La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l'imaging tutto il cuore

Per eseguire la tomografia a proiezione ottica normalizzata, il campione viene prima fissato e incorporato in un cilindro di coclea. Il campione viene quindi ruotato lungo un asse verticale e quindi illuminato uniformemente con una lunghezza d'onda di eccitazione, e la trasmissione viene misurata con un'ottica C, CD adatta. Il segnale fluorescente alla lunghezza d'onda viene misurato in modalità di transilluminazione.

Le immagini fluorescenti e di assorbimento acquisite vengono utilizzate per determinare il rapporto di nascita normalizzato e ricostruire la distribuzione dei quattro fluoro all'interno del campione. Ciao, mi chiamo Claudia Naone e lavoro presso i Centers for Systems Biology del Mass General Hospital, Harvard Medical School. Sono Danielle Raki dell'Istituto di Imaging Biologico e Medico dell'Università Tecnica di Monaco e dell'Al Center Munich.

Sono Giselle Fido. Sono il direttore di Experimental su Co qui al C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging di interi organi ex vivo in tempo reale utilizzando l'approccio normalizzato di Born per la tomografia a proiezione ottica.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la distribuzione della sonda molecolare a fluorescenza negli organi cavi. Quindi iniziamo. Questo video spiega la procedura per l'utilizzo della tomografia a proiezione ottica per l'imaging di tessuti o organi preparati e un video di accompagnamento.

Spieghiamo come utilizzare questo sistema per eseguire l'imaging time-lapse sullo sviluppo della drosofila. La tecnica di imaging tridimensionale della tomografia a proiezione ottica richiede una combinazione unica di ottiche e un tavolino rotante. In questo segmento del video, verrà illustrata la procedura di imaging.

Per iniziare, la sorgente luminosa primaria funge da sorgente sia per le misure di illuminazione che di assorbimento e, per fornire l'eccitazione fluorescente per le misure di fluorescenza, la sorgente luminosa primaria viene prima filtrata con un filtro di interferenza passa-banda stretto. Successivamente, la luce passa attraverso una serie di filtri a densità neutra fissa e variabile. A questi si aggiunge la presenza di un otturatore automatico per controllare la quantità di luce sul campione e per mantenerla sufficientemente bassa da evitare qualsiasi sbiancamento delle foto.

L'illuminazione uniforme del campione si ottiene utilizzando un espansore di fascio e una lente combinata del glande con una lente diffusore. Infine, i filtri ottici di interferenza passa-banda stretta vengono utilizzati per pulire otticamente la luce della sorgente di eccitazione. Il campione viene immerso in una soluzione di chiarificazione e tenuto in posizione per l'imaging all'interno di un tubo di vetro.

Il campione viene ruotato lungo il suo asse verticale per mezzo di uno stadio di rotazione ad alta velocità con una precisione assoluta di 0,05 gradi. Tre distinti controller manuali consentono di inclinare e regolare l'asse verticale del campione sul suo piano ortogonale. Il segnale assorbente viene acquisito in trans illuminazione e viene rilevato direttamente da una telecamera CCD.

Il segnale fluorescente viene filtrato attraverso un filtro di interferenza passa-banda stretto, accoppiato con un filtro passa-lungo e viene quindi raccolto con un obiettivo telecentrico. Gli obiettivi tele offrono il vantaggio di fornire caratteristiche uniche che li rendono ideali. Per la tomografia a proiezione ottica.

La presenza di un arresto del diaframma situato all'interno del gruppo dell'obiettivo nel punto focale dell'obiettivo è fondamentale. Assicura che l'immagine viaggi parallelamente all'asse ottico. In questo modo si elimina la distorsione prospettica e si ottiene un ingrandimento uguale su molti piani focali all'interno della profondità telecentrica.

Il segmento video successivo descrive una tecnica per la preparazione dei campioni. Seguirà la metodologia utilizzata per l'imaging. La preparazione del tessuto o dell'organo del campione per l'imaging tomografico si basa su una disidratazione del campione a base di etanolo che evita il restringimento asimmetrico.

Il completamento di questo processo richiede molti giorni. In questo video viene preparato un cuore di topo, ma il protocollo può essere applicato a qualsiasi tessuto o organo. Dimostreremo il nostro metodo di imaging a fluorescenza utilizzando il cuore di un animale che ha subito un infarto controllato.

