Name: Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Impara a isolare l'axoplasma dal nervo sciatico del ratto utilizzando un mezzo ipotonico per ottenere materiale arricchito in componenti assonali. Questo protocollo riduce la contaminazione gliale e sierica per studi neurobiologici.

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Questo protocollo permette di isolare axoplasm con minimizzazione di contaminazione di tessuti gliali e vascolari. Il metodo produce circa 70-100 proteina axoplasm totale mcg per uno 8-10 vecchio topo settimana Wistar. 1. Sezionare nervi sciatico <ol><li> Euthanize due ratti da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale. Confermare la morte per la palpazione per mancanza di battito cardiaco prima di dissezione all'inizio. </li><li> Strofinare l'area dissezione con il 70% di etanolo. </li><li> Taglio, muscoli pelle separare e isolare nervo sciatico con le forbici e pinze con attenzione senza danneggiare i vasi sanguigni. Sezionare entrambi i nervi sciatico (circa 1,5 cm ciascuno) da ogni animale e raccogliere tutte e quattro nervi in ​​una eppendorf con 500 microlitri di PBS 0,2 X + inibitori, tenuta in ghiaccio. </li><li> Trasferire i segmenti coraggio di piatti di plastica contenente almeno 2 ml di PBS 0,2 X + inibitori della proteasi. </li><li> Rimuovere il epinevrio dai nervi con una pinza sottile nell'ambito di applicazione binoculare. Separare i fascicoli molto attentamente fino a che non diventa opaco e iniziare a galleggiare sulla superficie della soluzione. Questo passo dovrebbe essere praticato fino a quando non è possibile eseguire rapidamente e con precisione (non prendendo più di 10 minuti per nervo). </li></ol> 2. Incubazione, lavaggio e di eluizione <ol><li> Trasferimento fascicoli separati in una nuova provetta eppendorf con 500 l di PBS 0,2 X che contiene inibitori della proteasi per l'incubazione per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare almeno 3 volte con 1 ml di buffer stesso, trasferendo i fasci di tubi eppendorf a tubo eppendorf e agitazione per 5 minuti dopo il trasferimento. </li><li> Per rimuovere l'eccesso di liquido messo i fasci in un nuovo tubo eppendorf vuota e poi trasferire i fascicoli in una nuova provetta eppendorf con 300 ml di PBS 1X contenente inibitore della proteasi per l'incubazione per 20-30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare 10 min a 10000 xga 4 ° C. </li><li> Prendete il surnatante e misurare la concentrazione di proteine. Questa è la tua preparazione axoplasm. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Axoplasm Western Blot confronto isolato dal metodo di compressione manuale con campioni axoplasm isolati, come mostrato in questo protocollo. Noti la riduzione dei livelli di albumina e GFAP, in rappresentanza delle proteine ​​del sangue e contaminazioni di cellule gliali, rispettivamente. Al contrario, assonale tubulina b3 si arricchisce in questa preparazione, che indicano un alto livello di proteine ​​assonale.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Analisi biochimiche e proteomiche hanno confermato che questa procedura riduce la contaminazione delle cellule gliali siero e 3 rispetto ai metodi precedentemente descritti per l&#39;isolamento axoplasm dalla stretta meccanica 1. Abbiamo usato questo protocollo axoplasm isolamento di esplorare dineina basato segnalazione retrograda dopo la lesione del nervo sciatico 2, e si aspettano di avere utilità nell&#39;esplorazione di molti altri processi in adulti nervi periferici, tra cui assone...

<ul><li> Ratti maschi Wistar (8-10 settimane) </li><li> PBS 0,2 X e PBS 1X soluzioni contenenti inibitori della proteasi (Roshe) 2 compresse da 50 ml </li><li> Eppendorfs per 1,5 ml </li><li> Piatti di plastica sterilizzata 35 millimetri </li><li> Strumenti di dissezione tra cui: forbici e pinze multa </li><li> Binoculare e tavolo luminoso </li></ul> Anticorpi Topo anti-GFAP clone GA-5 è stato da Sigma (G6171). Coniglio anti-albumina è stata da Cedarlane (CLAG5140). Topo anti-tubulina β3 e di coniglio anti-gerk provenivano da Sigma (T2200 e M5670, rispettivamente).

isolamento axoplasm da nerve rat sciatico

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolamento di puro citoplasma assonale (axoplasm) dal nervo periferico è di fondamentale importanza per gli studi biochimici di molti processi biologici. In questo articolo, dimostrare e descrivere un protocollo per l&#39;isolamento axoplasm dal nervo sciatico ratto adulto basato sui seguenti passi: (1) dissezione dei fasci nervosi e la separazione del tessuto connettivo, (2) incubazione di brevi segmenti di fasci nervosi nel medio ipotonica a rilasciare mielina e lisare non assonale strutture; e (3) estrazione dei rimanenti assone arricchito materiale. Proteomica e caratterizzazione biochimica di questa preparazione ha confermato un alto grado di arricchimento per i componenti assonale.

