Drosophila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um método para avaliar a morfologia e a função sinapática

- Primeiro, as larvas de drosophila imunossundo com marcadores que destacam diferentes aspectos de NMJs ou junções neuromusculares. Esta é a região onde o final de um axônio neurônio motor entra em contato com um músculo, e sua morfologia é usada como leitura da função sináptica.

O axônio termina em vários ramos que formam protuberâncias chamadas boutons. Neurotransmissores são liberados de boutons e causam contração muscular. Áreas de liberação de neurotransmissores são chamadas de zonas ativas. Aqui um marcador é específico para uma proteína sináptica que descreve o NMJ, e o outro marcador é para uma proteína presente em zonas ativas.

Em seguida, adquira imagens NMJ usando microscopia e avalie quantitativamente sua morfologia com software de análise de imagem semi-automatizada. Aplique uma série predefinida de comandos de software para as imagens. Os arquivos de saída contêm imagens NMJ analisadas e resultados de morfologia. Os recursos que podem ser medidos incluem número e área de superfície de boutons, comprimento de NMJ e número de ramificação, número de compartimentos NMJ não conectados e número de zonas ativas.

No exemplo a seguir, analisaremos a morfologia de NMJs Drosophila manchados com DLG1, um marcador postinápico, e BRP, um marcador de zona ativa.

- Para este protocolo, gere pilhas de imagens de NMJs e salve-os como arquivos TIFF individuais onde o canal 1 mostra a coloração do DLG1 ou marcador similar e o canal 2 mostra a coloração brp. Para começar, crie projeções Z e hiperssuas dos arquivos de imagem NMJ. Abra as opções de plugin e selecione morfometria Drosophila NMJ.

Agora, identifique a sequência de arquivos única que o microscópio atribuiu à série de imagens ao armazená-las como TIFF. Esta será no final do nome da imagem. Copie e cole a sequência dada ao plano mais baixo e número do canal na janela de configuração de sequência de sequência de arquivos única. Em seguida, selecione a sub-macro 'Converter para pilha' e escolha o diretório ou pasta onde as imagens estão localizadas.

Para cada arquivo de imagem, dois novos arquivos são feitos com a pilha de nomes padrão e pilha plana, seguidos pelo nome de imagem original. Os arquivos originais podem então ser excluídos para salvar o espaço de armazenamento. Em seguida, a partir da interface morfométrica Drosophila NMJ, selecione a sub-macro roi definida e escolha o diretório de arquivos de imagem.

À medida que a primeira projeção é aberta, selecione a ferramenta de seleções à mão livre e use o mouse para definir uma região contendo um terminal completo de interesse do NMJ. Uma vez selecionado, clique em OK na janela do terminal definido. Continue fazendo isso até que os terminais NMJ sejam definidos em todas as projeções.

Para quantificar os recursos do NMJ, primeiro vá para a interface morfométrica Drosophila NMJ e defina a escala. Por exemplo, se um pixel da imagem corresponde a 0,72 mícrons, defina pixels de escala para 1 e dimensione a distância para 0,072. Em seguida, selecione a sub-macro Analisar e se houver duas imagens de canal, alterne também a espera. Pressione OK e, quando solicitado, selecione o diretório de arquivos de imagem.

Após a análise, novos arquivos de imagem para cada sinapse analisada são armazenados na pasta parental, e as medidas quantitativas estão nos resultados.txt arquivo. Inspecione todas as imagens e exclua imagens com erros de segmentação.

Por exemplo, partes do terminal sináptico podem não ser incluídas no contorno amarelo. Partes do fundo podem ser incluídas no terminal sináptico. Uma linha de esqueleto azul pode se estender além do terminal sináptico. Pode haver muitas zonas ativas, ou algumas zonas ativas podem permanecer não detectadas.