Microscopia correlativa per l'analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

L'obiettivo generale di questo procedimento è dimostrare l'utilizzo del metodo microscopico correlative fluorescente a luce e criomicroscopia elettronica, ottenendo immagini di piccole particelle dinamiche di HIV-1 in interazione con cellule ospiti HeLa. Questo viene realizzato innanzitutto seminando e coltivando cellule HeLa su una griglia EM con punti di riferimento in oro all'interno di una piastra per colture con fondo in vetro, e infettando le cellule HeLa con particelle di HIV-1 marcate con GFP. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere immagini confocali tridimensionali in tempo reale ad alta velocità di cellule infettate da HIV-1, e analizzare le immagini mediante tracciamento automatizzato tridimensionale delle particelle per studiarne la dinamica singola dopo la vetrificazione.

Il campione, le stesse particelle virali provenienti dai dati di microscopia a fluorescenza in tempo reale, viene localizzato nelle immagini criofluorescenza per un'ulteriore analisi tridimensionale ad alta risoluzione mediante tomografia elettronica criogenica. L'ultimo passaggio consiste nel raccogliere serie di proiezioni criogeniche in EM a diversi angoli di inclinazione per tutte le posizioni identificate contenenti particelle di HIV-1 e nel ricostruire le tomografie 3D mediante un algoritmo di retroproiezione pesata utilizzando il software imad. In definitiva, la microscopia avanzata in fluorescenza 3D correlativa in tempo reale e la tomografia elettronica criogenica ad alta risoluzione vengono utilizzate per visualizzare direttamente particelle virali dinamiche, limitate nella diffrazione, e le loro interazioni con le cellule ospiti.

Il nostro lavoro mira a sviluppare un metodo di correlazione che permetta la visualizzazione diretta esclusivamente degli eventi di infezione da HIV-1. Combinando in questo modo la microscopia fluorescente in tempo reale su cellule vive, la microscopia fluorescente criogenica e la tomografia elettronica criogenica, i segnali fluorescenti ottenuti da cellule vive e in condizioni criogeniche possono guidare in modo significativo il campionamento nella tomografia elettronica criogenica. Inoltre, le informazioni strutturali ottenute dalla tomografia elettronica criogenica possono essere integrate con i dati funzionali dinamici disponibili tramite l'imaging in tempo reale di bersagli marcati con fluorocromi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nell'applicazione di un approccio correlative di imaging 3D in tempo reale ad alta velocità abbinato a tomografia elettronica 3D corale ad alta risoluzione, utile per studiare eventi dinamici difficili da catturare per natura, come le interazioni tra il virus dell'HIV di tipo 1 e la cellula ospite nelle fasi iniziali dell'infezione.

Per preparare la griglia per la coltura cellulare, sottoporre a scarica al plasma la faccia con rivestimento di carbonio di una griglia EM con rinforzo R due su due da 200 mesh e foglio quantitativo in oro, utilizzando una corrente di 25 milliampere per 25 secondi. Rivestire la griglia EM con fibrinina ponendola a galleggiare, con la faccia al carbonio rivolta verso il basso, su una goccia di 40 microlitri di soluzione di fibrinina a 50 microgrammi per millilitro. Lasciarla all'interno di una cappa a flusso laminare sotto luce UV per due ore per la disinfezione; quindi seminare cellule HeLa sulla griglia a una densità di due per 10 alla quarta cellule per millilitro in una piastra per colture con fondo in vetro.

In DMEM con integratori appropriati, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per circa 18 ore prima dell'infezione da HIV. Prima dell'infezione da HIV, aggiungere un marcatore fluorescente per cellule alle cellule HeLa nella piastra per colture con fondo in vetro e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti per consentire l'assorbimento del colorante fluorescente, lavare le cellule con PBS e aggiungere 50 microlitri di mezzo fresco preriscaldato. Posizionare la piastra nella camera per cellule vive a 37 gradi Celsius di un microscopio confocale a scansione con campo spazzolato. Poiché la microscopia elettronica criogenica richiede regioni relativamente sottili del campione.

