Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in Escherichia coli

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare le proteine di membrana espresse in SIA coli per analisi strutturali e funzionali. In primo luogo, i batteri vengono raccolti, vengono mentiti e analizzati dalla pagina SDS per la visualizzazione delle proteine GFP correttamente ripiegate mediante fluorescenza Ingel. Nella seconda fase, la produzione dell'e coli determinato ad esprimere le proteine di membrana di interesse viene scalata e una frazione totale di membrana viene preparata dalle cellule dopo l'induzione dell'espressione proteica.

Infine, la frazione totale della membrana viene solubilizzata in quattro diversi detergenti e la mono dispersione del detergente. Solubilizzato. Le proteine GFP vengono analizzate mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Infine, le proteine possono essere monitorate mediante fluorescenza e i profili eluciani possono essere tracciati per valutare la monodispersione di aggregazione e la GFP libera nei campioni.

La produzione di proteine di membrana ricombinanti per studi strutturali e funzionali rimane tecnicamente impegnativa a causa della loro bassa solubilità e ereditano l'instabilità una volta estratte nei detergenti. L'esperienza ha dimostrato che lo screening di più varianti di proteine di membrana, come gli ortologhi di specie diverse, può migliorare il tasso di successo dell'espressione proteica di membrana. Fusione con proteine fluorescenti verdi utilizzate per segnalare un ripiegamento autentico.

Il primo passo del nostro protocollo basato su GFP per lo screening dell'espressione delle proteine di membrana e dell'Escherichia coli utilizza la fluorescenza ingel di lisati detergenti da cellule intere per identificare i costrutti proteici di membrana per ulteriori analisi basate sul livello di espressione nello screening, Il comportamento della selezione delle proteine di membrana e dei diversi detergenti viene quindi valutato utilizzando la rilevazione a fluorescenza accoppiata alla cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo fornisce informazioni sulla mono dispersità dei complessi proteici del detergente. Per analizzare l'espressione batterica indotta da IPTG, iniziare trasferendo un millilitro di duplicato di colina trattata con IPTG da 24 blocchi di pozzetti profondi durante la notte in 96 blocchi di pozzetti profondi, sigillare i blocchi e quindi far girare le cellule per 10 minuti a 6.000 volte G a temperatura ambiente.

Successivamente, capovolgere il blocco per travasare il supporto picchiettando delicatamente su un tovagliolo di carta per drenare il liquido rimanente. Sigillare nuovamente la piastra e conservare le celle a meno 80 gradi Celsius dopo almeno 20 minuti. Scongelare i pellet per 20 minuti a temperatura ambiente e quindi utilizzare una pipetta multicanale per risospendere completamente le cellule in 200 microlitri di tampone di lisi.

Trattare le cellule con 20 microlitri di soluzione DLPI agitando a 1000 giri/min e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere 25 microlitri di 10%doda multiside in ogni pozzetto e incubare le cellule per altri 60 minuti agitando. Dopo la centrifuga di trattamento DDM, il pozzetto profondo si blocca e quindi trasferisce 10 microlitri di lisato chiarito su una piastra per microtitolazione e aggiunge 10 microlitri di tampone di caricamento del gel per pagine SDS.

Ora caricare il gel con 10 microlitri di soluzione tampone lisato per pozzetto e far funzionare il gel a tensione costante tra 100 e 120 volt in una cella frigorifera per due o 2,5 ore quando il diaframma raggiunge il fondo. Posizionare il gel su un imager con un filtro per la luce blu per rilevare le proteine di fusione e ingrandire le colture cellulari. Dopo aver trasformato un Eloqua di e coli competente, raccogli una colonia in 10 millilitri di brodo energetico per una crescita notturna a 37 gradi Celsius.

La mattina successiva diluire cinque millilitri della coltura notturna in 500 millilitri di brodo energetico e continuare a far crescere le colture agitando a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Quando l'OD a 595 nanometri è di circa 0,5, indurre l'espressione aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di un millimolare, quindi rimettere la coltura nell'agitatore durante la notte, questa volta a 20 gradi Celsius. La mattina successiva, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e conservare i pellet a meno 80 gradi Celsius.

