Name: Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Scopri un metodo efficiente per la clonazione dei microRNA mediante doppia ligazione e sequenziamento ad alto rendimento. Questa tecnica consente la quantificazione genomica accurata dei miRNA per studi di regolazione genica.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Yi, in particolare Zhaojie Zhang, per le fruttuose discussioni riguardanti la progettazione dei linker e l'efficienza della legatura, così come l'American Cancer Society per aver sostenuto questo lavoro attraverso una borsa di studio post-dottorato (#125209) a J.E.L. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata anche dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health sotto Award Number R01AR059697 (a R.Y.) e una borsa di ricerca del Linda Crnic Institute for Down Syndrome. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

NOTA: E &#39;fondamentale per mantenere condizioni di assenza di RNasi durante l&#39;intera procedura. 1. Adenylation di 3 &#39;Linker <ol><li> Diluire oligonucleotide DNA progettato per le reazioni 3 &#39;legatura a 100 micron di priva di nucleasi H 2 O. NOTA: L&#39;oligonucleotide dovrebbe avere un &#39;gruppo fosfato, un dinucleotide randomizzato al 5&#39; 5 estremità, e un &#39;dideoxycytosine 3. Il 5 &#39;gruppo fosfato è un requisito dell&#39;enzima Mth per un&#39;efficiente 5&#39; adenylation 10. Il fosfato può essere aggiunto un trattamento preliminare del oligonucleotide con un polinucleotide chinasi, o ordinato con la modifica diretta. Il dinucleotide randomizzato all&#39;estremità 5 &#39;è importante per ridurre al minimo la preferenza che ligasi RNA mostre per certo fine-end giunzione reazioni sugli altri 6 sequenza. Il 3 &#39;dideoxycytosine inserisce un elemento di bloccaggio all&#39;estremità 3&#39; estremità del oligonucleotide to inibire la formazione di concatamers linker-linker durante le successive fasi di legatura e serve anche per bloccare &#39;estremità della molecola miRNA-Linker formato alla fine del 3&#39; la reazione di ligazione 11 3. La sequenza di oligonucleotidi linker scelto per il metodo miR-Seq imparziale è la seguente: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montare la seguente reazione adenylation: 200 pmol 3 &#39;oligonucleotide linker, 4 microlitri 10x 5&#39; tampone adenylation DNA, 4 microlitri 1 mM ATP, 4 microlitri Mth RNA ligasi, priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 40 microlitri. </li><li> Incubare la reazione a 65 ° C per 1 ora. Terminare la reazione mediante riscaldamento a 85 ° C per 5 min. </li><li> Precipitare linker adenylated con l&#39;aggiunta di 2,5 volumi di etanolo 100% e 1/3 volume di 10 M di acetato di ammonio per rimuovere ATP residuo e per prevenire legature imprevisti nelle reazioni future. <ol><li> In breve, mescolare il algnato di alcool, sale e soluzione oligo all&#39;omogeneità, filatura a piena velocità in una microcentrifuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C per 20 min. Lavare il precipitato in etanolo al 70%, aria secca, e risospendere in volume appropriato di priva di nucleasi H 2 O per produrre 50-100 micron di oligo adenylated. </li></ol></li><li> Confermare adenylation eseguendo un gel di poliacrilammide al 18%. <ol><li> Preparare il gel miscelando il seguente insieme: 6,3 g di urea, 6,75 ml di 40% acrilammide, e 1,5 ml di 10x TBE. Aggiungi H 2 O a 15 ml. </li><li> Mescolare fino urea è completamente sciolto e aggiungere 150 microlitri al 10% (w / v) di ammonio persolfato (APS) e 15 microlitri tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Una volta che il gel ha impostato, pre-corsa per 30 min a 24 V / cm di larghezza gel con 1x tampone di corsa TBE a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti è da pozzi a filo con tampone di corsa. </li><li> Mescolare 5 pmol di oligonucleotidi adenylated e con uguale volume di tampone di denaturazione 2x RNA di carico (il 95% (v / v) formammide,0,02% (w / v) di SDS, 0,02% blu di bromofenolo (w / v), 0,01% (w / v) Xilene cianolo, 1,0 mM