Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare in modo imparziale i microRNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ciò si ottiene preparando o acquistando prima gli oligonucleotidi del DNA che sono competenti per la legatura alle tre estremità prime del micro RNA. Il secondo passo è legare i tre oligonucleotidi principali del DNA alle tre estremità prime del micro RNA.

Successivamente, il prodotto di legatura viene purificato su gel e il linker oligonucleotidico a cinque RNA viene legato all'estremità a cinque primi del micro RNA. Il passaggio finale consiste nel convertire le molecole ibride in CDNA e quindi amplificare il CDNA mediante reazione a catena della polimerasi. In definitiva, il clonaggio di micro RNA e il sequenziamento ad alto rendimento vengono utilizzati per mostrare l'ampio profilo del trascrittoma dei microRNA in modo quantitativo alla risoluzione dei singoli nucleotidi.

Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il microsequenziamento dei microraggi qPCR blot, è che la nostra tecnica riflette maggiormente il livello effettivo di microraggi su una scala di laboratorio su larga scala di trascrizione con una risoluzione di un singolo nucleotide. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia dei microRNA, può essere applicato anche ad altre tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento come HC clip e RNA-Seq. Gli oligonucleotidi del DNA per questa procedura sono progettati per tre reazioni di ligazione primaria e dovrebbero avere un gruppo fosfato a cinque primi, un dinucleotide randomizzato all'estremità a cinque primi e una citosina a tre primi diluire gli oligonucleotidi del DNA a 100 micromolari in acqua priva di nucleasi.

Assemblare la reazione di ventilazione a combinando questi agenti reagenti: 200 moli pico dell'oligonucleotide primo linker, quattro microlitri di cinque prime DNAA tampone di ventilazione, quattro microlitri di un TP, quattro microlitri di M-T-H-R-N-A, ligasi e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 40 microlitri. Incubare la reazione a 65 gradi Celsius per un'ora. Terminare la reazione riscaldando a 85 gradi Celsius per cinque minuti.

Precipitare il linker TED aggiungendo 2,5 volumi di etanolo al 100% e un terzo volume di acetato di ammonio molare a 10 molari. Per rimuovere un TP residuo e prevenire legature impreviste nelle reazioni future, mescolare l'alcol, il sale e la soluzione di oligonucleotidi fino a ottenere omogeneità centrifugando a piena velocità in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Lavare il pellet in etanolo al 70% e risospendere il pellet nel volume appropriato di acqua priva di nucleasi per produrre da 50 a 100 micromolari di un oligonucleotide ventilato.

Confermare una ventilazione dell'oligonucleotide mediante elettroforesi su un gel di poliacrilammide al 18%. Pre-rotola il gel per 30 minuti a 24 volt centimetro di larghezza del gel con un tampone di corsa XTBE a temperatura ambiente. Una volta trascorsi i 30 minuti, sciacquare i pozzetti con un tampone di corsa.

Gli oligonucleotidi del DNA per questa procedura sono progettati per tre reazioni di ligazione primaria e dovrebbero avere un gruppo fosfato a cinque primi, un dinucleotide randomizzato all'estremità a cinque primi e un'ossitocina a tre primi. Diluire gli oligonucleotidi del DNA a 100 micromolari in acqua priva di nucleasi. Esegui il gel a 24 volt per centimetro fino a quando il blu di bromo fenolo non si trova a tre quarti del fondo del perno del gel.

Colora il gel con una soluzione di cyber gold in un XTBE e visualizza su una scatola di transluminatore UV. Ci dovrebbe essere uno spostamento di un singolo nucleotide nelle dimensioni dell'oligonucleotide del DNA che è stato soggetto a una ventilazione da parte della ligasi M-T-H-R-N-A per la reazione di legatura a tre prime. Assemblare i seguenti componenti sul ghiaccio in questo ordine.

Un microlitro di 50% PEG 8.000 0,5 microlitri di tampone ligasi XRNA. Un microlitro di un linker ventilato a tre primi, 0,5 microlitri di inibitore di RNA, da 0,5 a otto microgrammi di RNA totale, 0,5 microlitri di T quattro, RNA ligasi, due e acqua libera da nucleasi fino a un volume finale di cinque microlitri. Miscelare la reazione pipettandola una volta accuratamente miscelata.

Posizionare la reazione in un termociclatore con un coperchio riscaldato. Impostare il blocco a 16 gradi Celsius e incubare per quattro ore. Si noti che la reazione può essere scalata fino a un volume finale di 20 microlitri senza alcuna perdita di efficienza di legatura.

Dopo le tre legature prime, mescolare la reazione con un volume uguale di due XRNA che caricano il calore del tampone a 70 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddare sul ghiaccio. Prossimo gel. Purificare il campione su un gel di poliacrilammide al 15%.

