente le distribuzioni ottenute delle proteine fluorescenti o delle sonde molecolari fluorescenti e la loro capacità di quantificazione. Ogni raggio alla lunghezza d'onda di eccitazione Lambda X, emesso da una posizione arbitraria della sorgente Xs, viene attenuato esponenzialmente mentre attraversa l'oggetto immaginato.

Dopo l'eccitazione, il fluorocromo situato nella posizione X emette radiazione che viene filtrata e raccolta dal pixel del CCD situato nella posizione XD mediante il sistema ottico telemetrico. Sebbene la fluorescenza emessa non segua lo stesso percorso del raggio di eccitazione, l'intensità registrata da ciascun pixel approssima una proiezione di tutti i fluorocromi eccitati lungo tutta la zona focale corrispondente a questo particolare raggio di eccitazione. Grazie all'elevata telecentricità del sistema, l'oggetto immaginato viene quindi ruotato di 360 gradi e vengono acquisite multiple misurazioni da sorgente e detector, UX alla lunghezza d'onda di eccitazione e UFL alla lunghezza d'onda di emissione, mediante la telecamera CCD.

Questi vengono quindi combinati sotto il campo born normalizzato UB definito come il rapporto tra i due. La ricostruzione della distribuzione del fluorocromo può essere facilitata scrivendo il modello diretto sia per la propagazione della luce di eccitazione che per quella di emissione, la funzione di Green che descrive l'eccitazione. La propagazione del raggio segue una semplice legge di Beer-Lambert in cui moo A è la distribuzione di assorbimento ottico precedentemente determinata.

L'intensità luminosa UX emessa dalla sorgente nella posizione Xs e misurata dal rivelatore nella posizione XD sul C.C.D può essere scritta come il prodotto della funzione verde per una costante B dipendente dal sistema. La distribuzione precisa dell'intensità luminosa di eccitazione GX lungo ciascun percorso del raggio può quindi essere calcolata. L'intensità di fluorescenza UFL rilevata dal rivelatore XD, stimolata dalla luce emessa dalla sorgente Xs, tiene conto del contributo di tutti i fluorofori che sono stati eccitati lungo il percorso del raggio da Xs a XD.

Il modello diretto del nostro problema di imaging può quindi essere scritto come ub ub, dove alpha incorpora le costanti sconosciute dipendenti dal sistema. Il modello diretto viene quindi discretizzato sulla mesh ipotizzata ed eseguita un'inversione per estrarre la distribuzione del fluorocromo, acquisire sia il segnale di trasmissione che quello fluorescente e utilizzare l'algoritmo convenzionale di retroproiezione per ricostruire il campione. Qui vengono mostrate le ricostruzioni mediante tomografia ottica a proiezione per trasmissione e fluorescenza convenzionale.

Viene mostrata una ricostruzione di un singolo piano del cuore sia in assorbimento che in fluorescenza. È presentata la ricostruzione normalizzata di Born, che evidenzia la differenza nella distribuzione del colorante all'interno del cuore. Dopo la normalizzazione, vi abbiamo appena illustrato come configurare la tomografia a proiezione ottica e come rimuovere gli artefatti dovuti all'assorbimento ottico nelle ricostruzioni della tomografia di fluorescenza.

È infatti molto importante tenere presente la necessità di chiarire il campione al fine di eliminare il contributo della luce dispersa, ma allo stesso tempo è altrettanto importante bilanciare il processo di chiarificazione per mantenere il più possibile il contributo della fluorescenza. Un altro aspetto molto importante da ricordare quando si utilizza questo approccio è calcolare il rapporto normalizzato dell'osso, ottenuto dividendo le immagini di fluorescenza per quelle di assorbimento. Questo è tutto.

Grazie per aver partecipato al nostro esperimento visualizzato e buona fortuna con i vostri esperimenti.