Espressione, solubilizzazione detergente, e purificazione di un trasportatore di membrana, la proteina multiresistente MexB Resistenza

Per purificare la proteina di membrana Mex B, inizialmente Mex B viene espresso in e coli utilizzando metodi di DNA ricombinante. Successivamente, le membrane vengono isolate e le proteine di membrana sono solubilizzate con un detergente delicato. La proteina di membrana solubilizzata viene purificata mediante cromatografia a legame metallico immobile (iMac) e la proteina è ulteriormente purificata mediante cromatografia di filtrazione su gel.

Il livello di purificazione della proteina viene determinato mediante elettroforesi su gel di POLIACRILAMIDE-SDS. Sebbene questa procedura possa fornire informazioni sui trasportatori transmembrana responsabili della resistenza multipla ai farmaci, può essere applicata anche ad altre proteine di membrana. Le procedure dimostrate oggi saranno eseguite da uno studente laureato del mio laboratorio. Per questa procedura, Mex B di Pseudomonas Aosa verrà clonato nel vettore di espressione PET 30 B plus, in modo che Mex B venga espresso con un marcatore esa-istidinico al C-terminale. Iniziare la sera inoculando quattro colture di lb con micina da tre millilitri con trasformanti freschi oppure utilizzando una coltura congelata, quindi far crescere le colture su un agitatore rotante a 37 gradi Celsius durante la notte. Al mattino.

Utilizzare le colture ottenute durante la notte per inoculare 150 millilitri di LB contenente 30 microgrammi per millilitro. Può Mycin far crescere la coltura a 37 gradi Celsius su un agitatore nel pomeriggio? Utilizzare la coltura piccola per inoculare sei volte un litro, due mezzi XYT contenenti 30 microgrammi per millilitro.

Canamicina nei flaconi con collo a imbuto? Utilizzare 25 millilitri per coltura per una diluizione di uno a 40. Far crescere le colture a 37 gradi Celsius fino al raggiungimento di una densità ottica.

600 compreso tra 0,4 e 0,6, circa 1,5 ore. Quando le colture raggiungono la densità appropriata, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 millilitri di IPTG una molare. Rimettere tutti i flaconi nell'agitatore e continuare la crescita a 30 gradi Celsius per tutta la notte, fino al raccolto dei batteri la mattina seguente.

Recuperare le colture dallo shaker e raffreddarle. Quindi, per raccogliere le cellule, trasferire le colture in provette da centrifuga e centrifugare a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 5.000 giri al minuto in una centrifuga su larga scala mentre le cellule sono in fase di centrifugazione. Aggiungere a 100 millilitri di tampone di risospensione cellulare inibitori delle DNA proteasi e lisozima.

Aggiungere inoltre in due aliquote di tampone di sospensione delle membrane Resus inibitori della proteasi come indicato in questa tabella. Mantenere tutte e tre le soluzioni sul ghiaccio al termine della centrifugazione. Sospendere i pellet cellulari in 100 millilitri di tampone di sospensione cellulare Resus.

Successivamente, estrarre le cellule. La sospensione cellulare viene caricata nella cella a pressione francese e la cella viene posizionata sul pressa francese. La pressione viene applicata fino a quando non raggiunge i 12.000 pound per pollice quadrato.

La valvola viene aperta di un'entità minima in modo che le cellule rotte fuoriescano goccia a goccia. È importante non aprire eccessivamente la valvola, altrimenti le cellule fuoriescono con uno spruzzo, venendo rilasciate con pressione insufficiente e non venendo rotte in modo efficiente. Raccogliere il lisato cellulare in un contenitore mantenuto freddo sul ghiaccio.

Fare passare nuovamente la soluzione cellulare attraverso una cella a pressione francese a 12.000 pound per pollice quadrato. Trasferire il lisato cellulare in provette per centrifuga SS 34 e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari a 10.000 giri al minuto per 30 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore SS 34. Il lisato chiarificato è il passaggio successivo.