Pre-eseguire il gel a 24 volt centimetri di larghezza del gel per almeno 30 minuti. Spegnere l'alimentazione e lavare i pozzetti con il tampone di corsa. Caricare il campione ed eseguire il gel alla stessa tensione della pre-corsa fino a quando il bromo fenolo non è appena uscito dal gel.

Il prodotto desiderato migrerà vicino allo xilene ciano quando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide è completa. Metti il gel in un vassoio pulito con un tampone di scorrimento e uno di cyber gold e fai una roccia per 15 minuti. Rimuovere il gel dalla vaschetta di colorazione e visualizzare su una scatola del transluminatore UV coperta con pellicola di plastica pulita.

Il prodotto della legatura dovrebbe essere lungo circa 45 nucleotidi. Poiché questo prodotto di legatura di solito non è visibile, è importante includere un campione di RNA sintetico di controllo positivo nella corsia adiacente utilizzando un'exci di lama di rasoio pulita, la regione contenente il prodotto di legatura. Guidato dalle posizioni del campione di RNA sintetico e dagli standard dimensionali.

Mettere il frammento di gel di accisa in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri. Forare il fondo della provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri con un ago calibro 30 e posizionare la provetta per microcentrifuga pulita a bassa ritenzione da 1,5 millilitri per cinque minuti a circa 15.000 volte. G. Confermare visivamente che l'intera fetta di gel si sia spostata attraverso il foro nella camera d'aria.

Se necessario, utilizzare una punta della pipetta pulita per spingere alcuni frammenti di gel più vicino al foro. Scartare la provetta vuota da 0,5 millilitri e aggiungere 400 microlitri di tampone ad alta colonna salina all'impasto di acrilammide. Far oscillare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo.

Trasferire l'impasto in una colonna di centrifuga in acetato di cellulosa da 0,22 micron utilizzando una centrifuga con puntali per pipette a foro largo per tre minuti a temperatura ambiente a circa 15.000 volte. G per raccogliere tutto il liquido lontano dalla matrice di gel di acrilammide. Trasferire il liquido in una provetta pulita da 1,5 millilitri a bassa ritenzione contenente un microlitro di una soluzione di glicogeno da 20 milligrammi per millilitro.

Aggiungere un volume uguale di isopropanolo e un decimo volume di acetato di sodio e mescolare la soluzione capovolgendo più volte il tubo. Far precipitare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti. Centrifugare alla massima velocità a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Per pellettare l'acido nucleico, rimuovere la laccia e lavare con aria al 70% di etanolo. Asciugare il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere direttamente alla fase di legatura a cinque prime. Per iniziare questa procedura, aggiungere i seguenti componenti all'acido nucleico pellettato in precedenza, due microlitri di PEG 8.000, 0,5 microlitri di tampone RNA ligasi, 0,5 microlitri di TP, 0,5 microlitri di linker, RNA oligonucleotide e acqua fino a un volume finale di quattro microlitri.

Miscelare questo campione pipettandolo ripetutamente su e giù per un massimo di cinque minuti per assicurarsi che il pellet sia stato completamente risolubilizzato. Una volta che il pellet è in soluzione, trasferire il contenuto in una provetta per PCR pulita contenente un microlitro di una miscela uno-a-uno di inibitore dell'RNA e uno di RNA ligasi T quattro miscelato mediante pipettaggio su e giù. Incubare la reazione in un termociclatore a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Quando la reazione è completa, procedere immediatamente alla sintesi di CD NA come descritto nel testo del protocollo dopo la legatura del linker alle tre estremità prime dell'RNA e l'analisi delle reazioni. Nella regione da 100 a 300 nucleotidi del gel sono evidenti bande di alto peso molecolare, il che indica che il campione di RNA totale utilizzato è di alta qualità. Il segnale molto luminoso nella regione dei 25 nucleotidi del gel è un eccesso di RNA sintetico a tre linker primi non legati indica una legatura eseguita con cinque picomoli di micro RNA sintetico e un linker a tre prime, che è stato purificato con gel.

Qui è mostrato un autoradiogramma di tre reazioni di legatura primaria eseguite con P 32 5 prime e micro RNA sintetico marcato. Il numero di ore in cui la reazione è stata autorizzata a procedere è indicato in alto, mentre i numeri in basso indicano le quantità legate come percentuale della somma di non legati e legati. Questo autoradiogramma è costituito da cinque reazioni di legatura primaria eseguite con micro RNA sintetico marcato con P 32 5 prime end marcato tre ibridi prime linker.

I numeri in basso indicano le quantità legate come percentuale della somma di non legati e legati, e rivelano l'importanza di utilizzare un'alta concentrazione di PEG 8.000 piccoli R-N-A-D-N-A. Le librerie compatibili per il sequenziamento ad alta produttività vengono successivamente generate mediante PCR. Il numero corretto di cicli di PCR è determinato empiricamente.

In questo esempio, la dimensione del prodotto di DNA atteso è di 146 coppie di basi Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in soli due giorni. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è importante ricordare di mantenere tutte le punte e le provette prive di RNA.