Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il citoplasma assonale o ectoplasma puro da un nervo periferico. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il nervo sciatico. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eliminare il tessuto connettivo dal nervo e separare i singoli assoni.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'incubazione di brevi segmenti di assoni in un mezzo ipotonico. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'incubazione in soluzione isotonica, centrifugazione e opsm milian. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano un elevato grado di arricchimento per i componenti assonali mediante analisi tramite western blot.

Ciao, mi chiamo I, Elle And I may Rosenbaum. Siamo del laboratorio del Professor Mike F Labor, Dipartimento di Chimica Biologica, Istituto di Scienze. Oggi illustreremo una nuova tecnica di metilazione Oxy Opat.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la compressione manuale per ottenere OIS dai nervi periferici, consiste nel fatto che questa procedura riduce la contaminazione da siero e da glos, raggiungendo così i contenuti assonali. Abbiamo utilizzato questa nuova tecnica per analizzare la metilazione delle opPLA al fine di esplorare il segnale retrogrado dipendente da D dopo una lesione del nervo sciatico.

Iniziamo. Posizionare uno dei due ratti Wistar di otto-dieci settimane, eutanasizzati, su un fianco su un tappetino da dissezione per accedere direttamente alla parte distale del nervo sciatico. Rasare la cute a metà coscia e detergere accuratamente con etanolo al 70%.

Usare le forbici per rimuovere la pelle dalla coscia. Tagliare con attenzione attraverso il tessuto adiposo e il tessuto connettivo tra i muscoli bicipite femorale e gluteo superficiale. Utilizzare la pinzetta per sollevare la regione esposta del nervo sciatico ed estrarlo.

La sezione rimossa avrà una lunghezza di circa 1,5 centimetri. Trasferire il nervo in 500 microlitri di PBS 2X freddo di ghiaccio contenente inibitori delle proteasi, in un tubo da microcentrifuga. Mantenere il tubo sul ghiaccio.

Ripetere la procedura di dissezione sull'altro lato del ratto e su entrambi i lati di un secondo ratto. Graffiare il fondo di una piastra di Petri con una pipetta Pasteur e riempirla con due millilitri di PBS 0,2 X a temperatura ambiente contenente inibitori di proteasi.

Trasferisca un singolo nervo nella piastra sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzi pinzette fini per rimuovere l'epineurio dal nervo tirandolo via e lo scarti, lasciando i fascicoli nella piastra. Separi con attenzione i fascicoli l'uno dall'altro e dal fondo della piastra.

Singole fales diventeranno torbide e galleggeranno sulla superficie della soluzione. Trasferire immediatamente le fales separate in una provetta per microcentrifuga contenente 500 microlitri di PB s 0,2 X con inibitori della proteasi. Mantenere le sles sul ghiaccio.

Separare e raccogliere le sles dal nervo sciatico rimanente nel tubo con pratica. La rimozione dell'epineurio e la separazione delle sles non dovrebbero richiedere più di 10 minuti per nervo.

Rimuovere il tubo contenente lo SLES separato dal ghiaccio. Incubare per due ore a temperatura ambiente per liberare la mielina e le strutture non assonali. Lavare gli SLES ad ogni lavaggio.

Utilizzare pinzette per sollevare delicatamente gli SLES e trasferirli in una provetta pulita contenente un millilitro di PBS 2X con inibitori della proteasi. Agitare la provetta su un agitatore per cinque minuti. Lavare gli SLES in questo modo per tre volte dopo il lavaggio.

Trasferire il SLES in una nuova provetta einor vuota per rimuovere il liquido in eccesso, quindi trasferirlo in una provetta contenente 300 microlitri di uno XPBS con inibitori di proteasi, e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Per eluire l'opsm, concentrazioni saline più elevate interferiscono con ulteriori procedure di proteomica. Centrifugare il fascio a 10.000 cheese per 10 minuti a quattro gradi Celsius per formare un pellet del tessuto e dei detriti cellulari; aspirare il sopranatante e trasferirlo in una provetta einor pulita.

Il soprannatante ottenuto deve essere limpido. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione proteica.

Si dovrebbe ottenere un rendimento di 200-250 microgrammi di proteina. Conservare l'estrazione del plasmide in aliquote a meno 80 gradi Celsius per un periodo massimo di sei mesi. Evitare cicli di scongelamento e congelamento.

Di seguito è mostrato un blocco western che confronta il plasmide op isolato mediante il metodo manuale di estrusione con campioni di opsm isolati come illustrato in questo protocollo. Si notino i livelli ridotti di albumina e di GFAP, che rappresentano rispettivamente contaminazioni da proteine del sangue e da cellule gliali. Al contrario, la tubulina beta tre assiale è arricchita in questo campione, indicando un elevato contenuto di proteine assonali.

Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come dissezionare il nervo sciatico e di come separare correttamente il Paco. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.