Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico
24 settembre 2010
Dimostriamo un protocollo per l'isolamento axoplasm da nervo sciatico ratto adulto sulla base di dissezione di fasci nervosi e l'incubazione in media ipotonica per liberare mielina e lisare non assonale strutture, seguita da estrazione del restante assone arricchito di materiale.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il citoplasma assonale puro o l'ectoplasma dal nervo periferico. Ciò si ottiene sezionando prima il nervo sciatico. Il secondo passo della procedura consiste nel rimuovere il tessuto connettivo dal nervo e separare le lame.
La terza fase della procedura è l'incubazione di brevi segmenti di lese nervose in mezzo ipotonico. La fase finale della procedura è l'incubazione in soluzione isotonica, centrifugazione e opsm milian. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un alto grado di arricchimento per i componenti assonali mediante analisi western blot.
Ciao, mi chiamo Io, Elle E potrei Rosenbaum. Veniamo dal laboratorio del professor Mike F Labor Department of Biological Chemistry based Institute of Science. Oggi andremo a rappresentare una nuova tecnica di Ossi Opat Mesylation.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la compressione manuale OIS del nervo periferico. Cioè, questa procedura riduce la contaminazione da siero e glos raggiunge il contenuto assonale. Abbiamo utilizzato questa nuova tecnica per la metilazione dei PLA op per esplorare la retrosegnalazione basata su D dopo lesione del nervo sciatico.
Quindi iniziamo. Posiziona uno dei due ratti wistar soppressi di età compresa tra otto e 10 settimane su un tappetino da dissezione per un approccio diretto alla parte distale del nervo sciatico. Radere la pelle a metà coscia e sostituirla accuratamente con etanolo al 70%.
Usa le forbici per tagliare via la pelle dalla coscia. Tagliare con cura il grasso e il tessuto connettivo tra il bicipite femorale e i muscoli glutei superficiali. Usa una pinza per sollevare la regione esposta del nervo sciatico e rimuoverla.
La sezione rimossa sarà lunga circa 1,5 centimetri. Trasferire il nervo in 500 microlitri di 2X PBS ghiacciato con inibitori della proteasi in una provetta da microcentrifuga. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
Ripetere la procedura di dissezione sull'altro lato del ratto e su entrambi i lati di un secondo ratto. Grattare il fondo di una capsula di Petri con una pipetta da pastore e riempirla con due millilitri di temperatura ambiente. Punto due X PB s con inibitori della proteasi.
Trasferire un singolo nervo sulla piastra sotto il microscopio da dissezione. Usa una pinza fine per rimuovere l'epineario dal nervo tirandolo via e gettandolo, lasciando i facili nel piatto. Separare accuratamente i faciles l'uno dall'altro e dal fondo del piatto.
I singoli fale diventeranno torbidi e galleggeranno sulla superficie della soluzione. Trasferire immediatamente i fales separati in una provetta da microcentrifuga contenente 500 microlitri di 0,2 X PB s con inibitori della proteasi. Mantieni le sles sul ghiaccio.
Separare e raccogliere le slette dallo sciatico rimanente nel tubo con la pratica. Rimozione dell'epinevrio e separazione delle lame. Non dovrebbero essere necessari più di 10 minuti per nervo.
Rimuovere il tubo contenente il SLES separato dal ghiaccio. Incubare per due ore a temperatura ambiente per rilasciare le strutture non assonali della mielina e dei pidocchi. Lavare le slette per ogni lavaggio.
Usa una pinza per sollevare delicatamente le slette e trasferirle in una provetta nuova contenente un millilitro di 2X PB s con inibitori della proteasi. Agitare il tubo su un bilanciere per cinque minuti. Lavare il SLES in questo modo tre volte dopo il lavaggio.
Trasferire l'SLES in una provetta vuota e fresca per rimuovere il liquido in eccesso, quindi trasferirlo in una provetta contenente 300 microlitri di XPBS con inibitori del proteo, incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Per eluire l'opsm, concentrazioni di sale più elevate interferiscono con ulteriori procedure di proteomica. Centrifugare il fascicolo a 10.000 di formaggio per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare il tessuto e i detriti cellulari pipettati dal surnatante in una provetta einor pulita.
Il surnatante ottenuto. Dovrebbe essere chiaro. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione di proteine.
Si dovrebbe ottenere una resa da 200 a 250 microgrammi di proteine. Conservare il preparato di plasma operatorio in aliquote a meno 80 gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Evitare cicli di scongelamento e congelamento.
Ecco un blocco occidentale che confronta il plasma op isolato con il metodo della compressione manuale con campioni di opsm isolati come mostrato in questo protocollo. Si noti che i livelli ridotti di albumina e GFAP rappresentano rispettivamente le contaminazioni delle proteine del sangue e delle cellule gliali. Al contrario, la tubulina beta tre assonale è arricchita in questa preparazione, indicando un alto livello di proteine assonali.
Dopo aver visto tutto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare il nervo satico e come separare correttamente Paco. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento dell'asoplasma dal nervo sciatico di ratti adulti. Il metodo prevede la dissezione dei fasci nervosi e l'incubazione in un mezzo ipotonica per rilasciare efficacemente la mielina e lisare le strutture non assonali, portando all'estrazione di materiale arricchito di assoni.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca assonale
Sfondo
- L'isolamento del citoplasma assonale è cruciale per studiare la funzione neuronale.
- Il nervo sciatico serve come modello per gli studi sui nervi periferici.
- Comprendere i componenti assonali può aiutare nella ricerca neurologica.
- I metodi precedenti potrebbero non produrre materiale assonale puro.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per l'isolamento dell'asoplasma.
- Migliorare la purezza del citoplasma assonale per ulteriori analisi.
- Facilitare lo studio dei componenti assonali utilizzando tecniche biochimiche.
Metodi utilizzati
- Dissezione del nervo sciatico per accedere ai fasci nervosi.
- Rimozione del tessuto connettivo che circonda il nervo.
- Incubazione dei segmenti nervosi in un mezzo ipotonica.
- Successiva centrifugazione e incubazione in soluzione isotonica.
Risultati principali
- Il protocollo isola con successo il citoplasma assonale.
- L'analisi del Western blot conferma l'elevato arricchimento dei componenti assonali.
- I risultati dimostrano l'efficacia del metodo.
- Vengono evidenziate potenziali applicazioni nello studio della biologia assonale.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio robusto per l'isolamento dell'asoplasma.
- Può essere utilizzato in vari studi relativi alla funzione neuronale.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della struttura e della funzione assonale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