In altre parole, una perdita di afflusso di sangue che porta a un'evidente necrosi dei tessuti in anticipo. Il topo è stato iniettato con pro da sei sensori fluorescenti attivi da 80 che riportano l'attività della catepsina nella guarigione. Miocardio: anestetizzare il topo per la perfusione e l'estrusione cardiaca utilizzando un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina, quindi iniettare 50 unità di eparina intraperitoneale per prevenire la coagulazione.

Cinque minuti dopo, eseguire la laparotomia longitudinale sull'animale completamente anestetizzato per rimuovere il sangue. Innanzitutto, apri la vena renale sinistra. Ora iniettare lentamente 20 millilitri di soluzione salina nella vena cava inferiore.

La soluzione salina sposta il sangue dopo aver eliminato tutto il sangue al microscopio da dissezione. Continuare a utilizzare i metodi operativi standard per aprire il torace e rimuovere il cuore. Ora, fissa il cuore per otto ore al 4% di PFA a quattro gradi Celsius.

Da questo punto in poi, le fasi di preparazione del tessuto devono essere eseguite al buio per evitare lo sbiancamento di eventuali agenti di contrasto fluorescenti o proteine applicate al tessuto. Quando la fissazione è completa, lavare via il PFA con un risciacquo di 15 minuti in PBS, il cuore ripulito viene quindi incorporato in una pozza di aros allo 0,8%. Una volta che l'aros si asciuga, l'agarosio viene tagliato attorno al tessuto per formare un blocco.

Successivamente, disidratare il cuore crittografato aros attraverso una serie di cinque fasi di immersione in etanolo al 20%, quindi concentrazioni progressivamente più elevate di etanolo e, infine, etanolo puro. Questa procedura di disidratazione aiuta ad evitare qualsiasi restringimento asimmetrico del campione. I primi quattro bagni in etanolo diluito devono essere eseguiti per un'ora e il bagno finale in etanolo al 100% deve essere eseguito per almeno 10 ore.

Una volta completati i trattamenti con etanolo, mettere il campione nella soluzione trasparente di Murray fino a quando il campione non si chiarisce, il che varia da poche ore a diversi giorni. Questa soluzione di chiarificazione imita l'acqua cellulare e l'indice corrisponde alle membrane cellulari, rendendo così il tessuto trasparente. L'etanolo in tracce minime può essere presente alla fine del processo di chiarificazione, dando origine a diversi artefatti nelle ricostruzioni dovuti al movimento termico dell'alcol all'interno della soluzione di chiarificazione stessa.

Per evitare questo problema, si consiglia un secondo ciclo di pulizia. Questo non dovrebbe richiedere più di quattro ore. Una volta completato, il campione è pronto per la proiezione ottica.

Tomografia con l'ausilio di un computer. La ricostruzione dell'assorbimento ottico in assenza di diffusione della luce può essere ottenuta utilizzando un comune algoritmo di retroproiezione del radon filtrato. Questo processo è analogo alla tomografia computerizzata a raggi X bidimensionale.

Posizionare il blocco di aeros nella camera di imaging trasparente riempita con la soluzione di pulizia. Ora montate la camera sul tavolino, illuminate il campione con un fascio fasciato per le misure di eccitazione e trasmissione. La scelta della sorgente di eccitazione si basa sulla proteina fluorescente scelta o sull'agente di contrasto per imaging molecolare.

È conveniente allineare l'asse verticale del campione parallelamente alla colonna di pixel del CCD. Ruotare il campione su 360 proiezioni utilizzando incrementi angolari di un grado, acquisire immagini ad ogni angolo in trans illuminazione sia alle lunghezze d'onda di assorbimento che di fluorescenza. Il software che esegue l'acquisizione controlla automaticamente l'otturatore sulla sorgente luminosa primaria per evitare l'illuminazione continua e ridurre lo sbiancamento delle foto del campione.

L'otturatore è particolarmente importante quando sono necessari lunghi tempi di integrazione per creare una ricostruzione 3D dai dati di assorbimento. È sufficiente utilizzare un algoritmo di retroproiezione del radon filtrato per la ricostruzione 3D dalle immagini fluorescenti. Devono essere presi in considerazione altri contributi di assorbimento, che sono descritti nel prossimo segmento video.

