Name: Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri un saggio a base di fluorescenza per analizzare l'attività dei canali di gramicidina e valutare le modifiche indotte da farmaci nelle proprietà del doppio strato lipidico.

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Ringraziamo Michael J. Bruno, Radda Rusinova e Jon T. Sacco per molte discussioni stimolanti. Sostegno finanziario da NIH, R01GM021342 e ARRA supplemento R01GM021342-35S1, e Josiah Macy Jr. Foundation per OSA, il Tri-I CMB programma per HII e The L. Iris e Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship e NIH MSTP concedere GM07739 per RK.

1. Genera ANTS pieno di liposomi <ol><li> Il giorno 1, rimuovere il solvente da lipidi organici. </li><li> Togliere dal freezer lipidi e lasciarlo a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,6 mL di 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-phosphocholine) lipidi in soluzione cloroformio in un pallone basso a 25 mL. </li><li> Continuamente ruotare il pallone mentre si asciugava sotto azoto, fino a quando tutti i cloroformio è evaporato e un sottile velo bianco di mani lipidi tutta la metà inferiore del pallone. </li><li> A secco in un essiccatore sotto vuoto durante la notte. </li></ol><ol><li> Il giorno 2, la preparazione del campione con il fluoroforo che verrà incorporato nel vescicole. </li><li> Reidratare in 100 mM NaNO 3, 25 ANTS mM (Na sale), 10 mM HEPES. Usa HNO 3 o NaOH per aggiustare il pH a 7,0. Ogni molecola ANTS ha 2 + Na, per un totale di 150 mm [Na +]. Aggiungere 1,671 ml di elettrolita per ottenere una sospensione di 10 lipidi mM. </li><li> Parafilm e vortice sospensione accuratamente. </li><li> Proteggere il campione dalla luce con un foglio e lasciare che l'età a temperatura ambiente per una notte. </li></ol><ol><li> Il giorno 3, fanno grandi vescicole unilamellari e rimuovere tutti i fluoroforo dall'esterno vescicole. </li><li> Ultrasuoni per 1 minuto in una bassa potenza ultrasuoni. </li><li> Gelo-disgelo campione 5-6 volte, ogni volta con 5 minuti in ghiaccio secco e 5 minuti in acqua calda (~ 50 ° C). </li><li> Estrudere la sospensione lipidica Avanti con un mini-estrusore. Impostare il mini-estrusore con un filtro in policarbonato 0,1 micron e filtro supporta (vedi manuale estrusore per maggiori dettagli). Estrudere la sospensione avanti e indietro 21 volte in modo tale che la sospensione finisce sulla siringa opposto. Quando più batch sono estrusi, ricordatevi sempre di caricare campioni con la stessa siringa. Durante l'estrusione la sospensione lipidica nuvoloso iniziale dovrebbe diventare quasi trasparente (sarà ancora giallo a causa del fluoroforo ANTS). Se l'estrusione diventa improvvisamente più semplice e meno pressione è necessaria per muoversi attraverso il filtro, il filtro può avere rotto e dovrà essere sostituita. </li><li> Rimuovere ANTS esterno eseguendo la sospensione estruso per un PD-10 colonna dissalazione utilizzando un protocollo gravità. Equilibrare colonna con 20-30 mL di Na-tampone (140 mM NaNO 3, 10 HEPES mM, pH 7.0, ricordatevi di usare HNO 3 o NaOH per aggiustare il pH). Aggiungere 1,5 mL della sospensione lipidica estruso alla colonna e lasciar filtrare in Portare il volume totale del campione a 2,5 ml con l'aggiunta di 1 ml di Na-buffer. Dopo che il buffer è completamente incorporato nella colonna e nulla è fuoriuscita, eluire i liposomi con 3 ml di Na-buffer e raccogliere il campione risultante. L'ANTS risultante riempito LUV soluzione di riserva dovrebbe contenere circa 4-5 mm lipidi e appaiono traslucide bianco