Microscopia correlativa per l'analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso della luce fluorescente correlativa e del metodo di microscopia crioelettronica mediante l'imaging di piccole particelle dinamiche di HIV one che interagiscono con le cellule hela dell'ospite. Ciò si ottiene prima placcando e facendo crescere le cellule heela sulla griglia EM gold finder in un piatto di coltura con fondo di vetro e infettando le cellule heela con particelle HIV 1 marcate con GFP. Il secondo passo consiste nel raccogliere immagini confocali di cellule vive 3D ad alta velocità in time-lapse di cellule infette da HIV e analizzare le immagini mediante tracciamento automatizzato di particelle 3D per la dinamica di singole particelle dopo la vitrificazione.

Il campione, le stesse particelle virali provenienti dai dati di imaging delle cellule vive si trovano in immagini crio-fluorescenti per ulteriori analisi di crio-tomografia elettronica 3D ad alta risoluzione. Il passaggio finale consiste nel raccogliere serie di proiezioni criogeniche EM inclinate per tutte le posizioni identificate contenenti le prime particelle di HIV e ricostruire i tom 3D con un algoritmo di retroproiezione ponderato utilizzando il software imad. In definitiva, la microscopia a fluorescenza 3D correlativa su cellule vive e la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione vengono utilizzate per visualizzare direttamente le particelle virali limitate dalla diffrazione dinamica e le loro interazioni con le cellule ospiti.

Il nostro lavoro è finalizzato allo sviluppo di un metodo di correlazione che consenta la visualizzazione diretta dei soli eventi di infezione da HIV Combinando in questo modo la microscopia a fluorescenza su cellule vive come la microscopia, la crio-microscopia a fluorescenza e la crio-tomografia elettronica, i segnali su cellule vive e crio-fluorescenti possono essere utilizzati per guidare notevolmente il campionamento nella crio-tomografia. Inoltre, le informazioni strutturali ottenute dalla tomografia crioelettronica possono essere integrate con i dati funzionali dinamici disponibili attraverso l'imaging dello stile di vita di bersagli marcati in fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica o del metodo esistente è che l'imaging avanzato correlativo dello stile di vita 3D ad alta velocità con approccio di tomografia elettronica dei coralli 3D ad alta risoluzione viene applicato per studiare eventi dinamici che sono per natura difficili da rilevare, come l'HIV di tipo uno e le interazioni delle cellule ospiti nella fase iniziale dell'infezione.

Per preparare la griglia per la coltura cellulare, scaricare il lato in carbonio di una lamina R 200 mesh due su due, griglia di ricerca EM dorata sotto i 25 milliampere per 25 secondi per 25 secondi. Rivestire la griglia EM con fibra nin facendola galleggiare con il lato di carbonio rivolto verso il basso su una goccia da 40 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di soluzione di fibra nin. Lasciarlo in una cappa di coltura tissutale sotto la luce UV per due ore per la disinfezione delle cellule hela sulla griglia a una densità di due volte 10-4 cellule per millilitro in una piastra di coltura con fondo di vetro.

In DMEM con integratori appropriati, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per circa 18 ore prima dell'infezione da HIV una prima dell'infezione da HIV, aggiungere un tracker cellulare fluorescente alle cellule hela nella piastra di coltura con fondo di vetro e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti per consentire l'assorbimento del colorante fluorescente, lavare le celle con PBS e aggiungere 50 microlitri di terreno fresco di preriscaldamento. Posizionare il piatto nella camera delle cellule vive a 37 gradi Celsius di un microscopio scanner confocale a campo spazzato. Poiché la crioEM richiede regioni relativamente sottili del campione.

Seleziona più campi che contengono da una a tre celle per quadrato con le celle tra due fasi di mitosi quando sono più distribuite e memorizza queste posizioni con il software dell'elemento NIS per l'imaging futuro. Successivamente, infettare le cellule con VSVG, particelle pseudo tipizzate dell'HIV uno che contengono G-F-P-V-P-R e le particelle virali nel pozzetto inferiore del piatto, facendo attenzione a non disturbare la griglia EM. Poiché le posizioni per l'imaging sono già state selezionate e memorizzate immediatamente dopo l'aggiunta delle varians, raccogliere immagini confocali 3D ad alta velocità time-lapse nelle posizioni precedentemente selezionate per 20-40 minuti.

Subito dopo l'imaging confocale di cellule vive, posizionare la piastra di coltura su un blocco di rame raffreddato con ghiaccio e trasferirla nella sala di preparazione dei campioni cryo EM. Caricare la griglia EM sulle pinzette specializzate, asciugare rapidamente il terreno di coltura residuo con carta da filtro, posizionarla immediatamente sulla griglia per microlitri di una soluzione di perle d'oro a 15 nanometri mescolata con microsfere fluorescenti da 0,2 micron. Le microsfere fluorescenti vengono utilizzate per aiutare la correlazione tra fluorescente e crio-EM.

Caricare le pinzette sul dispositivo di vetrificazione per il congelamento a tuffo con i parametri di blotting ottimizzati per ottenere i migliori risultati. Per iniziare la procedura per la microscopia ottica a criofluorescenza, collegare una linea di azoto gassoso secco a un manicotto posizionato sopra la lente dell'obiettivo per mantenere la lente calda e priva di gelo, montare un tavolino per campioni di criofluorescenza costruito in casa su un microscopio ottico a fluorescenza invertita. Collegare l'ingresso dell'azoto liquido dello stadio di campionamento cryos all'esecutore autopressurizzato e posizionare l'uscita di protezione contro il trabocco dell'azoto liquido in un contenitore appropriato.

