Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di selezionare aptameri di DNA specifici per gruppi di piccole molecole altamente idrofobiche e di utilizzare l'aptamero selezionato per sviluppare un biosensore elettrochimico sensibile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della selezione degli aptameri, su come selezionare e caratterizzare gli aptameri gruppo-specifici quando i bersagli sono molecole altamente idrofobiche. Mentre la parte più utile di questo metodo è lo sviluppo di biosensori elettrochimici, per il rilevamento di titoli.

Questi biosensori dovrebbero funzionare anche per le nostre misure di affinità degli aptameri. Per iniziare la reazione, aggiungere 100 microlitri di acqua priva di RNasi al prodotto aptamero PCR purificato. Agitare la miscela fino a quando il precipitato non si è sciolto.

La reazione esonucleasica lambda è sensibile alla concentrazione di sale ed è un prodotto che dovrebbe essere proliferato dalla precipitazione dell'etanolo, ma un altro isopropanolo. Mettere in ciascuna delle cinque provette per microcentrifuga, cinque microlitri della soluzione aptamero, 11 microlitri di acqua priva di Rnasi e due microlitri di tampone di reazione 10x. Aggiungere due microlitri di acqua priva di Rnasi e soluzioni di due, cinque, otto e 10 unità di esonucleasi lambda in acqua priva di Rnasi in un tubo ciascuno.

Mescolare bene con un pipettaggio delicato. Incubare le provette a 37 gradi Celsius per 35 minuti e a 80 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi tenere i tubi a quattro gradi Celsius e preparare un gel nativo al 12%.

Aggiungere a ogni tubo un microlitro di colorante di carico e quattro microlitri di acqua priva di RNASI. Far scorrere le miscele nel gel nativo a 150 volt per 45 minuti. Identificare la quantità più bassa di esonucleasi lambda necessaria per generare completamente DNA a singolo filamento.

Eseguire una reazione su larga scala per generare DNA a filamento singolo. Per ogni bersaglio di legame da testare, incubare 10 microlitri di biglie magnetiche codificate DBP mediamente funzionalizzate con 500 microlitri di una soluzione micromolare di DBP-1 per un'ora a temperatura ambiente durante la rotazione. Quindi scartare il surnatante.

Lavare le perle quattro volte con 200 microlitri di tampone legante PAE e risospendere le perle in 10 microlitri di tampone legante PAE. Ottenere 10 dispersioni di test del bersaglio di legame micromolare nel tampone di legame PAE. È ottimo per la dispersione dei bersagli idrofobici nel tampone di legame PAE.

Per garantire che, vi sia un arricchimento della libreria, sono stati selezionati nell'ambito di test di affinità. Aggiungere 10 microlitri di microsfere codificate DBP-1 a 110 microlitri di ciascuna soluzione di test target. Incubare le miscele per un'ora e raccogliere i surnatanti mediante separazione magnetica.

Diluire i surnatanti 100 volte e utilizzare tre microlitri per ogni PCR quantitativa. Calcolare le affinità relative dividendo il numero di DBP-1 rilasciati in presenza del campione di prova per il numero di DBP-1 rilasciati nel solo tampone di legame PAE. Prima di eseguire le misurazioni, sintetizzare e purificare la sonda di sequenza a nucleo tiolato basata su DBP-1 e la sonda di segnalazione.

Ricostituire la sonda tiolata e la sonda di segnalazione e come 100 soluzioni micromolari in acqua priva di nucleasi. Quindi lucidare un elettrodo d'oro di due millimetri di diametro su una superficie simile a uno specchio con una polvere di allumina da 0,3 e 0,5 micron e un panno in microfibra per cinque minuti ciascuno. Sonicare l'elettrodo in acqua ultra pura per cinque minuti dopo ogni lucidatura.

Immergere l'elettrodo lucidato in una soluzione 0,5 molare di acido solforico. Pulire l'elettrodo con 35 scansioni voltammetriche cicliche successive da meno 0,4 a 1,2 volt positivi rispetto al calomelano al mercurio a 100 millivolt al secondo. Preparare quindi in una provetta da centrifuga a parete sottile una miscela di sonda tiolata 0,5 micromolare DBP-1.

E 0,5 micromolari FC modificato DBP-1 in 100 microlitri di PBS. Scaldare il composto a bagnomaria a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi lasciare raffreddare il composto a temperatura ambiente a bagnomaria.

Aggiungere un microlitro di una soluzione madre di TCEP da 10 millimolari alla miscela raffreddata e mantenere a temperatura ambiente per un'ora. Quindi immergere l'elettrodo d'oro pulito nella miscela per 12 ore a temperatura ambiente. Sciacquare l'elettrodo con PBS e quindi immergere l'elettrodo in una soluzione millimolare di PEG tiolato in PBS per un'ora.

Sciacquare accuratamente l'elettrodo con un tampone legante PAE privo di target e immergere l'elettrodo nel tampone. Successivamente, sonicare le celle elettrolitiche del controelettrodo in platino e di un elettrodo di riferimento in calomelano saturo per due minuti ciascuna in acqua ultra pura e tampone legante PAE in sequenza. Apri l'onda quadra del software dello strumento di voltammetria e inserisci i parametri dell'esperimento.

Riempire una cella elettrolitica pulita con un tampone legante PAE privo di target. Collegare i tre elettrodi puliti a un potenziostato e immergere gli elettrodi nel tampone. Acquisisci una scansione SWV in background.

Quindi immergere l'elettrodo di lavoro in oro in una soluzione di DEHP 10 picamolare in tampone legante PAE per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare accuratamente l'elettrodo con il tampone legante PAE. Immergere tutti e tre gli elettrodi in un tampone di legame PAE fresco e raccogliere un'altra curva SWV utilizzando gli stessi parametri di prima.

Ripetere questo processo con concentrazioni crescenti di DEHP per ottenere una curva di titolazione. La quantità minima di esonucleasi lambda necessaria per ottenere solo il DNA a singolo filamento è risultata essere di due unità sulla base di reazioni su piccola scala. Il candidato aptamero DBP-1 è stato identificato mediante SELEX seguito da un sequenziamento ad alto rendimento.

DBP-1 ha mostrato una buona specificità di gruppo per i congeneri PAE. Un aptasensore elettrochimico che utilizza DBP-1 ha risposto selettivamente al DEHP rispetto ad altri inquinanti ambientali comuni. L'aptasensor era altamente sensibile al DEHP con la risposta a concentrazioni fino a 10 picamolari.

Particella laser dove selezione e caratterizzazione di aptameri per piccole molecole idrofobiche pericolose. La caratterizzazione e la volatilizzazione degli aptameri di piccole molecole idrofobiche come le PAE è generalmente piuttosto impegnativa, a causa della solubilità in acqua estremamente limitata e del basso peso molecolare delle PAE. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare un aptasensore elettrochimico e di come usarlo per rilevare i titoli.