Dimostriamo un protocollo per l&#39;isolamento axoplasm da nervo sciatico ratto adulto sulla base di dissezione di fasci nervosi e l&#39;incubazione in media ipotonica per liberare mielina e lisare non assonale strutture, seguita da estrazione del restante assone arricchito di materiale.

Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

L'isolamento del citoplasma assonale puro (assoplasma) dal nervo periferico è fondamentale per gli studi biochimici di numerosi processi biologici. In questo articolo, noi...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il citoplasma assonale o ectoplasma puro da un nervo periferico. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il nervo sciatico. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eliminare il tessuto connettivo dal nervo e separare i singoli assoni.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'incubazione di brevi segmenti di assoni in un mezzo ipotonico. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'incubazione in soluzione isotonica, centrifugazione e opsm milian. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano un elevato grado di arricchimento per i componenti assonali mediante analisi tramite western blot.Ciao, mi chiamo I, Elle And I may Rosenbaum. Siamo del laboratorio del Professor Mike F Labor, Dipartimento di Chimica Biologica, Istituto di Scienze. Oggi illustreremo una nuova tecnica di metilazione Oxy Opat.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la compressione manuale per ottenere OIS dai nervi periferici, consiste nel fatto che questa procedura riduce la contaminazione da siero e da glos, raggiungendo così i contenuti assonali. Abbiamo utilizzato questa nuova tecnica per analizzare la metilazione delle opPLA al fine di esplorare il segnale retrogrado dipendente da D dopo una lesione del nervo sciatico.Iniziamo. Posizionare uno dei due ratti Wistar di otto-dieci settimane, eutanasizzati, su un fianco su un tappetino da dissezione per accedere direttamente alla parte distale del nervo sciatico. Rasare la cute a metà coscia e detergere accuratamente con etanolo al 70%.Usare le forbici per rimuovere la pelle dalla coscia. Tagliare con attenzione attraverso il tessuto adiposo e il tessuto connettivo tra i muscoli bicipite femorale e gluteo superficiale. Utilizzare la pinzetta per sollevare la regione esposta del nervo sciatico ed estrarlo.La sezione rimossa avrà una lunghezza di circa 1,5 centimetri. Trasferire il nervo in 500 microlitri di PBS 2X freddo di ghiaccio contenente inibitori delle proteasi, in un tubo da microcentrifuga. Mantenere il tubo sul ghiaccio.Ripetere la procedura di dissezione sull'altro lato del ratto e su entrambi i lati di un secondo ratto. Graffiare il fondo di una piastra di Petri con una pipetta Pasteur e riempirla con due millilitri di PBS 0,2 X a temperatura ambiente contenente inibitori di proteasi.Trasferisca un singolo nervo nella piastra sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzi pinzette fini per rimuovere l'epineurio dal nervo tirandolo via e lo scarti, lasciando i fascicoli nella piastra. Separi con attenzione i fascicoli l'uno dall'altro e dal fondo della piastra.Singole fales diventeranno torbide e galleggeranno sulla superficie della soluzione. Trasferire immediatamente le fales separate in una provetta per microcentrifuga contenente 500 microlitri di PB s 0,2 X con inibitori della proteasi. Mantenere le sles sul ghiaccio.Separare e raccogliere le sles dal nervo sciatico rimanente nel tubo con pratica. La rimozione dell'epineurio e la separazione delle sles non dovrebbero richiedere più di 10 minuti per nervo.Rimuovere il tubo contenente lo SLES separato dal ghiaccio. Incubare per due ore a temperatura ambiente per liberare la mielina e le strutture non assonali. Lavare gli SLES ad ogni lavaggio.Utilizzare pinzette per sollevare delicatamente gli SLES e trasferirli in una provetta pulita contenente un millilitro di PBS 2X con inibitori della proteasi. Agitare la provetta su un agitatore per cinque minuti. Lavare gli SLES in questo modo per tre volte dopo il lavaggio.Trasferire il SLES in una nuova provetta einor vuota per rimuovere il liquido in eccesso, quindi trasferirlo in una provetta contenente 300 microlitri di uno XPBS con inibitori di proteasi, e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Per eluire l'opsm, concentrazioni saline più elevate interferiscono con ulteriori procedure di proteomica. Centrifugare il fascio a 10.000 cheese per 10 minuti a quattro gradi Celsius per formare un pellet del tessuto e dei detriti cellulari; aspirare il sopranatante e trasferirlo in una provetta einor pulita.Il soprannatante ottenuto deve essere limpido. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione proteica.Si dovrebbe ottenere un rendimento di 200-250 microgrammi di proteina. Conservare l'estrazione del plasmide in aliquote a meno 80 gradi Celsius per un periodo massimo di sei mesi. Evitare cicli di scongelamento e congelamento.Di seguito è mostrato un blocco western che confronta il plasmide op isolato mediante il metodo manuale di estrusione con campioni di opsm isolati come illustrato in questo protocollo. Si notino i livelli ridotti di albumina e di GFAP, che rappresentano rispettivamente contaminazioni da proteine del sangue e da cellule gliali. Al contrario, la tubulina beta tre assiale è arricchita in questo campione, indicando un elevato contenuto di proteine assonali.Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come dissezionare il nervo sciatico e di come separare correttamente il Paco. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Grazie alla semplicità di intervento e l'esito robusto comportamentale, costrizione cronica del nervo sciatico è uno dei preminenti modelli animali di dolore neuropatico. Entro 24 ore dopo l'intervento, ipersensibilità al dolore è stabilito e può essere misurato quantitativamente usando un von Frey aesthesiometer (test meccanici) e metro analgesia plantare (prova termica).