Posizionare la griglia del campione idratato congelato nella cartuccia del campione EM sul blocco di rame e posizionare un anello a clip C pre-raffreddato sulla parte superiore per mantenere la griglia in posizione. Posiziona la cartuccia nella camera interna della ricerca dello stadio criogenico e trova le stesse particelle virali dai dati di imaging delle cellule vive. Poiché la griglia EM ha un indice, è semplice localizzare la stessa particella sulla griglia sia nelle immagini di cellule vive che nelle immagini di criofluorescenza.

Acquisisci immagini criogeniche e a fluorescenza nelle posizioni identificate in condizioni criogeniche utilizzando un microscopio ottico con una lente obiettivo di lavoro lunga. Durante l'imaging a criofluorescenza, controllare periodicamente il livello di azoto liquido nella fase criogenica e riempirlo con un esecutore autopressurizzato secondo necessità per mantenere la fase del campione al di sotto di -170 gradi Celsius per la tomografia crioelettronica. Caricare la griglia del campione nella stazione di trasferimento criogenico di un microscopio elettronico dotato di una pistola a emissione di campo in modalità di ricerca a bassa dose con un ingrandimento di 140 x.

Identificare le regioni o i quadrati della griglia in cui sono state acquisite le immagini di criofluorescenza. Registrare un'immagine cryo EM a basso ingrandimento dell'area correlata e salvare la posizione in un file di tavolino in modalità di ricerca a bassa dose con un ingrandimento di 3.500 x. Inserire una ricerca dell'apertura dell'obiettivo di 100 micron e salvare tutte le posizioni correlate con i segnali GFP in un file di secondo stadio.

Imposta i parametri della tomografia per l'acquisizione di una serie di inclinazioni, inclusi l'intervallo dell'angolo di inclinazione, la dose di elettroni, il valore di sfocatura e gli schemi di inclinazione. Acquisire la serie di inclinazione per tutte le posizioni salvate per iniziare questa procedura. Configura la finestra principale in modo tale che diverse fasi del calcolo di Tomo Graham possano essere regolate o seguite contemporaneamente, modifica i parametri necessari ed esegui i programmi specifici richiesti da ogni fase di elaborazione.

Nella fase finale, creare uno stack completamente allineato con un errore residuo principale inferiore a 0,6 e ricostruire i Tom utilizzando un algoritmo di retroproiezione ponderata. In Im mod per caratterizzare il comportamento dinamico delle particelle virali. Le cellule Hela infettate da HIV uno sono state visualizzate mediante microscopia confocale su cellule vive ad alta velocità e i movimenti delle particelle sono stati analizzati mediante tracciamento automatizzato delle particelle in 3D.

In questa figura rappresentativa, una singola particella virale fluorescente verde indicata dalla punta della freccia gialla è stata tracciata in pile confocali 3D con un intervallo di tempo di tre minuti tra i fotogrammi per evitare il lasso di tempo di diversi minuti. Ciò può verificarsi tra la raccolta dell'ultima immagine confocale di cellule vive e il congelamento a tuffo. È stato progettato e costruito uno stadio di microscopia ottica a fluorescenza criogenica per l'imaging di campioni idratati congelati all'interno di cartucce crioEM.

Sul microscopio ottico, il pannello A mostra un esecutore autopressurizzato riempito di azoto liquido che viene utilizzato per raffreddare lo stadio di campionamento del criogenio in rame. Il pannello B mostra la vista interna superiore dello stadio del campione di criosi con la camera interna indicata dalla punta di freccia bianca. La griglia del campione viene posizionata sulla cartuccia del campione E EM, che si trova al centro di una piattaforma di blocchi di rame indicata dalla freccia nera.

Questa piattaforma è stata aggiunta per l'uso con microscopi elettronici non polari. Una volta caricate con la griglia del campione, le cartucce sono state trasferite nella camera interna per la luce a fluorescenza cric. I pannelli di microscopia C e D mostrano rispettivamente la cartuccia del campione prima e dopo il posizionamento di un anello di rame per mantenere la griglia in posizione per l'uso con un microscopio crioelettronico non polare.

L'utilità della procedura per la microscopia correlativa avanzata delle cellule vitali e la tomografia crioelettronica è dimostrata con la visualizzazione diretta delle particelle HIV V one marcate in fluorescenza che interagiscono con una cellula heela ospite. Un'immagine DIC registrata con uno stadio di crioscopia al microscopio ottico mostrata nel pannello A è sovrapposta a un'immagine a criorescenza di particelle marcate GFP mostrate nel pannello B. Le particelle marcate sono colorate. I pannelli rossi C, D ed E sono immagini crio-EM a basso dosaggio della regione contenente una particella fluorescente cerchiata nei pannelli B e C rispettivamente a 140 x 3, 500 x e 27, 500 x.

L'inserto nel pannello E è una vista ingrandita registrata dopo l'acquisizione dei pannelli tomografici della serie di inclinazione, FG e H mostrano tre fette tomografiche spesse quattro nanometri separate da una distanza di 21 nanometri in direzione Z. Le connessioni tra la particella e la membrana cellulare dell'elicottero sono indicate da frecce sia nell'immagine di proiezione nel riquadro e nel pannello E che nelle sezioni tomografiche. Nei pannelli F e g.

Abbiamo presentato una serie semplice di protocolli per fornire un approccio correlativo avanzato per analizzare le interazioni dinamiche tra virus e sterili utilizzando l'imaging a fluorescenza di cellule lipo confocali in time lapse seguito da tomografia crioelettronica. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che una correlazione precisa e affidabile tra l'immagine fluorescente e l'immagine al microscopio elettronico è fondamentale per il successo dell'acquisizione della tomografia elettronica del corvo. I dati descritti in questa procedura saranno utili per numerose applicazioni che coinvolgono processi cellulari dinamici in biologia cellulare, come l'internalizzazione dei recettori di superficie di segnalazione cellulare.