Utilizzato per preparare la frazione di membrane. Trasferire con attenzione il soprannatante in provette per ultracentrifuga ti. 6 4, 7 0,5, quindi centrifugare in un rotore TI 6 4 7 0,5 a 40.000 giri al minuto per 50 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il soprannatante. Utilizzare una pipetta per risospendere delicatamente il pellet, che contiene le membrane cellulari, in circa 25 millilitri di buffer di risospensione delle membrane (membrane Resus suspension buffer). Trasferire la sospensione di membrane in un tubo da centrifuga pulito e centrifugare a 40.000 giri al minuto per 50 minuti a 4 gradi Celsius in un rotore TI-647. Risospendere la pastiglia di membrane lavate in 25 millilitri di buffer di risospensione delle membrane (membrane Resus suspension buffer). Successivamente, solubilizzare le proteine di membrana aggiungendole alle membrane risospese in un volume di circa 25 millilitri.

Aggiungere sei millilitri di DDM al 10% in modo che la concentrazione finale del detergente sia del 2% DDM. Agitare la miscela a quattro gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione di due ore in presenza di DDM, centrifugare la miscela a 40.000 giri al minuto per 40 minuti a quattro gradi Celsius nel rotore TI I 6 4 7 0.5, al fine di separare i complessi proteina-detergente solubili dalle proteine insolubili. Conservare il sopranatante che contiene i complessi proteina Mex B-detergente da utilizzare nella purificazione. Mescolare il sopranatante contenente i complessi proteina Mex B-detergente con due millilitri di perle per affinità con ioni metallici equilibrate nel buffer di sospensione Resus, quindi incubare per un'ora su un rullo a quattro gradi Celsius dopo il legame delle proteine alla resina.

Versare la sospensione in un corpo di colonna a flusso gravitazionale e scartare il flusso iniziale. Lavare la colonna con 20 millilitri o 10 volumi di colonna di tampone di legame e lavaggio iMac quando il lavaggio della colonna è completato. Eluire le proteine legate con 10 millilitri di tampone di eluizione iMac.

Prelevare campioni di 10 microlitri di ciascuna frazione di eluizione. Mescolare con 10 microlitri di buffer campione SDS 2x e analizzare su un gel di poliacrilammide al 10% in condizioni denaturanti.

Stimare la quantità e la purezza di Mex B in ciascuna frazione. Raccogliere le frazioni contenenti i complessi proteina-detergente di Mex B e concentrarle in un concentratore a centrifuga a quattro gradi Celsius. Prestare attenzione affinché la proteina non precipiti in questo passaggio.

Effettuare diverse centrifugazioni brevi e osservare la formazione di precipitato. Dopo ogni centrifugazione, procedere alla purificazione delle frazioni raggruppate mediante una colonna di filtrazione su gel. Pre-equilibrare una colonna Super Rose 12 HL 30/10 con 24 millilitri di buffer di eluizione e attendere il raggiungimento di una linea di base piatta.

Successivamente, risciacquare il circuito di carico del sistema con il tampone di corsa. Prima di applicare la proteina sulla colonna, filtrare la soluzione proteica utilizzando un filtro a siringa. Quindi caricare fino a 240 microlitri della soluzione proteica sulla colonna, con una proteina a una concentrazione fino a cinque milligrammi per millilitro.

Eseguire 1,5 volumi di colonna di tampone e raccogliere frazioni da 0,25 millilitri. I complessi proteina XB-detergente eluiscono come un picco a circa 10-15 millilitri di volume di eluizione. Prelevare campioni da cinque microlitri dalle frazioni del picco.

Mescolare ogni campione in rapporto uno a uno con il buffer campione SDS al doppio della concentrazione. Analizzare i campioni su un gel di poliacrilammide al 10% per stimare la quantità e la purezza della me Mex B in ciascuna frazione, raccogliendo le frazioni contenenti ME B pura. Questo gel di poliacrilammide è stato caricato con le frazioni raccolte dalla colonna iMac e con frazioni individuali della colonna di filtrazione su gel. Dopo la colonna di filtrazione su gel, la proteina appare pura sul gel di poliacrilammide colorato con kumasi.

Un tracciato della colonna di filtrazione su gel mostra il picco principale del complesso proteina-detergente che eluisce dalla colonna. La resa media della proteina mxb è di circa due milligrammi per sei litri di coltura 2XYT. Una volta appresa, questa procedura può essere completata in otto ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esprimere, solubilizzare e purificare una proteina di membrana.