La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

Questo video descrive l'isolamento e la coltura delle cellule di Schwann dalle radici spinali dei topi. Le cellule isolate vengono quindi coltivate in terreni specifici. Le cellule di Schwann vengono isolate tramite digestione differenziale e aderenza. Successivamente vengono trasferiti su vetrini coprioggetti rivestiti di matrice extracellulare per l'attaccamento e la proliferazione.

Isolamento delle cellule di Schwann dalle radici spinali del topo

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule di Schwann dalle fibre del nervo sciatico di topo.

Separazione magnetica delle cellule di Schwann dai nervi sciatici di topo

Questo video mostra una registrazione a fibra singola della conduzione nervosa della fibra C nei ratti. Un ratto anestetizzato viene inciso per esporre il nervo sciatico, che fornisce l'apporto sensoriale e motorio agli arti inferiori. Le singole fibre C vengono quindi esposte. La stimolazione elettrica viene fornita utilizzando elettrodi di stimolo impiantati nel piede e una risposta viene registrata da una singola fibra nervosa.

Registrazione in vivo a fibra singola delle fibre C del nervo sciatico nei ratti

Qui, presentiamo una tecnica in vivo per il trasferimento genico alle cellule di Schwann (SC) nel nervo sciatico del roditore. Questa semplice tecnica è utile per studiare i meccanismi di segnalazione coinvolti nello sviluppo e nel mantenimento delle SC mielinizzanti.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

Qui, presentiamo un protocollo per l'estrusione idraulica del midollo spinale, nonché l'identificazione e l'isolamento di specifici gangli della radice dorsale (DRG) nello stesso roditore. Rispetto ai metodi standard di isolamento del midollo spinale, questo metodo è significativamente più veloce e riduce il rischio di danni ai tessuti.

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

La registrazione a fibra singola è una tecnica elettrofisiologica efficace applicabile al sistema nervoso centrale e periferico. Insieme alla preparazione della DRG intatta con il nervo sciatico attaccato, viene esaminato il meccanismo di guasto della conduzione. Entrambi i protocolli migliorano la comprensione del rapporto del sistema nervoso periferico con il dolore.

Uso della registrazione in fibra singola in vivo e della radice dorsale intatta Ganglion con il nervo Sciatico attaccato per esaminare il meccanismo del fallimento della conduzione

Questo metodo consente la registrazione della forza di contrazioni e contrazioni tetaniche e potenziali d'azione in tre tipi di unità motorie nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto. L'isolamento funzionale di una singola unità motoria è indotto dalla stimolazione elettrica dell'assone.

Isolamento funzionale di unità motorie singole del muscolo gastrocnomio mediale del ratto

Questo protocollo descrive la preparazione del tessuto nervoso sciatico intero di ratto per la stimolazione elettrofisiologica ex vivo e la registrazione in un bagno salino perfuso a due compartimenti regolato dall'ambiente.

Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.

Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Impara a isolare l'axoplasma dal nervo sciatico del ratto utilizzando un mezzo ipotonico per ottenere materiale arricchito in componenti assonali. Questo protocollo riduce la contaminazione gliale e sierica per studi neurobiologici.

Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

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