latte. Proteggere il campione dalla luce con un foglio. </li><li> Se la soluzione di riserva non viene utilizzata immediatamente, conservare a 13 ° C per un massimo di 7 giorni. Attenzione: non congelare o raffreddare la soluzione lipidica di sotto del suo liquido di cristallo fase temperatura di transizione (~ 12 ° C), in modo da distruggere l'integrità delle vescicole 'e il fluoroforo si fuoriuscire. </li></ol> 2. Mix Solution fluorescenza <ol><li> 24 ore prima dell'uso, diluire liposomi e incubare con gramicidina (a 13 ° C). Equilibratura gramicidina monostrati tra interno ed esterno le vescicole lipidiche 'è un processo lento, che richiede una lunga incubazione. </li><li> Accuratamente il vortice ANTS pieno LUV soluzione madre come luvs hanno una densità&gt; 1 g / mL e quindi sedimenti nelle soluzioni. </li><li> Miscelare il ANTS pieno LUV 1:20 stock in Na-buffer. Mescolare tutti liposomi per l'utilizzo in un giorno di esperimenti insieme in un pallone unico per migliorare l'uniformità del campione. </li><li> Separare 3 / 4 dei liposomi e aggiungere 260 Nm gramicidina pre-diluito in DMSO (500 mg / mL). </li><li> Per il restante 1 / 4 aggiungere lo stesso volume di DMSO (senza gramicidina) per mantenere costante la concentrazione di solvente in tutti i campioni. </li></ol> 3. Impostazione dello strumento di fluorescenza <ol><li> Usiamo un Applied Photophysics SX.20 stopped-flow spettrofluorimetro con controllo di temperatura per misurare il tasso di estinzione di fluorescenza. </li><li> Girare gli strumenti per un'ora di anticipo per consentire il riscaldamento. I componenti sono: computer, unità di controllo elettronico, bagnomaria (sia raffreddamento e riscaldamento), di alimentazione della lampada e del serbatoio di azoto. </li><li> Impostare le condizioni di registrazione utilizzando il software Data Pro-SX. </li><li> Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione monocromatore a 352 nm e aperture larghezza della fenditura per l'eccitazione di 1 / 1. </li><li> Utilizzare un λ = 455 nm filtro passa-alto per registrare l'emissione. </li><li> Utilizzare il "Hold Pressure" impostazione, che consente lo strumento per mantenere la pressione di azoto durante la registrazione e quindi evita le oscillazioni di pressione (e artefatti di registrazione) durante i primi pochi millisecondi. </li><li> Impostare "Time "a 1 s e" punti "a 5000. </li><li> Utilizzare la finestra di ripetizione e regolare il numero di ripetizioni, di solito usiamo 9 e 13 si ripete per buffer e gestisce quencher, rispettivamente. </li><li> Bagnomaria temperatura dovrebbe essere impostata a 25 ° C, la temperatura deve essere monitorata nel software SX. </li><li> Impostare il volume dell'unità a 120 microlitri, il che significa che ogni volta che lo strumento esegue un campione, si mescola 60 microlitri di ciascuna delle due siringhe. Con questa impostazione strumentale, un volume di 120 microlitri dà un tempo morto di ≈ 1,2 ms. </li><li> Regolare l'alta tensione (guadagno) sul rivelatore a fluorescenza per l'uscita del ANTS-liposomi ad essere circa 8. Per una miscela standard sperimentale il guadagno dovrebbe essere 400-420 V. Alcuni farmaci sono fluorescenti, tale da poter saturare il segnale di fluorescenza. In questi casi, guadagno / tensione deve essere ridotta. </li><li> Caricare sempre il campione fluorescente nella siringa sinistra e buffer / quencher nella siringa destra. Assicurati di fondo vortice tutti i campioni contenenti liposomi prima di caricarli, ed essere consapevoli che il luvs con il tempo si depositerà nella siringa. </li></ol> 