EDTA), portare rapidamente a 75 ° C, e scatto raffreddata su ghiaccio. Dispensare intero campione nel pozzetto del gel. Includere anche un identico ammontare di controllo non adenylated, e gli standard di bassa dimensione peso molecolare. </li><li> Attivare il gel a 24 V / cm fino a quando il blu di bromofenolo è ¾ fino al fondo del gel. Smontare apparecchi, gel post-macchia con soluzione di SYBR-oro 1x a 1x TBE e visualizzare sulla scatola UV-transilluminatore (Figura 2). NOTA: Gel purificare l&#39;oligo adenylated in un modo simile a quello descritto sopra, se &quot;no RNA ingresso&quot; controlli hanno determinato una elevata quantità di prodotto di PCR rispetto ai campioni con ingresso RNA. </li></ol></li></ol> 2. Linker legatura a 3 &#39;Fine di miRNA <ol><li> 3 &#39;legatura <ol><li> Assemblare i seguenti componenti su ghiaccio nell&#39;ordine indicato: 1,0 microlitri 50% (w / v) di PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x tampone RNA ligasi (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ml adenylated 3 &#39;Linker (100 mM), inibitore della RNasi 0,5 microlitri, 0,5-8,0 mg di RNA totale, 0,5 microlitri RNA ligasi T4 2, priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 5 microlitri. </li><li> Mescolare la reazione pipettando la soluzione è troppo viscoso a vortice causa dell&#39;elevata concentrazione di PEG 8000. Una volta accuratamente miscelati, posizionare la reazione in un termociclatore con un coperchio riscaldato. Impostare il blocco a 16 ° C, e incubare per 4 ore. NOTA: La reazione può essere scalata fino ad un volume finale di 20 ul senza alcuna perdita di efficienza legatura. Reagire per 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per produrre efficienze legatura sostanzialmente identici. </li></ol></li><li> Gel Purificazione <ol><li> Dopo 3 &#39;legatura, mescolare la reazione con un volume uguale di tampone di caricamento 2x RNA. Riscaldare a 70 ° C per 5 min e scatto raffreddare su ghiaccio. </li&gt; <li> Eseguire il campione su un gel di poliacrilammide al 15% per la purificazione PAGE. <ol><li> Preparare un gel di poliacrilammide al 15% contenente 7 M urea, in modo simile a quello descritto in precedenza al punto 1.5. </li><li> Pre-eseguire il gel a 24 V / cm di larghezza gel per almeno 30 min. Spegnere l&#39;alimentazione elettrica, pozzi a filo, campione del carico e gel di corsa a stessa tensione pre-run. </li><li> Caricare il campione e eseguire la pagina fino a quando il blu di bromofenolo è appena uscito il gel. Il prodotto desiderato migrerà vicino al cyanol xilene. </li></ol></li></ol></li><li> Colorazione, visualizzazione, e l&#39;escissione <ol><li> Smontare apparecchi gel e posto gel in vassoio pulito con 1x tampone di corsa (TBE), 1x SYBR-oro, e di roccia per 15 min. </li><li> Rimuovere il gel dal piatto macchie e visualizzare su scatola transilluminatore UV coperta con pellicola trasparente pulito. Il prodotto legatura dovrebbe essere di circa 45 nucleotidi di lunghezza. </li><li> Accise la regione contenente il prodotto con una legatura Razo pulitolama r e il luogo in 0,5 ml di tubo di micro-centrifuga. </li></ol></li><li> Isolamento del prodotto e Precipitazioni <ol><li> Pierce fondo della provetta da 0,5 ml microcentrifuga con un ago da 30 G e posizionare il tubo forato in un secondo pulita, a bassa ritenzione, 1,5 ml provetta. Centrifugare per 5 minuti a ~ 15.000 x g. </li><li> Visivamente che l&#39;intera fetta del gel è spostato attraverso il foro nel tubo interno. Se necessario, usare un puntale pulito per spingere alcuni frammenti di gel più vicino alla buca. </li><li> Smaltire il tubo vuoto 0,5 ml e aggiungere 400 ml di alto contenuto di sale tampone colonna (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) per il liquame acrilamide. Tubo di roccia (s) a 4 ° C per una notte. </li><li> Trasferimento liquami di una colonna di spin acetato di 0,22 micron di cellulosa con un puntale ampio tunnel. Centrifugare per 3 minuti a temperatura ambiente a ~ 15.000 xg per raccogliere tutto il liquido dalla matrice