Selezionare più campi che contengono da una a tre cellule per quadrato, con le cellule in fase intermedia tra due mitosi, quando sono più distanziate e appiattite, e memorizzare queste posizioni mediante il software NIS element per future acquisizioni di immagini. Successivamente, infettare le cellule con particelle di HIV pseudotipizzate con VSVG che contengono G-F-P-V-P-R e aggiungere le particelle virali nel pozzetto inferiore della piastra, avendo cura di non disturbare la griglia per microscopia elettronica. Poiché le posizioni per l'acquisizione sono già state selezionate e memorizzate, immediatamente dopo l'aggiunta del virus, acquisire immagini confocali tridimensionali in tempo reale ad alta velocità nelle posizioni precedentemente selezionate per un periodo di 20-40 minuti.

Immediatamente dopo l'acquisizione confocale di cellule vive, posizionare la piastra di coltura su un blocco di rame raffreddato con ghiaccio e trasferirla nella stanza per la preparazione dei campioni per microscopia elettronica criogenica. Caricare la griglia per microscopia elettronica sulle pinzette specializzate, asciugare rapidamente con carta da filtro il mezzo di coltura residuo e posizionare immediatamente sulla griglia alcuni microlitri di una soluzione di microsfere d'oro da 15 nanometri mescolata con microsfere fluorescenti da 0,2 micron. Le microsfere fluorescenti vengono utilizzate per facilitare la correlazione tra fluorescenza e microscopia elettronica criogenica.

Caricare le pinzette sul dispositivo di vetrificazione per la congelazione rapida, utilizzando parametri di asciugatura ottimizzati per ottenere i migliori risultati. Per iniziare la procedura di microscopia criogenica a fluorescenza, collegare una linea di gas azoto secco a un manicotto posizionato sopra l'obiettivo per mantenere l'obiettivo caldo e privo di brina; montare un supporto campione criogenico a fluorescenza costruito in laboratorio su un microscopio a fluorescenza invertito. Collegare l'ingresso di azoto liquido del supporto campione criogenico al dewar autopressurizzato e inserire l'uscita di sicurezza per il troppo pieno di azoto liquido in un contenitore adeguato.

Posizionare la griglia del campione congelata e idratata nella cartuccia del campione per microscopia elettronica sul blocco di rame e posizionare un anello di fissaggio C pre-raffreddato sopra per mantenere ferma la griglia. Inserire la cartuccia nella camera interna della fase criogenica ed eseguire una ricerca per individuare le stesse particelle virali presenti nei dati di imaging cellulare in tempo reale. Poiché la griglia per microscopia elettronica è dotata di un indice, è semplice localizzare la stessa particella sulla griglia sia nelle immagini di cellule vive che nelle immagini di fluorescenza criogeniche.

Acquisire immagini cryo DIC e a fluorescenza nelle posizioni identificate in condizioni criogeniche utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a lunga distanza di lavoro. Durante l'acquisizione criogenica a fluorescenza, verificare periodicamente il livello di azoto liquido nella fase criogenica e ricaricarlo con un erogatore autopressurizzato secondo necessità, mantenendo la temperatura della piastra del campione al di sotto di -170 gradi Celsius per la tomografia criogenica con microscopio elettronico. Caricare la griglia del campione nella stazione di trasferimento criogenica di un microscopio elettronico dotato di cannone a emissione di campo, in modalità di ricerca a basso dosaggio, con un ingrandimento di 140 x.

Identificare le regioni o i quadrati della griglia in cui sono state acquisite le immagini di fluorescenza criogeniche. Registrare un'immagine criogenica a basso ingrandimento in microscopia elettronica dell'area correlata e salvare la posizione in un file della piattaforma in modalità di ricerca a basso dosaggio a un ingrandimento di 3.500x. Inserire un diaframma obiettivo da 100 micron per la ricerca e salvare tutte le posizioni correlate ai segnali GFP in un secondo file della piattaforma.

