Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Cardiomiopatia é uma condição em que o músculo cardíaco enfraquece e perde a capacidade de bombear sangue. Esta condição pode ser replicada em zebrafish. Primeiro, diluir uma solução de estoque de uma droga responsável pela cardiotoxicidade na Solução de Sal Balanceado de Hanks para preparar várias concentrações de trabalho. Em seguida, coloque um peixe anestesizado tricaine, lado ventral para cima, em uma esponja de retenção sob um microscópio dissecando.
Agora empurre suavemente a agulha de 1 a 2 milímetros para dentro da cavidade peritoneal e injete lentamente a solução da droga. Espere cinco segundos antes de retirar a agulha para evitar que a solução vaze. Transfira imediatamente o peixe para um tanque limpo contendo água fresca do sistema. Registe o número de peixes morrendo todos os dias devido à cardiotoxicidade grave, danos ao músculo cardíaco. A droga liga-se aos receptores de morte presentes na membrana celular cardiomiócito e desencadeia apoptose, resultando em cardiotoxicidade grave.
Crie uma curva de sobrevivência, um gráfico que mostre a probabilidade de sobrevivência ao longo do tempo para cada concentração de drogas. No exemplo, injetaremos doxorubicina, ou DOX, para induzir a cardiomiopatia em um zebrafish adulto de duas maneiras.
Antes de injetar o peixe com DOX, jejuar o peixe por 24 horas. Em seguida, agrupar os peixes. Enquanto anestesiado, use um papel filtro limpo para secar cada peixe e medir seu peso corporal. Faça grupos de peixes que estejam todos dentro de 10% do mesmo peso corporal para que cada grupo possa ser injetado com a mesma dose de DOX. Em seguida, calcule a concentração de trabalho do DOX para cada grupo para que cada grupo seja injetado com cinco microliters de solução e receba a mesma dose de DOX por peso corporal.
Em seguida, diluir o estoque de DOX em 1x HBSS. Misture a diluição com um vórtice e, em seguida, gire a diluição para mantê-la agrupada no tubo. Para a injeção, prepare uma plataforma de injeção. Em uma placa de Petri limpa de 100 milímetros, coloque uma esponja.
Em seguida, em uma agulha de calibre 34, conecte uma microsinga de 10 microliter. Em seguida, enxágue a agulha com 1x HBSS para remover quaisquer bolhas ou blocos da seringa e tubo. Agora, anestesia brevemente o peixe adulto com tricaine. Em seguida, mergulhe a esponja na água do embrião com tricaine e transfira um peixe para a esponja com seu abdômen para cima para a injeção.
Em seguida, solte lentamente toda a solução DOX. Antes de retirar a agulha, espere cinco segundos. Alternativamente, o peixe pode ser posicionado lateralmente com o interior para a direita. Em seguida, injetou a linha lateral acima da barbatana pélvica com o bisel apontando para 7 horas em um ângulo de 45 graus e 3 a 4 milímetros de profundidade.
Após a injeção, transfira rapidamente o peixe para um tanque de travessia limpo cheio de água fresca do sistema onde ele pode se recuperar. Em seguida, enxágue a agulha com HBSS e prossiga para injetar o próximo peixe. Mais tarde, retorne o peixe injetado para um sistema com circulação de corrida, mas separado do sistema principal para evitar contaminação cruzada. Para as próximas 24 horas, continue a jejuar o peixe. Durante a primeira semana, pós-injeção, certifique-se de verificar o peixe diariamente e remover qualquer peixe morto.