Dopo aver completato i passaggi necessari per una ricostruzione per assorbimento, ci sono alcuni passaggi in più per completare una ricostruzione fluorescente. La ricostruzione di una mappa ottica in assenza di diffusione della luce può essere ottenuta utilizzando un comune algoritmo di retroproiezione del radon filtrato. Il processo è analogo alla tomografia computerizzata a raggi X bidimensionale.

Nella ricostruzione della distribuzione della fluorescenza. L'assorbimento variabile spazialmente dipendente rende errato l'uso del radon inverso per la schiena, proiettando le immagini di fluorescenza influenzando gravemente le distribuzioni di proteine fluorescenti o sonde molecolari fluorescenti ottenute e la sua capacità di quantificazione. Ogni raggio alla lunghezza d'onda di eccitazione Lambda X che viene emesso da una posizione arbitraria della sorgente Xs, viene attenuato esponenzialmente mentre passa attraverso l'oggetto ripreso.

Dopo l'eccitazione, il fluorocromo situato in posizione X, la radiazione alla lunghezza d'onda di emissione viene filtrata e raccolta dai pixel CCD situati in posizione XD utilizzando il sistema di lenti di imaging Teleric. Sebbene la fluorescenza emessa non segua lo stesso percorso del raggio di eccitazione, l'intensità registrata ad ogni pixel approssima una proiezione di tutti i fluorocromi eccitati lungo l'intera zona focale corrispondente a questo particolare raggio di eccitazione. A causa dell'elevata telecentricità del sistema, l'oggetto ripreso viene quindi ruotato di 360 gradi e con la telecamera CCD vengono acquisite più misurazioni del rivelatore di sorgenti, UX alla lunghezza d'onda di eccitazione e UFL alla lunghezza d'onda di emissione.

Questi vengono poi combinati sotto il campo di nascita normalizzato UB definito come il rapporto dei due. La ricostruzione della distribuzione del fluorocromo può essere facilitata scrivendo il modello in avanti sia per l'eccitazione che per la propagazione della luce di emissione, la funzione dei verdi che descrive l'eccitazione. La propagazione dei raggi segue una semplice legge di Lambert della birra dove moo A è la distribuzione di assorbimento ottico precedentemente determinata.

L'intensità luminosa UX emessa dalla sorgente in eccesso di posizione e misurata dal rivelatore in posizione XD sul C.C, D può essere scritta come il prodotto della funzione verde con una costante B che dipende dal sistema. È quindi possibile calcolare la distribuzione precisa dell'intensità della luce di eccitazione GX lungo ciascun percorso del raggio. L'intensità di fluorescenza UFL rilevata al rivelatore XD che viene stimolata dalla luce emessa dalla sorgente Xs tiene conto del contributo di tutti i theros che sono stati eccitati lungo il percorso del raggio da X a xd.

Il modello in avanti del nostro problema di imaging può quindi essere scritto come ub ub, dove alpha incorpora le costanti incognite che dipendono dal sistema. Il modello in avanti viene quindi discretizzato sulla mesh assunta e viene eseguita un'inversione per estrarre la distribuzione del fluorocromo, acquisire sia la trasmissione che il segnale fluorescente e utilizzare l'algoritmo convenzionale di retroproiezione per ricostruire il campione. Qui vengono mostrate le ricostruzioni della tomografia a proiezione ottica a fluorescenza convenzionale e a trasmissione.

Una ricostruzione di un singolo piano del cuore è mostrata sia nell'assorbimento che nella fluorescenza. Viene presentata la ricostruzione normalizzata del nato che mostra la differenza nella distribuzione del colorante all'interno del cuore. Dopo la normalizzazione, ti abbiamo appena mostrato come essere la configurazione per la tomografia a proiezione ottica e come rimuovere gli artefatti dovuti all'assorbimento ottico nelle ricostruzioni per la tomografia a fluorescenza.

È infatti molto importante tenere a mente di eliminare il campione per rimuovere il contributo della luce diffusa, ma allo stesso tempo è anche importante bilanciare il processo di pulizia per mantenere il più possibile il contributo della fluorescenza. Un'altra cosa molto importante da ricordare quando si utilizza questo approccio è calcolare il rapporto normalizzato osseo che si ottiene dividendo le immagini di fluorescenza per quelle di assorbimento. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver partecipato al nostro esperimento visualizzato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.