Per preparare le membrane cellulari. Risospendere il terzo pellet a temperatura ambiente in cinque millilitri di PBS per grammo di pellet cellulare, aumentando il volume secondo necessità fino a quando la viscosità non si riduce a una consistenza liquida. Quindi aggiungere cloruro di magnesio a una concentrazione finale di DNA millimolare a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e una compressa di inibitore della proteasi preconfezionata per 20 grammi di pellet cellulare alle cellule.

Quindi, aprire le celle utilizzando un disgregatore di celle refrigerato a una pressione di 30 KPSI e quindi pellettare le celle intatte e i detriti per 15 minuti a 30.000 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire il supinato in una provetta per ultracentrifugazione e raccogliere la frazione totale della membrana facendo girare il supinato per un'ora a 200, 000 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare l'omogeneizzatore cellulare per risospendere il pellet di membrana in 10 millilitri di PBS ghiacciato per solubilizzare le membrane per ogni detergente da utilizzare.

Aliquotare 900 microlitri della sospensione a membrana in un tubo di policentrifi da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 100 microlitri di ogni detersivo appena preparato negli appositi tubi da 1,5 millilitri e incubare le miscele a quattro gradi Celsius con vegetazione delicata. Dopo un'ora, pellettare il detergente e le frazioni solubili con un'ultra centrifuga da banco, assicurandosi che le provette siano piene almeno per metà e mantengano l'agente supino per la cromatografia ad esclusione dimensionale fluorescente rilevata o l'analisi FEC.

Successivamente, una colonna di esclusione delle dimensioni dell'equatore con un ampio intervallo di frazionamento con tampone di flusso in esecuzione a una velocità di 0,3 millilitri al minuto. Quindi iniettare 100 microlitri di un campione di membrana solubilizzata sulla colonna alla stessa velocità di flusso e monitorare il profilo eluciano utilizzando l'ottica a fluorescenza. Infine, importare i dati del volume eluciano e dell'intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo per la visualizzazione grafica e analizzare il materiale di membrana solubilizzato rimanente mediante fluorescenza ingel.

Come dimostrato in precedenza, la suddetta famiglia di proteine è essenziale per la divisione cellulare batterica. In queste immagini, viene mostrato un rappresentante nella visualizzazione della fluorescenza su gel di 24 costrutti OUTTA 47 suddetti. L'intensità delle bande dà un'indicazione del livello di espressione.

Ad esempio, la proteina di fusione nella quarta scena della corsia è espressa bene in entrambi i ceppi. Tuttavia, le ulteriori bande di peso molecolare più basse suggeriscono che la proteina è parzialmente degradata in molte corsie. C'è una banda che corrisponde per dimensioni alla sola GFP.

Ad esempio, G quattro e H quattro sono completamente scomposti in GFP libera nel ceppo C 41 DE tre P lies S. Mentre nel LEMO 21 DE tre, c'è una proteina intatta in questi grafici. L'analisi di due costrutti che hanno ottenuto buoni risultati nello screening primario mediante l'esclusione dimensionale rilevata dalla fluorescenza dimostra come le proteine si comportino in modo diverso a seconda di quale dei quattro detergenti è stato testato.

Ad esempio, questa proteina ha dato solo un picco simmetrico con l'aggregazione della lettiera in Dool Multiside, rendendola il detergente di scelta per la successiva purificazione. Al contrario, l'altra proteina di fusione ha mostrato un profilo simile in tutti i detergenti testati. Questo protocollo può essere facilmente ampliato per includere, ad esempio, diversi ceppi di E coli cresciuti in diverse condizioni di espressione e ulteriori deterrenti sia negli screening primari che secondari.

In sintesi, lo scopo principale di questo protocollo è quello di consentire lo screening di un gran numero di proteine di membrana in termini di espressione e di detergentizzazione, al fine di identificare i candidati per ulteriori analisi.