Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i cambiamenti indotti dai farmaci nelle proprietà del doppio strato rilevate dalle proteine che si estendono sul doppio strato. Ciò si ottiene realizzando prima grandi sles unilaterali caricati con fluor. Il secondo passo della procedura consiste nel drogare le vescicole con gramin.

La terza fase della procedura consiste nell'aggiungere un quencher esterno e misurare la velocità di tempra del fluoro interno. Quattro. La fase finale della procedura consiste nel quantificare la variazione dell'attività di quenching del fluorescenza per grammina adattando una funzione esponenziale allungata all'andamento temporale della fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati per valutare se i file amfi possono alterare le proprietà del doppio strato lipidico.

Ciao, sono Ola Anderson. Ciao, sono Helson. Ciao, sono Richie Kapo.

E io sono Leah Sanford del laboratorio del Dr.Olaf Anderson nel Dipartimento di Fisiologia e Biofisica del Weill Cornell Medical College. Oggi ti mostreremo una procedura per misurare i cambiamenti nelle proprietà del biostrato lipidico. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti di farmaci e piccole molecole sulle proprietà bilari lipidiche.

Quindi iniziamo Il primo giorno di questa procedura, rimuovi il lipide dal congelatore e lascialo equilibrare a temperatura ambiente. Una volta equilibrato, aggiungere 0,6 millilitri di 25 milligrammi per millilitro, la soluzione di lipidi e cloroformio in un pallone a fondo tondo da 25 millilitri. Quindi asciugare la soluzione sotto azoto gassoso ruotando continuamente il pallone fino a quando tutto il cloroformio non è evaporato.

E una sottile pellicola bianca di lipidi ricopre l'intera metà inferiore del pallone, asciuga ulteriormente il lipide in un essiccato sotto vuoto per una notte. Preparare una soluzione di nitrato di sodio 100 millimolare 25 millimolari, A NTS e 10 millimolari HEPs di pH sette. Quando si regola il pH di questa soluzione, evitare soluzioni contenenti cloruro.

Poiché il tallio Quencher forma un complesso insolubile con il cloruro il secondo giorno, reidratare i lipidi in 1,67. Un millilitro di questa soluzione elettrolitica per ottenere una sospensione lipidica di 10 millimolari. Una volta raggiunta la concentrazione corretta, coprire con pellicola para e vorticare la sospensione, proteggere accuratamente il campione dalla luce con un foglio e lasciarlo invecchiare a temperatura ambiente per una notte.

Il terzo giorno, sonicare la miscela per un minuto in una sonicazione a bassa potenza. Quindi congelare e scongelare il campione con cinque minuti su ghiaccio secco, seguiti da cinque minuti in acqua tiepida, ripetere il ciclo di congelamento e scongelamento quattro o cinque volte. Estrudere la sospensione lipidica utilizzando un mini estrusore Avanti.

Impostare il mini estrusore con un filtro in policarbonato da 0,1 micron e i supporti del filtro estrudere la sospensione avanti e indietro 21 volte in modo tale che una sospensione quasi traslucida finisca nella siringa opposta, risultando in una grande vescicola ulare o sospensione LUV. Rimuovere l'A NTS esterno facendo scorrere la sospensione estrusa su una colonna di dulazione PD 10 che è stata bilanciata con tampone di sodio. Aggiungere 1,5 millilitri di sospensione LUV più un millilitro di tampone di sodio alla colonna.

Dopo che la soluzione è stata completamente incorporata nella colonna, eluire i liposomi con tre millilitri di tampone di sodio e raccogliere l'eluato. La soluzione madre di LUV riempita con A NTS risultante dovrebbe contenere circa quattro o cinque lipidi millimolari e apparire traslucida. Bianco latte.

Proteggere la soluzione dalla luce con un foglio e conservare a 13 gradi Celsius 24 ore prima dell'uso a vortice completo. La soluzione stock LUV riempita A NTS. Poiché gli UUV hanno una densità superiore a un grammo per millilitro e/o sedimento.

Quindi diluire la soluzione madre LUV riempita con A NTS. Da uno a 20 con tampone di sodio incubano tre quarti dei liposomi con 260 nanogrammi di abidin in DMSO. Aggiungere lo stesso volume di DMSO senza gramina al restante quarto.

Per mantenere costante la concentrazione del solvente in tutti i campioni, lasciare che la gramina si equilibri tra i monostrati interni ed esterni delle vescicole lipidiche per 24 ore a 13 gradi Celsius. Qui, un fluorimetro spettrofluorimetro a flussi fermati SX point 20 di fotofisica applicata con controllo della temperatura viene utilizzato per misurare il tasso di estinzione della fluorescenza. Per iniziare, accendere gli strumenti un'ora prima del tempo per consentire il riscaldamento dello strumento.

