Metastasi sperimentale e CTL adottivi Immunoterapia modello di trasferimento del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'efficacia dell'immunoterapia a trasferimento adottivo con cellule T specifiche per il tumore in vivo. Ciò si ottiene prima trapiantando cellule tumorali tramite iniezione laterale della vena caudale nei topi al fine di stabilire metastasi polmonari. La seconda fase della procedura consiste nel trattare i topi portatori di tumore con CTL dei linfociti T citotossici specifici per il tumore.

Il passaggio finale consiste nell'utilizzare l'inchiostro di china come mezzo per visualizzare e quantificare i noduli tumorali. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la CIE di diversi trattamenti attraverso la misurazione delle dimensioni del tumore e la quantificazione del numero di noduli tumorali. Ciao, mi chiamo Mary Zimmerman e sono un membro del laboratorio del Dr.Kevin Lu presso il Medical College of Georgia.

Ciao, mi chiamo Shelene Hu.Sono una studentessa del secondo anno e lavoro anche nel laboratorio del Dr.Lou. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali come le curve di sopravvivenza è che questa procedura è sia qualitativa che quantitativa. L'implicazione delle tecniche può estendersi alla terapia del cancro perché imita l'immunoterapia adottiva delle cellule T nei pazienti oncologici umani.

Quindi iniziamo il giorno prima delle iniezioni di cellule tumorali semina una fiaschetta T 75 con un massimo di una volta 10 alla settima. CMS quattro cellule met in 10 millilitri di terreno RPMI contenente il 10% di siero. Per ottenere cellule tumorali a crescita rapida, incubare durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno dell'iniezione.

Rimuovere il terreno e sciacquare le cellule una volta con PBS, quindi raccogliere le cellule tumorali con tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Arrestare la reazione con 10 millilitri di terreno RPMI contenente il 10% di siero. Trasferire le cellule in una provetta conica.

Far girare le celle a 1300 giri/min in una centrifuga val legend RT per tre minuti. A temperatura ambiente, rimuovere lo snat, risospendere le cellule in 10 millilitri di XHB Ss fresco da lavare. Quindi gira di nuovo verso il basso e ririsolvi la sospensione allo stesso modo.

Contare le cellule tumorali su un emo. Citometro. Diluire le cellule in HBSS in modo che le cellule necessarie per ogni iniezione siano risospese. In un volume totale di 100 microlitri riscalda i topi B SEA di sei-otto settimane in un bicchiere, immersi in acqua tiepida.

Per dilatare la vena della coda, posizionare il mouse in un sistema di contenimento della vena della coda sulla panca. Usa una siringa micros per iniettare 100 microlitri di cellule tumorali nella vena della coda laterale. Utilizzare una tecnica settica per evitare l'infezione dopo l'iniezione.

Esercitare una leggera pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si è fermata. Rimetti il topo nella gabbia e lascia che il tumore cresca allo stadio desiderato. Il giorno del trasferimento, pipettare su e giù per risospendere i linfociti T citotossici purificati o i CTL preparati.

Come descritto nel testo, trasferire tutte le cellule da una piastra a una provetta conica da 15 millilitri, non lasciando che il volume superi i due terzi della provetta. Inserire una pipetta Pasteur sterile nel tubo conico e stratificare la separazione dei linfociti. Medium o LSM sotto le celle fino a quando il volume totale non si avvicina a 14 millilitri.

Fare attenzione a non disturbare gli strati. Centrifugare a 2000 giri/min per 20 minuti a temperatura ambiente. Non utilizzare il freno per rallentare il rotore dopo la centrifuga, trasferire i CTL in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere HBSS a un volume di circa 10 millilitri. Lavare. Contare le cellule, scendere a 1300 giri/min per cinque minuti: a temperatura ambiente, risospendere un HBSS alla densità cellulare richiesta per le iniezioni.

Mantenere il volume totale per iniezione a 100 microlitri. Usa la stessa tecnica di iniezione della coda vista in precedenza in questo video. Per iniettare i CTL nei topi portatori di tumore, riportare il topo nella gabbia e consentire ai CTL di interagire con il tumore.

I topi vengono solitamente sacrificati per l'analisi da 14 a 21 giorni dopo il trattamento con CTL. Per visualizzare le metastasi polmonari, posiziona un topo sacrificato sulla schiena su una tavola di polistirolo. Fissare le gambe per garantire un accesso senza ostacoli alla trachea.

Spruzzare il lato ventrale con etanolo al 70% partendo dalla metà dell'addome. Usa le forbici per tagliare lungo la linea mediana attraverso la gabbia toracica e fino alle ghiandole salivari. Esporre la trachea.

Usa una pinza per rimuovere i tessuti che circondano la trachea. Infilare un puntale per pipetta da 200 microlitri sotto la trachea, tenendo il puntale con una mano. Sollevare delicatamente la trachea verso l'alto e allontanarla dal corpo.

Ruota la piattaforma di 180 gradi. Utilizzare una siringa da 50 millilitri per iniettare l'inchiostro di china nei polmoni attraverso la trachea. Gonfiare completamente i polmoni con l'inchiostro fino a quando non si avverte una forte resistenza.

Usa le forbici per tagliare la trachea. Fai scorrere un paio di pinze sotto i polmoni ed estraile dal mouse. Sciacquare brevemente i polmoni in un becher da un litro d'acqua in una cappa chimica.

Trasferire i polmoni in un bicchiere di bile contenente cinque millilitri di soluzione FTI. Il tessuto tumorale emergerà come noduli bianchi sui polmoni neri. Dopo pochi minuti, i tumori possono ora essere contati e iniziare in soluzione FTI a tempo indeterminato. Qui.

Polmoni per topi trasfettati con carcinoma mammario. La linea cellulare quattro T one mostra macchie bianche che indicano tumori. I topi trasfettati con un IRF otto dominanti negativi immuni a K 79 E mostrano l'aumentato potenziale metastatico delle cellule tumorali.

Queste immagini mostrano un'analisi istologica dell'efficacia dell'immunoterapia a trasferimento adottivo CTL. I topi portatori di tumore iniettati con soluzione salina, hanno mostrato tumori multipli sei giorni dopo indicati da frecce. I topi iniettati con cellule T specifiche per il tumore, d'altra parte, hanno mostrato una riduzione dei tumori nello stesso esperimento.

Il trattamento con inchiostro di china offre un modo più semplice per misurare l'efficacia del trasferimento adottivo CTL. Qui i noduli tumorali bianchi sui polmoni portatori di tumore li distinguono chiaramente dai polmoni che sono stati sottoposti con successo al trasferimento adottivo CTL e il conteggio dei noduli consente un grado di quantificazione non possibile con l'istologia. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di riscaldare i topi per iniezioni della vena caudale più facili e accurate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'efficacia del trattamento attraverso questa semplice procedura per quantificare le dimensioni e il numero dei tumori. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.