Impostare i parametri di tomografia per l'acquisizione di una serie di inclinazioni, inclusi l'intervallo di angolo di inclinazione, la dose di elettroni, il valore di defuoco e gli schemi di inclinazione. Acquisire la serie di inclinazioni per tutte le posizioni salvate per iniziare questa procedura. Configurare la finestra principale in modo che diverse fasi del calcolo Tomo Graham possano essere regolate o seguite contemporaneamente, modificare i parametri necessari ed eseguire i programmi specifici richiesti da ciascun passaggio di elaborazione.

Nella fase finale, creare uno stack allineato completo con un errore residuo principale inferiore a 0,6 e ricostruire le tomografie mediante un algoritmo di retroproiezione pesata. In modalità Im per caratterizzare il comportamento dinamico delle particelle virali. Cellule HeLa infettate con HIV-1 sono state acquisite mediante microscopia confocale ad alta velocità su cellule vive e i movimenti delle particelle sono stati analizzati mediante tracciamento automatico delle particelle in 3D.

In questa figura rappresentativa, una singola particella virale fluorescente verde indicata dalla freccia gialla è stata tracciata in serie confocali 3D con un intervallo temporale di tre minuti tra i fotogrammi, al fine di evitare il ritardo di diversi minuti che può verificarsi tra l'acquisizione dell'ultima immagine confocale di cellule vive e il congelamento rapido. È stato progettato e costruito uno stadio per microscopia a fluorescenza criogenica per l'acquisizione di immagini di campioni idratati congelati all'interno di cartucce per microscopia elettronica criogenica.

Nel microscopio ottico, il pannello A mostra un contenitore autopressurizzato riempito con azoto liquido, utilizzato per raffreddare la piattaforma campione in rame per la crio-microscopia. Il pannello B mostra la vista superiore interna della piattaforma campione per crio-microscopia, con la camera interna indicata dalla freccia bianca. La griglia del campione viene posizionata sul portacampione per microscopia elettronica, che si trova al centro di una piattaforma in blocco di rame indicata dalla freccia nera.

Questa piattaforma è stata aggiunta per l'uso con microscopi elettronici non polari. Una volta caricata con la griglia del campione, le cartucce vengono trasferite nella camera interna per la microscopia elettronica criogenica a fluorescenza. I pannelli C e D mostrano rispettivamente la cartuccia del campione prima e dopo aver posizionato un anello di rame per mantenere la griglia in posizione durante l'uso con un microscopio elettronico criogenico non polare.

L'utilità della procedura per la microscopia correlative avanzata di cellule vive e per la tomografia crioelettronica è dimostrata mediante la visualizzazione diretta di particelle di HIV V una marcate con fluorescenza in interazione con una cellula ospite HeLa. Un'immagine DIC registrata con uno stadio di microscopia crioluce mostrata nel pannello A è sovrapposta a un'immagine criofluorescenza di particelle marcate con GFP mostrata nel pannello B. Le particelle marcate sono colorate. I pannelli rossi C, D ed E sono immagini criomicroscopiche elettroniche a basso dosaggio della regione contenente una particella fluorescente cerchiata nei pannelli B e C, rispettivamente a 140 x 3, 500 x e 27.500 x.

L'insetto nel pannello E è una vista ingrandita registrata dopo l'acquisizione delle serie di inclinazione tomografiche; i pannelli F, G e H mostrano tre fette tomografiche spesse quattro nanometri, separate da una distanza di 21 nanometri nella direzione Z. Le connessioni tra la particella e la membrana della cellula helo sono indicate da frecce sia nell'immagine di proiezione nell'insetto e nel pannello E, sia nelle fette tomografiche. Nei pannelli F e G.

Abbiamo presentato un insieme semplice di protocolli per fornire un approccio correlativo avanzato per analizzare le interazioni dinamiche tra virus e strutture non infettive, utilizzando l'immagine di fluorescenza confocale a cellule vive con acquisizioni a intervalli di tempo seguita da tomografia elettronica criogenica. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che una correlazione precisa e affidabile tra l'immagine fluorescente e l'immagine di microscopia elettronica è fondamentale per l'acquisizione con successo della tomografia elettronica criogenica. I dati ottenuti con questa procedura saranno utili per numerose applicazioni che coinvolgono processi cellulari dinamici in biologia cellulare, come l'internalizzazione dei recettori di superficie nel segnaling cellulare.