Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Junction (NMJ): Eine Methode zur Bewertung der synaptischen Morphologie und Funktion

- Erstens, immunostain Drosophila Larven mit Markern, die verschiedene Aspekte von NMJs oder neuromuskulären Knoten hervorheben. Dies ist die Region, in der das Ende eines motorischen Neuronenaxons einen Muskel kontaktiert, und seine Morphologie wird als Auslese der synaptischen Funktion verwendet.

Das Axon endet in mehreren Zweigen, die Wölbungen bilden, die Boutons genannt werden. Neurotransmitter werden von Boutons freigesetzt und verursachen Muskelkontraktion. Bereiche der Neurotransmitter-Freisetzung werden aktive Zonen genannt. Hier ist ein Marker spezifisch für ein synaptisches Protein, das das NMJ umreißt, und der andere Marker ist für ein Protein, das in aktiven Zonen vorhanden ist.

Als nächstes erfassen Sie NMJ-Bilder mittels Mikroskopie und bewerten quantitativ ihre Morphologie mit halbautomatischer Bildanalyse-Software. Wenden Sie eine voreingestellte Reihe von Software-Befehlen auf die Bilder an. Die Ausgabedateien enthalten analysierte NMJ-Bilder und Morphologie-Ergebnisse. Zu den Messwerten gehören Anzahl und Oberfläche von Boutons, NMJ-Länge und Astzahl, Anzahl der nicht verbundenen NMJ-Fächer und Anzahl der aktiven Zonen.

Im folgenden Beispiel analysieren wir die Morphologie von Drosophila NMJs, die mit DLG1, einem postsynaptischen Marker, und BRP, einem aktiven Zonenmarker, befleckt sind.

- Für dieses Protokoll, generieren Sie Bild-Stacks von NMJs und speichern Sie sie als einzelne TIFF-Dateien, wo Kanal 1 zeigt DLG1 Färbung oder ähnliche Marker und Kanal 2 zeigt BRP Färbung. Um zu beginnen, erstellen Sie Z-Projektionen und Hyperstacks der NMJ-Bilddateien. Öffnen Sie die Plugin-Optionen und wählen Sie Drosophila NMJ Morphometrie.

Identifizieren Sie nun die eindeutige Dateizeichenfolge, die das Mikroskop der Bildreihe zugewiesen hat, wenn Sie sie als TIFF speichern. Dies wird am Ende des Bildnamens sein. Kopieren Sie die Zeichenfolge, die der niedrigsten Ebene und Kanalnummer gegeben wird, und fügen Sie sie in das eindeutige Dateizeichenfolgeneinstellungsfenster ein. Wählen Sie dann das Submakro 'Konvertieren in Stapel' und wählen Sie das Verzeichnis oder den Ordner aus, in dem sich die Bilder befinden.

Für jede Bilddatei werden zwei neue Dateien mit den Standardnamen Stack und Flat Stack erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Bildnamen. Die Originaldateien können dann gelöscht werden, um Speicherplatz zu sparen. Als nächstes wählen Sie aus der Drosophila NMJ Morphometrics Schnittstelle das definierte ROI-Submakro und wählen Sie das Bilddateiverzeichnis aus.

Wenn die erste Projektion geöffnet wird, wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug aus, und definieren Sie dann mit der Maus einen Bereich, der ein komplettes NMJ-Terminal von Interesse enthält. Sobald Sie ausgewählt sind, klicken Sie im definierten Terminalfenster auf OK. Fahren Sie damit fort, bis die NMJ-Terminals in allen Projektionen definiert sind. Das Makro treibt den Prozess automatisch voran. Für jede Bilddatei wird eine neue Datei mit den Standardnamen ROI erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Bildnamen.

Um die NMJ-Funktionen zu quantifizieren, Gehen Sie zuerst zur Drosophila NMJ morphometrics Schnittstelle und legen Sie die Skala fest. Wenn z. B. ein Pixel des Bildes 0,72 Mikrometern entspricht, setzen Sie die Skalierungspixel auf 1 und skalieren Sie den Abstand auf 0,072. Wählen Sie dann das Submakro Analyze aus, und wenn es zwei Kanalbilder gibt, schalten Sie auch Wait um. Drücken Sie OK und wählen Sie bei Aufforderung das Bilddateiverzeichnis aus. Die Verarbeitungszeit kann mehrere Minuten pro Synapse betragen.

Nach der Analyse werden neue Bilddateien für jede analysierte Synapse im Elternordner gespeichert, und die quantitativen Messungen befinden sich in den Ergebnissen.txt Datei. Prüfen Sie alle Bilder und schließen Sie Bilder mit Segmentierungsfehlern aus.

Zum Beispiel können Teile der synaptischen Klemme nicht in der gelben Umrisslinie enthalten sein. Teile des Hintergrunds können in der synaptischen Klemme enthalten sein. Eine blaue Skelettlinie kann über die synaptische Klemme hinaus reichen. Es kann zu viele aktive Zonen geben, oder einige aktive Zonen bleiben unentdeckt.