Uso del mouse BLT umanizzato come cellule staminali basata su un Modello Tumore Terapia Genica

La generazione e la caratterizzazione di cellule T specifiche tumorali usando topi umanizzati è descritto qui. Umana tessuto timico e geneticamente modificate cellule staminali ematopoietiche vengono trapiantate in topi immunocompromessi. Ciò comporta la ricostituzione di un ingegnerizzato sistema immunitario umano consentendo in esame vivo delle risposte immunitarie anti-tumorali.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare topi portatori di un sistema immunitario umano ingegnerizzato. Ciò si ottiene preparando prima il topo per l'intervento chirurgico e poi caricando il trocar con un pezzo di timo nella seconda fase. Matrigel viene miscelato con cellule trasdotte CD 34 negative e CD 34 positive e la miscela viene quindi aggiunta al trocar.

Successivamente, i costrutti matrigel vengono trapiantati sotto la capsula renale. In definitiva, il rigetto dei tumori bersaglio da parte delle cellule T CD otto geneticamente modificate può essere monitorato mediante imaging di animali domestici dal vivo e misurazioni fisiche del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di metanfetamina esistenti come i modelli completamente neuronali, è che questo metodo consente lo studio dello sviluppo di cellule staminali umane geneticamente modificate all'interno del timo umano e i successivi test di efficacia in vivo di lignaggi derivati che dimostrano che la procedura sarà composta da tre tecnici dei nostri laboratori, Gregory Bristol, Bernard Levin, e Sean Kim.

In questo diagramma schematico, il modello BLT modificato utilizzato in questi studi per la generazione di topi chimerici portatori di mart, viene delineato uno specifico linfocito T. L'impianto th è ricostruito da cellule CD 34 trasdotte e non trasdotte isolate da un fegato fetale autologo. Una frazione delle cellule trasdotte viene quindi congelata e iniettata nei topi irradiati da quattro a sei settimane dopo.

In questo video, l'impianto del costrutto vivo viene dimostrato una volta che gli animali sono diventati pigri a causa dell'anestesia. Inizia radendo il lato sinistro di ciascun topo dall'anca alla spalla tra il centro della schiena e la pancia. Dopo aver registrato il peso di ogni animale, punzonare le orecchie per la numerazione e, per via sottocutanea, iniettare 0,3 millilitri di carprofene in ciascuna delle spalle.

Quindi adagiare i topi sul lato destro rivolti a sinistra. Ora lavare il trocar di un ago per impianto di cancro calibro 16 con una punta di lima rotonda con PBS. Utilizzando un paio di pinze per il naso ad ago, aggiungere un pezzo di timo al piatto di PBS e poi tenere il trocar orizzontale con l'asta.

Appena all'interno della punta aspirare il tessuto. Far scorrere il trocar sotto la capsula renale e iniettare il tessuto è uno degli aspetti più impegnativi di questa procedura. Quindi, chiedi a un aiutante.

Utilizzare una pipetta a spostamento positivo eend orph per miscelare cinque microlitri di matrigel freddo in una provetta di cellule agitando delicatamente. Mantenere il trocar orizzontale. Tirare lentamente indietro l'asta mentre l'aiutante pipetta il matri gel.

Mescolare al trocar per ogni topo. Per prima cosa, tamponare la pelle nuda dell'animale con Betadine e poi pulirla con una salvietta di isopropanolo. Due volte determinano la macchia più scura sotto la pelle, indicando la posizione della milza.

Il rene si trova a circa cinque millimetri dorsalmente alla milza usando una pinza smussata per raccogliere la pelle sopra il rene. Praticare un taglio lungo circa 15 millimetri nella pelle parallela alla milza. Fai un taglio simile nello strato muscolare del peritoneo sottostante.

Nei maschi, il rene dovrebbe essere direttamente visibile. Basta stringere l'addome per farlo uscire. Mantenendo la pressione sull'addome con la mano sinistra per mantenere il rene esposto nelle femmine, utilizzare prima un emostatico per raccogliere l'ovaio e poi trascinare fuori il rene per aiutare a trattenere l'organo al di fuori del corpo.

Praticare un piccolo foro nell'estremità posteriore della capsula renale e poi far scorrere il trocar in questo foro e lungo il rene fino a quando l'orifizio del trocar è completamente coperto dalla capsula renale. Quindi, usando il mignolo della mano destra, iniettare il fazzoletto. Ora usa l'emostatico chiuso per spingere delicatamente il rene in posizione.

Legare un punto nel peritoneo con un doppio fiocco, stringendo la pelle come una borsa, e poi metterlo in due clip per la ferita. Infine, metti una goccia di PBS su ciascun occhio e adagia il topo su un fianco in una gabbia sopra una lettiera. Dopo aver impiantato tutti i topi allo stesso modo, conferma che gli animali siano tornati a sdraiarsi a pancia in giù prima di lasciarli.

Questa prima figura mostra un'immagine rappresentativa dell'impianto vivo THI in topi umanizzati. In questa figura viene dimostrato il normale sviluppo del tessuto timico e la distribuzione tissutale fisiologica del CD quattro e del CD otto T positivi umani. Dopo la ricostituzione, gli animali portano un sistema immunitario umano con una distribuzione normale di cellule T positive CD quattro e CD otto.

Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa di un topo portatore di un tumore al melanoma. Le aree grigie indicano l'immagine della scansione TC. Le aree colorate indicano l'attività metabolica del tumore rilevata dalla scansione PET.

La TAC da sola in questo esperimento ha indicato una grande massa tumorale nell'area indicata dal cerchio bianco. Tuttavia, come illustra l'imaging PET in vivo, quest'area è costituita principalmente da tessuto necrotico e cicatriziale, sottolineando l'utilità dell'imaging PET come un modo più sensibile e accurato per valutare la regressione e la clearance del tumore. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri saggi come le cellule T, la fenotipizzazione e l'attivazione ex vivo per rispondere a domande rilevanti per la funzione delle cellule T.