di gel di acrilammide. </li><li> Trasferire il liquido di un ambiente pulito, bassa ritenzione, provetta da 1,5 ml contieneing 1 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Aggiungere un uguale volume di isopropanolo e 1/10 di volume di acetato di sodio. Miscelare soluzione capovolgendo tubo più volte il precipitato in -80 ° C freezer per 20 min. </li><li> Centrifugare a piena velocità a 4 ° C per 20 minuti per far sedimentare l&#39;acido nucleico. Rimuovere il surnatante e lavare in etanolo al 70%. Aria pellet secco per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere direttamente al 5 &#39;passo legatura. </li></ol></li></ol> 3. Linker legatura a 5 &#39;Fine del miRNA-3&#39; Linker Hybrid <ol><li> Per l&#39;acido nucleico in granuli, aggiungere i seguenti componenti: 2 microlitri PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ml 10x RNA Ligase Buffer, 0,5 microlitri ATP (10 mM), 0,5 microlitri NN-RNA oligo (100 mM), e H 2 O ad un volume finale di 4 microlitri. NOTA: La composizione del &#39;NN-RNA oligo&#39; è il seguente 5&#39;-invertita dideossi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &#39;ed è stato purificato tramite HPLC dal costruttore. </li><li> Mescolarequesto campione pipettando su e giù più volte. Fare questo per un certo tempo (fino a 5 minuti) per garantire che il pellet è stato completamente ri-solubilizzati. Se ri-solubilizzazione è problematico, riscaldare brevemente campione (3-5 min) a 37 ° C e riprendere pipettaggio mescolare. </li><li> Una volta che il pellet è tornato in soluzione, trasferire il contenuto in una provetta pulita PCR contenente 1 ml di una miscela 1: 1 di inibitore della RNasi e T4 RNA ligasi 1 (5 unità). Anche in questo caso mescolare pipettando su e giù. </li><li> Incubare la reazione in un termociclatore a 37 ° C per 4 ore. Procedere immediatamente alla sintesi del DNA. </li></ol> 4. trascrizione inversa / cDNA Synthesis <ol><li> Aggiungere i seguenti componenti al 5 &#39;reazione Legatura: 2 microlitri di buffer 5x RT, 0,75 ml 100 mM DTT, 1 ml Illumina RT Primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 micron), e 0,5 microlitri dNTP (10 mm). </li><li> Mescolare pipettando e calore a 65 ° C per 5 min. Poi raffreddare lentamente in panchina top. </li><li> Una volta che la reazione è raffreddata a temperatura ambiente, il tubo posto su ghiaccio e aggiungere 0,5 ml ciascuno di enzima trascrittasi inversa e inibitori RNasi. Mescolare pipettando e posto in termociclatore per la fase di estensione indicato nelle istruzioni del produttore. </li><li> Una volta completato Aggiungere 5 ml di priva di nucleasi H 2 O per portare il volume finale della libreria di cDNA fino a 15 ml. </li></ol> 5. Biblioteca Preparazione <ol><li> Per l&#39;indicizzazione PCR, montare la seguente reazione su ghiaccio: 6 ml 5x Phusion Buffer, 1 microlitri dNTP (10 mm), 0,9 ml di DMSO, 0,75 ml 5 &#39;Primer (25 micron), 0,75 ml 3&#39; Primer (25 micron), biblioteca 3 microlitri di cDNA (concentrazione variabile a seconda della quantità di input), 0,5 ml Phusion Polymerase (1 unità), priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 30 ml. Scegli le sequenze dei primer per garantire la compatibilità con il modello e la piattaforma di sequenziamentoscelta. <ol><li> Eseguire la reazione di PCR con le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale a 98 ° C per 3 minuti, per i primi 4 cicli, denaturare 98 ° C per 15 sec, ricottura a 50 ° C per 15 sec, estendere a 72 ° C per 15 sec . NOTA: A seconda della quantità del materiale in ingresso, variare il totale numero di cicli di PCR. Tipicamente, per un ingresso di 1-2 mg di RNA totale, 13 cicli di PCR in totale sono sufficienti a generare la libreria miR-Seq. </li><li> Effettuare cicli successivi, ad esempio, cicli 5-12, in un modo a due fasi in cui i cicli di ricottura e di estensione sono combinati e effettuate a 70 ° C per 30 sec e la denaturazione è ancora 98 ° C per 15 sec. NOTA: Il volume di reazione è di 30 ml per consentire una pausa il programma PCR e rimuovere