4. Fare un esperimento <ol><li> Preparare un campione di ANTS-caricato luvs sia con solventi o composti, e caricare nel spettrofluorimetro insieme sia con Na-tampone o Tl-quencher (50 mM TlNO 3, 94 mm NaNO 3, 10 HEPES mM a pH 7,0). </li><li> Utilizzare 1,5 ml diluito ANTS-LUV soluzione, con o senza gramicidina, preparate il giorno precedente. </li><li> Aggiungere il composto alla concentrazione desiderata o il solvente per i controlli. Mantenere la concentrazione di solvente al minimo e costante in tutti i campioni. La concentrazione dovrà essere regolato con una nuova (sconosciuto) composto per ottenere il desiderato dose-risposta gamma. Incubare per 10 minuti a 25 ° C al buio. </li><li> Il vortice LUV campione e caricare nella siringa sinistra. Caricare il Na-buffer o Tl-quencher nella siringa destra. </li><li> Rimuovere completamente le bolle d'aria da entrambi i campioni, spingendo le siringhe avanti e indietro. </li><li> Assicurarsi che entrambe le siringhe vengono caricate ugualmente prima di chiudere le valvole. Carico diseguale si tradurrà in pre-miscelazione di soluzioni prima che raggiungano la camera di registrazione. </li><li> Per il campione prima, registrare la fluorescenza con Na-tampone, ripetere 4 volte, regolare l'alta tensione (guadagno), se necessario, e ripetere 5 volte. </li><li> Per i restanti campioni, record di 9 ripete con Na-buffer. </li><li> Sostituire il Na-buffer con il TL-quencher e record di 13 ripetizioni. </li><li> Risciacquare con acqua e continuare con il campione successivo. Come controlli usiamo campioni: non gramicidina e con solvente, senza gramicidina e con la massima concentrazione del composto, sia con gramicidina e solvente. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Trasferire i risultati al computer di analisi. Leggi tutti i dati in MATLAB per l'analisi. Per ogni campione, leggere in tutti i buffer e ripete quencher, escludendo i primi quattro in ogni caso, come quelli contenenti artefatti di miscelazione. Assumendo un volume dell'unità di 120 microlitri ci vuole un po 'meno di quattro colpi per cancellare completamente la miscela precedente dal stopped-flow tubo. </li><li> Le ripetizioni di buffer per tutti i campioni dovrebbero essere molto simili. Se c'è un cambiamento significativo nel segnale di fluorescenza, che dipende dalla concentrazione del composto, poi lo stesso composto può essere fluorescente e può essere necessario per sottrarre questo primo segnale di fluorescenza in più prima di normalizzare i campioni. </li><li> Manualmente passare attraverso le tracce e rimuovere "cattivo" ripete: ripete contenenti chiodi o deviazioni dalla multi-exponentiality a causa di artefatti di miscelazione e / o bolle. </li><li> Normalizzare la ripete quencher al valore medio di partenza delle ripetizioni di buffer per ogni campione. Combina le medie di tutti i campioni in un grafico per la visualizzazione. </li><li> Le tracce registrate senza gramicidina dovrebbero essere tutti simili e mostrano quasi nessun tempra fluorescenza, ci può essere una riduzione lenta del segnale di fluorescenza a causa della lenta perdita di Tl + attraverso il doppio strato vescicole 8. Se il campione senza gramicidina e nessun modificatore mostra tempra notevole, poi le vescicole si sono deteriorati e non deve essere più riutilizzato. Se i campioni senza gramicidina ma con il modificatore spettacolo tempra significativo, allora il modificatore perturba il doppio strato vescicole a tal punto che permette al fluoroforo o quencher per attraversare il doppio strato. </li><li> Se il composto