Espressione, solubilizzazione detergente, e purificazione di un trasportatore di membrana, la proteina multiresistente MexB Resistenza

Al fine di purificare la proteina di membrana Mex B, Mex B viene prima espresso in e coli utilizzando metodi di DNA ricombinante. Quindi le membrane vengono isolate e le proteine di membrana vengono solubilizzate con un detergente delicato. La proteina di membrana solubilizzata viene purificata tramite iMac e la proteina viene ulteriormente purificata attraverso la cromatografia con filtrazione su gel.

Il livello di purificazione della proteina viene determinato utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS. Sebbene questa procedura possa fornire informazioni sui trasportatori transmembrana multi-farmaco-resistenza, può anche essere applicata ad altre proteine di membrana dimostrando che le procedure odierne saranno formate da uno studente laureato del mio laboratorio Per questa procedura, Mex B da pseudomonas Aosa verrà subclonato nel vettore di espressione PET 30 B plus in modo che Mex B sia espresso con un tag di istamina HEXA C terminale. Inizia la sera inoculando quattro colture di micina da tre millilitri con trasformanti freschi o usa un brodo congelato, coltiva le colture su un rullo a 37 gradi Celsius durante la notte al mattino.

Utilizzare le colture notturne per inoculare 150 millilitri di LB contenenti 30 microgrammi per millilitro. Mycin può far crescere la coltura a 37 gradi Celsius su uno shaker nel pomeriggio? Utilizzare la piccola coltura per inoculare sei volte un litro, due terreni XYT contenenti 30 microgrammi per millilitro.

La micina può tornare in fiaschetta di felce? Utilizzare 25 millilitri per coltura per una diluizione da uno a 40. Coltiva le colture a 37 gradi Celsius fino a raggiungere una densità ottica.

600 da 0,4 a 0,6, circa 1,5 ore. Quando le colture raggiungono la densità corretta, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 millilitri di un molare. IPTG. Rimetti tutti i palloni nello shaker e continua a farli crescere a 30 gradi Celsius durante la notte fino alla raccolta dei batteri la mattina seguente.

Recupera le colture dallo shaker e raffreddale. Quindi, per raccogliere le cellule, trasferire le colture in provette da centrifuga e centrifugare a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 5.000 rotazioni al minuto in una centrifuga su larga scala mentre le cellule sono in centrifugazione. Integrare 100 millilitri di tampone di sospensione cellulare con DNA, inibitori della proteasi e lisozima.

Integrare anche due aliquote di tampone di sospensione Resus di membrana con inibitori della proteasi come mostrato in questa tabella. Mantenere tutte e tre le soluzioni in ghiaccio al termine della centrifugazione. Resus spendere i pellet cellulari in 100 millilitri di sospensione di reus cellulare Buffer.

Quindi, estrai le cellule. La sospensione della cella viene caricata nella cella a pressione francese e la cella viene posizionata sulla pressa francese. La pressione viene applicata fino a raggiungere i 12.000 libbre per pollice quadrato.

La valvola viene aperta molto poco in modo che le cellule rotte gocciolino. È importante non aprire troppo la valvola e lasciare che le cellule fuoriescano perché verranno rilasciate con troppa poca pressione e non verranno rotte in modo efficiente. Raccogli il lisato cellulare in una bottiglia, tenuta fredda con ghiaccio.

Passare nuovamente la soluzione cellulare attraverso una cella a pressione francese a 12.000 libbre per pollice quadrato. Trasferire il lisato cellulare in provette da centrifuga SS 34 e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari a 10.000 rotazioni al minuto per 30 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore SS 34. Il lisato chiarificato è il prossimo.