una aliquota di 10 ml al numero di cicli predeterminati per monitorare l&#39;aspetto del prodotto desiderato. Tipicamente, i cicli di 10, 13, e 16 sono scelti per il test di un campione di RNA totale. </li></ol></li><li> Preparareun 8% non denaturante acrilamide gel miscelando 2 ml di 40% acrilammide, 1 ml di 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Quindi aggiungere 100 ml di 10% di APS e 10 ml di TEMED. Versare il gel e lasciare set. <ol><li> Pre-eseguire il gel a 12 V / cm di larghezza gel per 30 min. Pozzi a filo. Aggiungere 1 ml di 10x tampone di caricamento (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1% (w / v) di SDS, 0,01% (w / v) di blu di bromofenolo), aggiungere 10 ml di campione a ciascun pozzetto di dimensioni 5 millimetri x 1 mm x 15 mm. In genere, ogni bene può caricare fino a 30 ml di campioni. Eseguire il gel campione a 10 V / cm di larghezza gel 1x tampone TBE finché il colorante blu di bromofenolo appena esaurisce il fondo del gel. </li><li> Colorare e visualizzare il gel come descritto al punto 2.3. </li><li> Accise la coppia di banda di 146 base e eluire durante la notte in 0,25 ml di HSCB in modo simile a quanto descritto nella sezione 2.4. Precipitare il DNA in un uguale volume di isopropanolo e 1/10 di volume di acetato di sodio. Lavare pellet nel 70% eTHANOL e risospendere in tampone TE. </li><li> Quantificare la libreria utilizzando PicoGreen secondo le raccomandazioni del produttore. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+%28ENCyclopedia+Of+DNA+Elements%29+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
<li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La metodologia qui descritta si avvale di diverse variabili chiave per massimizzare l&#39;efficienza di legatura, ovvero alte concentrazioni di PEG, l&#39;uso di linker randomizzati, e alta concentrazione di linker 2,6,9. Questo approccio permette di librerie di sequenziamento in modo affidabile quantitativi di campioni di RNA totale di 2. Abbiamo condotto molteplici titolazioni di ingresso RNA e hanno concluso che il metodo precedente è più adatto per importi totali di RNA nel range 1-8 mg (dati n...

Metodologie basate High-throughput sequencing sono stati ampiamente applicati a molti campioni biologici negli ultimi anni notevolmente ampliando la nostra comprensione della complessità molecolare dei sistemi biologici 3,4. Tuttavia, la preparazione di campioni di RNA per high-throughput sequencing conferisce spesso pregiudizi specifici inerenti alla metodologia utilizzata, che limitano la potenziale utilità di queste tecniche potenti. Questi pregiudizi metodo specifico sono stati ben documentati per la base di legatura-piccolo-RNA preparati biblioteca 1,2,5,6. Questi pregiudizi in una modifica di 1000 volte in legge dei numeri per miRNA sintetici equimolari, facendo inferenza di miRNA abbondanza di dati di sequenziamento selvaggiamente variabile e soggetto a errori. Gli studi si concentrano sulle proprietà di T4 ligasi RNA fago-derivati ​​hanno documentato che gli enzimi mostrano preferenze di base nucleotide-7, che si manifestano come le biblioteche di parte negli esperimenti di sequenziamento high-throughput <sup&gt; 1,2,8. Per minimizzare le distorsioni impartite dalla RNA ligasi, molteplici strategie sono state impiegate; macromolecolare affollamento 9, randomizzare la sequenza nucleotidica sull&#39;adattatore che è prossimale al sito legatura 6, e utilizzando alte concentrazioni di adattatore legatura 2. Attraverso una combinazione di questi tre approcci abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per la preparazione imparziale di piccole librerie di RNA compatibili per high-throughput sequencing (Figura 1). Per i confronti diretti tra i protocolli correnti e il nostro metodo ottimizzato, si prega di fare riferimento al nostro recente rapporto 2. Questo metodo ottimizzato produce efficienze di legatura superiore al 95% sia a 3 &#39;e 5&#39; passi e permette la legatura imparziale di piccole molecole di RNA da campioni sintetici e biologici 2.