La fessura con i relatori per l'eccitazione dovrebbe essere di una barra e un filtro passa-alto da 4 55 nanometri dovrebbe essere utilizzato per registrare l'emissione utilizzando il software pro data SX. Impostare prima le condizioni di registrazione, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione del monocromatore su 3 52 nanometri. Utilizzare l'impostazione di mantenimento della pressione.

Imposta il tempo su un secondo e punta a 5.000. Regolare il numero di ripetizioni a nove per le esecuzioni buffer e a 13 per le esecuzioni quencher. Monitorare la temperatura nel profilo dell'unità di controllo del software Essex.

Il volume dell'unità deve essere impostato su 120 microlitri, che mescola 60 microlitri da ciascuna siringa. Ciò fornisce un tempo morto di circa 1,2 millisecondi. Regolare l'alta tensione o il guadagno sul rivelatore di fluorescenza a circa 420 volt.

L'obiettivo è quello di ottenere una lettura di fluorescenza di circa otto UUV caricati con A NTS precedentemente preparati per 10 minuti a 25 gradi Celsius al buio. Una volta equilibrato il campione, caricarlo nella siringa sinistra. Nel giusto carico della siringa, tampone di sodio o tallio. Dissetatore.

Rimuovere eventuali bolle d'aria spingendo le siringhe avanti e indietro. Entrambe le siringhe devono essere caricate allo stesso modo. Prima di chiudere le valvole per il primo campione, registrare la fluorescenza con tampone di sodio.

Ripetere quattro volte e regolare il guadagno secondo necessità. Quindi ripetere altre cinque volte per i campioni rimanenti. Registra nove ripetizioni con il tampone di sodio.

Sostituire il tampone di sodio con il quencher al tallio e registrare 13 ripetizioni. Risciacquare con acqua e continuare con i controlli di campionamento successivi. Includere campioni senza gramina e con solvente, senza gramina e la massima concentrazione del composto.

E con la gramina e il solvente dopo il saggio di fluorescenza, leggere i dati nel software MATLAB per l'analisi. Per ogni campione letto in tutte le ripetizioni del buffer e del quencher, le prime quattro ripetizioni saranno contaminate da ciò che era precedentemente nel tubo. In questo caso, il segnale proviene dal campione tampone di sodio che si mescola con l'acqua del lavaggio precedente.

Le ripetizioni da cinque a nove rappresentano il segnale dal solo campione. Pertanto, escludiamo sempre le prime quattro ripetizioni in ogni caso. Per evitare artefatti di miscelazione, esaminare manualmente le tracce e rimuovere eventuali ripetizioni errate, ad esempio la traccia rossa contenente picchi o deviazioni dovute ad artefatti di miscelazione e/o bolle.

Quindi normalizzare le ripetizioni del quencher al valore iniziale medio delle ripetizioni del tampone per ogni campione per ogni condizione sperimentale, combinare le medie di tutti i campioni in un unico grafico di campioni di visualizzazione senza gramina dovrebbero essere tutti simili e mostrare quasi nessun quenching di fluorescenza. C'è una lenta riduzione del segnale fluorescente a causa della lenta causa dello ione tallio nelle vescicole per i campioni con gram sidin. Se l'andamento temporale della fluorescenza è visibilmente alterato dal composto, allora il composto altera le proprietà del doppio strato lipidico alla concentrazione testata successivamente con un esponenziale allungato ai primi due a 100 millisecondi delle curve di estinzione della fluorescenza normalizzate.

Per le singole ripetizioni e calcolare la velocità a due millisecondi. Quindi calcola le medie e le deviazioni standard per un dato campione dall'individuo Ripete l'effetto della capsaicina qui indicato come cap è stato osservato sull'andamento temporale del quenching fluorescente in assenza o presenza di gramina indicata come ga, il segnale fluorescente normalizzato è mostrato oltre un secondo qui. I punti grigi rappresentano i risultati di tutte le ripetizioni, mentre le linee rosse sono le medie.

Vengono visualizzati i primi 100 millisecondi del segnale fluorescente normalizzato. I punti grigi sono il risultato di una singola ripetizione per ogni condizione. Le linee rosse sono allungate in modo esponenziale si adattano a quelle ripetizioni.

La linea blu soffocata denota il segno di due millisecondi. Il momento in cui viene determinata la velocità di tempra. La variazione relativa della velocità di quench è determinata normalizzando i dati al campione di controllo con gramina e nessun modificatore.

Quando la capsaicina viene assorbita dal doppio strato lipidico, altera le proprietà del doppio strato. Il cambiamento verso il doppio strato più morbido si rifletterà come uno spostamento del lato di gram nell'equilibrio del monodimero a favore del dimero conduttore. Vi abbiamo appena mostrato una procedura per misurare gli effetti perturbanti del doppio strato di una piccola molecola.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare i controlli appropriati per ogni esperimento utilizzando lo stesso lotto di vescicole. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.