Utilizzato per preparare la frazione di membrana. Trasferisci con cura il supinato in ti. 6 4, 7 0,5 provette per ultra centrifuga, centrifugare in un rotore TI 6 4 7 0,5 a 40.000 giri al minuto per 50 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il supinato. Utilizzare una pipetta per risospendere delicatamente il pellet, che contiene le membrane cellulari in circa 25 millilitri di tampone di sospensione Resus della membrana, trasferire la sospensione della membrana in una provetta da centrifuga pulita e centrifugare il guadagno in un rotore TI I 6 4 7 0,5 di 40.000 rotazioni al minuto per 50 minuti di quattro gradi Celsius e risospendere la tavolozza della membrana lavata in 25 millilitri di tampone di sospensione Resus della membrana. Successivamente, solubilizzare le proteine di membrana nelle membrane risospese a circa 25 millilitri.

Aggiungere sei millilitri di 10% DDM in modo che la concentrazione finale del detergente sia del 2% DDM far oscillare la miscela a quattro gradi Celsius per due ore dopo l'incubazione di due ore in presenza di centrifuga DDM, la miscela a 40.000 rotazioni al minuto per 40 minuti a quattro gradi Celsius nel rotore TI I 6 4 7 0,5. Al fine di separare i complessi detergenti proteici solubili dalle proteine insolubili. Conservare il natante supino che contiene i complessi detergenti proteici Mex B da utilizzare nella miscela di purificazione, il natante supino contenente i complessi detergenti proteici Mex B con due millilitri di perle di affinità metallica lon bilanciate in sospensione Resus Buffer, incubare per un'ora su un rullo a quattro gradi Celsius dopo aver legato le proteine alla resina.

Versare il liquame in un corpo della colonna di flusso per gravità e scartare il flusso. Lavare la colonna con 20 millilitri o 10 volumi di rilegatura per iMac e tampone di lavaggio al termine del lavaggio della colonna. Eluire le proteine legate con 10 millilitri di tampone di eluizione iMac.

Prelevare campioni da 10 microlitri di ciascuna frazione di eluizione. Mescolare con 10 microlitri di campione SDS due volte, tamponare e analizzare su un poliacrilammide al 10%. Gel SDS.

Stimare la quantità e la purezza di mex B in ogni frazione. Estrarre le frazioni contenenti i complessi detergenti proteici Mex B e concentrarle in un concentratore centrifugo a quattro gradi Celsius. Fai attenzione che la proteina non precipiti in questa fase.

Usa diversi giri brevi e fai attenzione alle precipitazioni. Dopo ogni centrifuga, procedere alla purificazione delle frazioni raggruppate utilizzando una colonna di filtrazione su gel. Pre equilibrare un super rose 12 HL 30 su 10 colonne con 24 millilitri di tampone di corsa e attendere una linea di base piatta.

Quindi, risciacquare il ciclo di caricamento del sistema attore con il buffer in esecuzione. Prima di applicare la proteina alla colonna, filtrare la soluzione proteica utilizzando un filtro a siringa. Quindi caricare fino a 240 microlitri di soluzione proteica sulla colonna con una proteina fino a cinque milligrammi per millilitro.

Eseguire 1,5 volumi di colonna di tampone e raccogliere frazioni di 0,25 millilitri. I complessi detergenti proteici XB eluiscono come picco a circa 10-15 millilitri di volume di eluizione. Prelevare campioni di cinque microlitri delle frazioni di picco.

Mescolare ogni campione uno a uno con due volte il buffer di campionamento SDS. Analizzare i campioni su un gel di poliacrilammide al 10% per stimare la quantità e la purezza di me Mex B in ciascuna frazione, estrarre le frazioni contenenti ME B puro.Questo gel di poliacrilammide è stato caricato con frazioni estratte dalla colonna iMac e singole frazioni dalla colonna di filtrazione del gel. Dopo la colonna di filtrazione su gel, la proteina appare pura sul gel di poliacrilammide colorato con kumasi.

Una traccia dalla colonna di filtrazione su gel mostra il picco principale del complesso detergente proteico che eluisce dalla colonna. La resa media della proteina mxb è di circa due milligrammi per sei litri di due colture XYT Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in otto ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere, solubilizzare e purificare una proteina di membrana.