altera le proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da canali gramicidina, la durata fluorescenza sarà visibilmente alterato. </li><li> Per ogni campione, un esponenziale allungato <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> ad esempio, 4) è in grado di primi 200-100 ms della curva normalizzata quenching di fluorescenza delle ripetizioni individuali e il tasso di <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> 4calcolato a 2 ms. Medie e deviazioni standard sono calcolati per un dato campione di tutte le ripetizioni individuali. </li><li> Infine, determinare la variazione relativa del tasso di quench normalizzando al campione di controllo più vicino nel tempo che ha gramicidina e nessun modificatore. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Gli elementi essenziali della fluorescenza tempra a base di test per rilevare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico alto a sinistra:. Uno zoom-in su una vescicola lipidica singolo con ANTS più NaNO 3 all'interno e NaNO 3 più 3 TlNO sulla parte esterna. In alto a destra: il segnale di fluorescenza registrate usando (forma dall'alto in basso) ANTS pieno di vescicole senza quencher, con quencher, con quencher e pre-drogati con gramicidina 87, 260 e 780 nm. In basso: rappresentazione schematica del stopped-flow camera di miscelazione. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Una schermata dalla Pro-Data software SX che illustrano i vari pannelli riferimento nella descrizione del setup sperimentale. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. Determinazioni ripetere multiple del segnale di fluorescenza da ANTS-caricato luvs con Na-buffer I primi quattro ripetizioni sono sempre esclusi, in quanto contengono artefatti di miscelazione. Il tubo che collega il siringhe campione alla cella di miscelazione hanno un volume definito, quindi le ripetizioni primi ci darà una lettura di ciò che prima era nel tubo: acqua per ripetere 1 e 2, una combinazione di acqua e di esempio per ripetere 3, la maggior parte del campione per ripetere 4, e solo campione per le ripetizioni rimanenti. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4:. Determinazioni ripetere multiple del segnale di fluorescenza da ANTS-caricato luvs con Na-buffer e con Tl-quencher Le prime quattro si ripete sono stati rimossi da entrambe le condizioni. Inoltre, per il TL-quencher misurazioni, ripetere 8 deve essere rimosso a causa di artefatti, bolle d'aria più probabile. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> . Figura 5: Effetto di capsaicina (Cap) sul corso del tempo tempra ANTS fluorescenza (A) normalizzato segnale di fluorescenza più di 1 s, punti grigi indicano i risultati di tutte le ripetizioni (n&gt; 5 per condizione); linee rosse indicano la media di tutti ripete. (B) I primi 100 ms, punti grigi indicano i risultati di una singola ripetizione per ogni condizione; linee rosse sono allungati adatta esponenziale (2 - 100 ms) a quelle ripetizioni. La linea tratteggiata blu indica il segno 2 ms, il momento in cui viene determinato il tasso di tempra. In entrambi A e B la traccia in alto mostra i risultati in assenza di Tl +, per i prossimi due tracce mostrano i risultati in assenza del GA, con Tl + ± Cap; le quattro tracce mostrano risultati inferiori a 260 nm GA e Tl +, dove i numeri indicano [Cap] in micron. I tassi di tempra per mM Cap 0, 10, 30 e 90, come determinata dalla frequenza di un esponenziale allungata, sono 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 e 247 ± 27 (media ± sd, n&gt; 8) , rispettivamente.