<table><tbody><tr><td>3' Linker (5' fosforilato, 3' bloccato)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5' Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5' bloccato, purificato HPLC</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specializzato per la legatura di adattatori di DNA pre-adenilato</td></tr><tr><td>10x Tampone di legatura (senza ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluso con M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampone di legatura (con ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluso con M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole (mol. Wt. 8.000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluso con M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Abbiamo riscontrato che l'acqua raccolta da un apparecchio di distillazione è di qualità equivalente.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Kit Superscript III RT</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit Phusion PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizzato</td><td>Informazioni sulla sequenza disponibili da Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizzate</td><td>Informazioni sulla sequenza disponibili da Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Informazioni sulla sequenza disponibili presso Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific BP14081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetratietilendiammina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x tampone di caricamento dell'RNA di denaturazione</td><td>New England Biolabs</td><td>Incluso con Lamette da barba M0351S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubi SpinX Centricon</td><td>Costar CLS8161</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi per microfuge a bassa ritenzione</td><td>Fisher</td><td>Scientific 02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Kit di adenilazione</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

legatura altamente efficiente delle piccole molecole di rna per microrna quantificazione mediante sequenziamento high-throughput

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mirna clonazione e high-throughput sequencing, chiamati miR-Seq, si trova solo come un approccio a livello di trascrittoma per quantificare miRNA con risoluzione di singolo nucleotide. Questa tecnica cattura miRNA collegando adattatori 3 &#39;e 5&#39; oligonucleotide alle molecole miRNA e permette la scoperta de novo miRNA. Accoppiamento con potenti piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, miR-Seq è stato determinante per lo studio della biologia miRNA. Tuttavia, distorsioni significative introdotte dal oligonucleotide passi legatura hanno impedito miR-Seq da essere impiegato come strumento di quantificazione accurata. Studi precedenti hanno dimostrato che i pregiudizi in attuali metodi di miR-Seq spesso portano a inesatte miRNA quantificazione di errori fino a 1.000 volte per alcuni miRNA 1,2. Per risolvere questi pregiudizi impartite dalla RNA legatura, abbiamo sviluppato un piccolo metodo di legatura RNA che si traduce in efficienza legatura di oltre il 95% sia per la 3 &#39;e 5&#39; passi legatura. Benchmarking questo imdimostrato metodo di costruzione libreria utilizzando miRNA sintetici equimolare o differenziale misti, produce sempre legge i numeri con deviazione inferiore a due volte rispetto al valore atteso. Inoltre, questo metodo ad alta efficienza miR-Seq permette accurate genome-wide miRNA profiling dall importo totale di campioni in vivo di RNA 2.

I risultati attesi per il metodo precedente dovrebbe inizialmente essere l'osservazione di un solo turno nucleotide (aumento) delle dimensioni del oligonucleotide DNA che è stato oggetto di adenylation da Mth RNA ligasi (Figura 2). Dopo 3 'legatura, visualizzazione del gel di acrilammide indica (vedi Figura 3) taglienti alte bande peso molecolare evidenti nella regione di 100-300 nucleotidi del gel. Ciò indica che il campione di RNA totale utilizzato è di alta qualità (non degr...

I microRNA (miRNA) sono una classe ampiamente conservata di molecole regolatorie. Qui descriviamo un metodo di clonazione dei miRNA che si basa su due potenti fasi di legatura seguite da un sequenziamento ad alto rendimento. Il nostro metodo consente un'accurata quantificazione dell'intero genoma dei miRNA.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare in modo imparziale i microRNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ciò si ottiene preparando o acquistando prima gli oligonucleotidi del DNA che sono competenti per la legatura alle tre estremità prime del micro RNA. Il secondo passo è legare i tre oligonucleotidi principali del DNA alle tre estremità prime del micro RNA.Successivamente, il prodotto di legatura viene purificato su gel e il linker oligonucleotidico a cinque RNA viene legato all'estremità a cinque primi del micro RNA. Il passaggio finale consiste nel convertire le molecole ibride in CDNA e quindi amplificare il CDNA mediante reazione a catena della polimerasi. In definitiva, il clonaggio di micro RNA e il sequenziamento ad alto rendimento vengono utilizzati per mostrare l'ampio profilo del trascrittoma dei microRNA in modo quantitativo alla risoluzione dei singoli nucleotidi.Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il microsequenziamento dei microraggi qPCR blot, è che la nostra tecnica riflette maggiormente il livello effettivo di microraggi su una scala di laboratorio su larga scala di trascrizione con una risoluzione di un singolo nucleotide. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia dei microRNA, può essere applicato anche ad altre tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento come HC clip e RNA-Seq. Gli oligonucleotidi del DNA per questa procedura sono progettati per tre reazioni di ligazione primaria e dovrebbero avere un gruppo fosfato a cinque primi, un dinucleotide randomizzato all'estremità a cinque primi e una citosina a tre primi diluire gli oligonucleotidi del DNA a 100 micromolari in acqua priva di nucleasi.Assemblare la reazione di ventilazione a combinando questi agenti reagenti: 200 moli pico dell'oligonucleotide primo linker, quattro microlitri di cinque prime DNAA tampone di ventilazione, quattro microlitri di un TP, quattro microlitri di M-T-H-R-N-A, ligasi e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 40 microlitri. Incubare la reazione a 65 gradi Celsius per un'ora. Terminare la reazione riscaldando a 85 gradi Celsius per cinque minuti.Precipitare il linker TED aggiungendo 2,5 volumi di etanolo al 100% e un terzo volume di acetato di ammonio molare a 10 molari. Per rimuovere un TP residuo e prevenire legature impreviste nelle reazioni future, mescolare l'alcol, il sale e la soluzione di oligonucleotidi fino a ottenere omogeneità centrifugando a piena velocità in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Lavare il pellet in etanolo al 70% e risospendere il pellet nel volume appropriato di acqua priva di nucleasi per produrre da 50 a 100 micromolari di un oligonucleotide ventilato.Confermare una ventilazione dell'oligonucleotide mediante elettroforesi su un gel di poliacrilammide al 18%. Pre-rotola il gel per 30 minuti a 24 volt centimetro di larghezza del gel con un tampone di corsa XTBE a temperatura ambiente. Una volta trascorsi i 30 minuti, sciacquare i pozzetti con un tampone di corsa.Gli oligonucleotidi del DNA per questa procedura sono progettati per tre reazioni di ligazione primaria e dovrebbero avere un gruppo fosfato a cinque primi, un dinucleotide randomizzato all'estremità a cinque primi e un'ossitocina a tre primi. Diluire gli oligonucleotidi del DNA a 100 micromolari in acqua priva di nucleasi. Esegui il gel a 24 volt per centimetro fino a quando il blu di bromo fenolo non si trova a tre quarti del fondo del perno del gel.Colora il gel con una soluzione di cyber gold in un XTBE e visualizza su una scatola di transluminatore UV. Ci dovrebbe essere uno spostamento di un singolo nucleotide nelle dimensioni dell'oligonucleotide del DNA che è stato soggetto a una ventilazione da parte della ligasi M-T-H-R-N-A per la reazione di legatura a tre prime. Assemblare i seguenti componenti sul ghiaccio in questo ordine.Un microlitro di 50% PEG 8.000 0,5 microlitri di tampone ligasi XRNA. Un microlitro di un linker ventilato a tre primi, 0,5 microlitri di inibitore di RNA, da 0,5 a otto microgrammi di RNA totale, 0,5 microlitri di T quattro, RNA ligasi, due e acqua libera da nucleasi fino a un volume finale di cinque microlitri. Miscelare la reazione pipettandola una volta accuratamente miscelata.Posizionare la reazione in un termociclatore con un coperchio riscaldato. Impostare il blocco a 16 gradi Celsius e incubare per quattro ore. Si noti che la reazione può essere scalata fino a un volume finale di 20 microlitri senza alcuna perdita di efficienza di legatura.Dopo le tre legature prime, mescolare la reazione con un volume uguale di due XRNA che caricano il calore del tampone a 70 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddare sul ghiaccio. Prossimo gel. Purificare il campione su un gel di poliacrilammide al 15%.Pre-eseguire il gel a 24 volt centimetri di larghezza del gel per almeno 30 minuti. Spegnere l'alimentazione e lavare i pozzetti con il tampone di corsa. Caricare il campione ed eseguire il gel alla stessa tensione della pre-corsa fino a quando il bromo fenolo non è appena uscito dal gel.Il prodotto desiderato migrerà vicino allo xilene ciano quando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide è completa. Metti il gel in un vassoio pulito con un tampone di scorrimento e uno di cyber gold e fai una roccia per 15 minuti. Rimuovere il gel dalla vaschetta di colorazione e visualizzare su una scatola del transluminatore UV