ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare librerie di sequenziamento per la risoluzione di coppie di basi D-N-A-C-P-G, analisi di metilazione basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la citosina mediante conversione del solfito. Ciò si ottiene eseguendo prima il digest dell'enzima di restrizione MSP one di DNA di alta qualità, seguito dalla riparazione finale, dalla coda e dalla legatura degli adattatori metilati. Il passo successivo consiste nell'eseguire la conversione del solfito su frammenti selezionati di dimensioni successive alla conversione del solfito.

I frammenti vengono amplificati mediante PCR. La fase finale consiste nell'esecuzione del controllo qualità e del sequenziamento, seguiti dalla visualizzazione e dall'analisi dei dati. In definitiva, una rappresentazione ridotta migliorata del sequenziamento del bisolfito rileva la risoluzione quantitativa delle coppie di basi dei pattern di metilazione della citidina in loci genomici ricchi di CG.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi di metilazione del DNA, come i microarray, è che può utilizzare piccole quantità di materiale in ingresso per generare dati di metilazione D-N-A-C-P-G ad alta copertura con risoluzione di coppie di basi e siti biologicamente rilevanti. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando eravamo interessati a esplorare i modelli epigenetici al di là delle regioni coperte dai saggi tradizionali. Eravamo interessati a sviluppare questa tecnica per passare dai microarray alla generazione di dati di metilazione del DNA con risoluzione di coppie di basi che potrebbero essere integrati con i dati generati da altre tecniche di prossima generazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica. Ad esempio, il pattern epigenetico e l'eterogeneità nei campioni biologici rispetto ai normali controlli o ad altri stati patologici. In generale, le persone che non conoscono questo metodo lo troveranno difficile a causa della lunghezza della procedura, dei numerosi requisiti specifici e delle caratteristiche di sequenziamento uniche delle librerie generate Mamie Fall.

Uno specialista di ricerca nel nostro laboratorio assisterà nella dimostrazione della procedura per iniziare questo protocollo. In primo luogo, preparare aliquote purificate di campioni di DNA genomico che sono stati sottoposti a un MSP un digestato enzimatico di restrizione, una reazione di riparazione dell'estremità smussata e un'aggiunta di un singolo nucleotide alle tre estremità prime. A questo punto, i prodotti del DNA saranno pronti per le legature dell'adattatore per iniziare a trasferire 10 microlitri del campione A-A-L-D-N-A in una provetta PCR da 0,2 millilitri e posizionare la provetta sul ghiaccio.

Inoltre, posizionare un'aliquota delle molecole adattatrici sul ghiaccio. Quindi, preparare la miscela di reagenti di legatura con ghiaccio. Aggiungere sia il reagente di legatura che le molecole di adattamento al campione di DNA e pipettare su e giù alcune volte per mescolare.

Posizionare una provetta per PCR in un termociclatore e lasciare che la reazione di legatura proceda durante la notte a 16 gradi Celsius del giorno successivo. Purificare i prodotti della legatura utilizzando un kit di estrazione del DNA in fase solida basato su perle magnetiche o colonna di silice. Nell'ultima fase del processo di purificazione.

Eluire il DNA aggiungendo 30 microlitri di acqua libera dal DNA. Il prodotto del DNA purificato può essere conservato a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a quando non è necessario per i campioni, che hanno iniziato con il DNA totale di 25 nanogrammi o superiore. Utilizzare un apparato automatizzato per l'estrazione del gel come il PI e il prep per selezionare prodotti legati con lunghezze comprese tra 150 paia di basi e 400 paia di basi.

Assicurati di escludere i coloranti per la visualizzazione del DNA come il bromuro di Ethereum o il verde cibernetico dalla cassetta agros perché possono alterare le proprietà di migrazione del DNA dei frammenti legati all'adattatore biforcuto. Per questa fase del protocollo è possibile utilizzare anche i protocolli standard di selezione delle dimensioni a base di gel agros per impostare l'elettroforesi del DNA su una cassetta aros senza colorante al 2%. Creare un nuovo protocollo nella console Pippin Prep e selezionare l'opzione 2%DF marker L come cassetta desiderata.

Quindi abilitare l'opzione Usa standard interni e verificare che il numero di corsia di riferimento corrisponda ai numeri di corsia per l'isolamento di frammenti di DNA che vanno da 150 coppie di basi e 400 coppie di basi. Seleziona l'opzione range come modalità di raccolta e inserisci i seguenti parametri limite: 135 per l'inizio della coppia di base, 410 per l'inizio della coppia di basi e 240 per le zampe della coppia di basi. Questo indica all'apparecchio di allineare il campo elettroforetico alla porta di uscita dell'elettroeluizione.