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</ol>

Una domanda di brevetto provvisorio che copre i metodi descritti nel manoscritto è stato depositato. Il co-inventori sono HII e OSA.

Abbiamo dimostrato un veloce fluorescenza a base di test per determinare il potenziale di doppio strato modificando di farmaci ed altre amphiphiles di piccole dimensioni. Composti che modificano le proprietà doppio strato possono alterare la funzione delle proteine ​​di membrana in un indiretto, maniera aspecifica, contribuendo probabilmente a &quot;off-target&quot; effetti della droga. Il test sfrutta la potenza dei canali gramicidina come sonde per i cambiamenti nelle proprietà doppio strato 12 che vengono ...

<table><tbody><tr><td>ANTS</td><td>Invitrogen</td><td>A-350</td><td></td></tr><tr><td>gramicidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5002</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dierucoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850398C</td><td></td></tr><tr><td>Kit Mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Colonna desalinizzante PD-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54805</td><td></td></tr></tbody></table>

gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole potenziale modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Molti farmaci e altre molecole di piccole dimensioni utilizzato per modulare la funzione biologica sono amphiphiles che adsorbono a doppio strato / soluzione di interfaccia e di conseguenza alterano le proprietà doppio strato lipidico. Questo è importante perché le proteine ​​di membrana sono energicamente il loro doppio strato accoppiato ad ospitare da interazioni idrofobiche. Cambiamenti nelle proprietà doppio strato così alterare la funzione delle proteine ​​di membrana, che fornisce un modo indiretto per amphiphiles di modulare la funzione delle proteine ​​e un possibile meccanismo di &quot;off-target&quot; effetti della droga. Abbiamo già sviluppato un test elettrofisiologico per rilevare i cambiamenti nelle proprietà doppio strato lipidico utilizzando canali gramicidina lineare come sonde 3,12. Canali gramicidina sono mini-proteine ​​formata dalla dimerizzazione transbilayer di due subunità non conduttore. Essi sono sensibili ai cambiamenti nel loro ambiente membrana, che li rende potenti sonde per monitorare l&#39;evoluzione delle proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning. Ora dimostrare un saggio a fluorescenza per la rilevazione di cambiamenti nelle proprietà doppio strato utilizzando gli stessi canali come sonde. Il test si basa sulla misurazione del tempo-corso di tempra fluorescenza da fluoroforo-caricato unilamellari vescicole grandi a causa dell&#39;entrata di un quencher attraverso i canali gramicidina. Usiamo l&#39;indicatore di fluorescenza / quencher paio 8-amminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + che è stato utilizzato con successo in altri saggi di tempra fluorescenza 5,13. Tl + permea il doppio strato lipidico lentamente 8 ma passa rapidamente attraverso lo svolgimento di canali gramicidina 1,14. Il metodo è scalabile e adatto sia per studi meccanicistici e high-throughput screening di piccole molecole per doppio strato, perturbante, e le potenzialità &quot;off-target&quot;, effetti. Troviamo che i risultati con questo metodo sono in buon accordo con precedenti risultati elettrofisiologici 12.

Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Molti farmaci e altre piccole molecole utilizzate per modulare la funzione biologica sono anfifili che si adsorbono all'interfaccia tra doppio strato e soluzione, alterando così...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni indotte da farmaci nelle proprietà del bicchierino lipidico, rilevate da proteine che attraversano il bicchierino. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando vescicole unilaterali grandi caricate con Fluor. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'arricchire le vescicole con gramin. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere un quencher esterno e misurare la velocità di soppressione del fluorocromo interno. Quattro. L'ultimo passaggio della procedura è quantificare la variazione nella soppressione della fluorescenza per unità di attività mediante l'adattamento di una funzione esponenziale estesa al decorso temporale della fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati per valutare se gli amfi file possono alterare le proprietà del doppio strato lipidico.Ciao, sono Ola Anderson. Ciao, sono Helson. Ciao, sono Richie Kapo.E io sono Leah Sanford del laboratorio del Dottor Olaf Anderson del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica del Weill Cornell Medical College. Oggi vi mostreremo un procedimento per misurare le variazioni nelle proprietà dei bistrati lipidici. Utilizziamo quest

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Funzione di proteine ​​della membrana è regolata dalla composizione lipidica della membrana cellulare. Questo video-articolo i dettagli come formare una patch usando elettrodi cerotto doppio strato, così come il modo di utilizzare i canali gramicidina come reporter di proprietà della membrana alterata.

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

A real-time procedura di screening per identificare i farmaci che interagiscono con la proteina G-gated verso l'interno raddrizzatore...

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Abbiamo dimostrato un, trasportabile sistema di formazione doppio strato lipidico memorizzabili. Una membrana a doppio strato lipidico possono essere formate entro 1 ora con tasso di successo superiore all'80% quando un precursore membrana congelato è portato a temperatura ambiente. Questo sistema consentirà di ridurre i processi laboriosi e competenze associate a canali ionici.

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Qui descriviamo un'analisi fluorescenza-basata di alto-rendimento che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza attraverso analisi fluorometriche e imaging in cellule viventi. Questo test può essere utilizzato per lo screening di farmaci o geni che regolano la chiusura della membrana plasmatica in cellule di mammifero.

Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Questo protocollo presenta una serie di esperimenti adottati per la valutazione di peptidi antitumorali fotocommutabili, che possono essere utilizzati nello screening preclinico di tali composti. Ciò include la valutazione della citotossicità in colture cellulari 2D e 3D, la valutazione dell'efficienza di fotoisomerizzazione ex vivo (tessuto modello) e l'efficacia in vivo .

Valutazione in vitro e in vivo di composti biologicamente attivi fotocontrollati - potenziali farmaci candidati per la fotofarmacologia del cancro

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Scopri un saggio a base di fluorescenza per analizzare l'attività dei canali di gramicidina e valutare le modifiche indotte da farmaci nelle proprietà del doppio strato lipidico.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico (Video) | JoVE Journal

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

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