coperta con pellicola di plastica pulita.Il prodotto della legatura dovrebbe essere lungo circa 45 nucleotidi. Poiché questo prodotto di legatura di solito non è visibile, è importante includere un campione di RNA sintetico di controllo positivo nella corsia adiacente utilizzando un'exci di lama di rasoio pulita, la regione contenente il prodotto di legatura. Guidato dalle posizioni del campione di RNA sintetico e dagli standard dimensionali.Mettere il frammento di gel di accisa in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri. Forare il fondo della provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri con un ago calibro 30 e posizionare la provetta per microcentrifuga pulita a bassa ritenzione da 1,5 millilitri per cinque minuti a circa 15.000 volte. G. Confermare visivamente che l'intera fetta di gel si sia spostata attraverso il foro nella camera d'aria.Se necessario, utilizzare una punta della pipetta pulita per spingere alcuni frammenti di gel più vicino al foro. Scartare la provetta vuota da 0,5 millilitri e aggiungere 400 microlitri di tampone ad alta colonna salina all'impasto di acrilammide. Far oscillare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo.Trasferire l'impasto in una colonna di centrifuga in acetato di cellulosa da 0,22 micron utilizzando una centrifuga con puntali per pipette a foro largo per tre minuti a temperatura ambiente a circa 15.000 volte. G per raccogliere tutto il liquido lontano dalla matrice di gel di acrilammide. Trasferire il liquido in una provetta pulita da 1,5 millilitri a bassa ritenzione contenente un microlitro di una soluzione di glicogeno da 20 milligrammi per millilitro.Aggiungere un volume uguale di isopropanolo e un decimo volume di acetato di sodio e mescolare la soluzione capovolgendo più volte il tubo. Far precipitare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti. Centrifugare alla massima velocità a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Per pellettare l'acido nucleico, rimuovere la laccia e lavare con aria al 70% di etanolo. Asciugare il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere direttamente alla fase di legatura a cinque prime. Per iniziare questa procedura, aggiungere i seguenti componenti all'acido nucleico pellettato in precedenza, due microlitri di PEG 8.000, 0,5 microlitri di tampone RNA ligasi, 0,5 microlitri di TP, 0,5 microlitri di linker, RNA oligonucleotide e acqua fino a un volume finale di quattro microlitri.Miscelare questo campione pipettandolo ripetutamente su e giù per un massimo di cinque minuti per assicurarsi che il pellet sia stato completamente risolubilizzato. Una volta che il pellet è in soluzione, trasferire il contenuto in una provetta per PCR pulita contenente un microlitro di una miscela uno-a-uno di inibitore dell'RNA e uno di RNA ligasi T quattro miscelato mediante pipettaggio su e giù. Incubare la reazione in un termociclatore a 37 gradi Celsius per quattro ore.Quando la reazione è completa, procedere immediatamente alla sintesi di CD NA come descritto nel testo del protocollo dopo la legatura del linker alle tre estremità prime dell'RNA e l'analisi delle reazioni. Nella regione da 100 a 300 nucleotidi del gel sono evidenti bande di alto peso molecolare, il che indica che il campione di RNA totale utilizzato è di alta qualità. Il segnale molto luminoso nella regione dei 25 nucleotidi del gel è un eccesso di RNA sintetico a tre linker primi non legati indica una legatura eseguita con cinque picomoli di micro RNA sintetico e un linker a tre prime, che è stato purificato con gel.Qui è mostrato un autoradiogramma di tre reazioni di legatura primaria eseguite con P 32 5 prime e micro RNA sintetico marcato. Il numero di ore in cui la reazione è stata autorizzata a procedere è indicato in alto, mentre i numeri in basso indicano le quantità legate come percentuale della somma di non legati e legati. Questo autoradiogramma è costituito da cinque reazioni di legatura primaria eseguite con micro RNA sintetico marcato con P 32 5 prime end marcato tre ibridi prime linker.I numeri in basso indicano le quantità legate come percentuale della somma di non legati e legati, e rivelano l'importanza di utilizzare un'alta concentrazione di PEG 8.000 piccoli R-N-A-D-N-A. Le librerie compatibili per il sequenziamento ad alta produttività vengono successivamente generate mediante PCR. Il numero corretto di cicli di PCR è determinato empiricamente.In questo esempio, la dimensione del prodotto di DNA atteso è di 146 coppie di basi Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in soli due giorni. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è importante ricordare di mantenere tutte le punte e le provette prive di RNA.

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Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput (Video) | JoVE Journal

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