Quando i frammenti di DNA all'interno di quell'intervallo viaggiano vicino alle vicinanze dello sbocco. Dopo aver salvato il file di protocollo, preparare la cassetta del gel e i pozzetti di caricamento del campione dello strumento seguendo le procedure operative standard di Pippen Prep al momento della configurazione dello strumento. Preparare i campioni di DNA per l'elettroforesi aggiungendo 10 microlitri del marcatore di DNA a un'aliquota di 30 microlitri di un dato campione post-legatura per caricare le miscele sulla cassetta del gel.

Innanzitutto, rimuovere 40 microlitri di tampone per elettroforesi da ciascun campione. Sostituire quindi il volume pipettando ogni miscela di marcatori campione da 40 microlitri in singoli pozzetti. Tornando alla console, caricare il protocollo salvato e premere start per iniziare l'elettroforesi.

Quando il programma raggiunge la coppia di 240 basi, la fase di pausa raccoglie manualmente 40 microlitri di ouit da ciascuna porta di uscita con una pipetta. Etichettare queste frazioni come frazione di libreria inferiore. Dopo aver raccolto le frazioni inferiori della libreria, lavare immediatamente le porte di uscita aggiungendo 40 microlitri di tampone per elettroforesi fresco.

Pipettare il tampone su e giù almeno tre volte, quindi aspirare la snet. Ripetere questo lavaggio altre due volte per rimuovere tutte le tracce di specie di DNA di breve lunghezza dagli uscite. Ora aggiungere 40 microlitri di tampone per elettroforesi al campione.

Sigillare bene le porte eluciane e premere il pulsante di esecuzione per riprendere il processo eluciano. Al termine del programma Ellucian con l'impostazione di 410 coppie di basi, raccogli i 40 microlitri di Inuit da tutte le porte di uscita ed etichetta queste frazioni come frazione superiore della libreria. A questo punto, entrambe le frazioni di libreria sono purificate in gel e già per la conversione del bisolfito.

Utilizzando un kit disponibile in commercio, eseguire il saggio di conversione del bisolfito su entrambe le frazioni della libreria. Nella fase finale del processo di conversione, eluire i campioni di DNA in 40 microlitri di acqua priva di DNA. Dopo la conversione del bisolfito, i frammenti della libreria di DNA risultanti saranno sottoposti a un'amplificazione PCR di arricchimento utilizzando primer che ibridano alle estremità dell'adattatore di ciascuna molecola di DNA.

Per preparare prima la PCR di arricchimento, aggiungere 160 microlitri della miscela master PCR a ogni aliquota di 40 microlitri di un campione convertito da solfuro. Quindi dividere la miscela risultante da 200 microlitri in quattro aliquote da 50 microlitri. In provette PCR separate.

Posizionare le provette in un termociclatore e amplificare il modello di DNA convertito. Dopo l'arricchimento, estrarre i quattro prodotti post PCR in un'unica provetta da 1,5 millilitri e purificare il DNA con un kit di pulizia PCR commerciale. Se si utilizza un kit di estrazione in fase solida con biglie magnetiche per purificare i prodotti PCR, modificare le procedure operative standard mescolando prima i prodotti PCR combinati della libreria inferiore con 1,7 volte il loro volume totale in microsfere.

Quindi mescolare i prodotti PCR combinati della libreria superiore con 1,1 volte il loro volume totale in perline. Quindi seguire il protocollo del produttore fino alle fasi di lavaggio con etanolo al 70%, in cui ciascuno dei volumi di lavaggio deve essere modificato a 800 microlitri nell'ultima fase del processo di purificazione. Eluire il DNA con 50 microlitri di tampone di eluizione privo di DNA.

Conservare le librerie purificate a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a quando non sono necessarie, utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza selettivo per il DNA a doppio filamento, quantificare la quantità di contenuto di DNA post-arricchimento per ciascuna frazione di libreria. Inoltre, valutare le dimensioni e la qualità della libreria di post-arricchimento con un bioanalizzatore. Calcola la molarità efficace del DNA di una particolare frazione di libreria utilizzando la lunghezza media del DNA espressa in coppie di basi.

Una volta nota la molarità, utilizzare l'acqua libera del DNA per diluire ogni frazione di libreria superiore e inferiore corrispondente fino a due concentrazioni finali nanomolari. Combina le coppie di librerie inferiore e superiore in un'unica provetta per creare una miscela di librerie di due fori nanomolari da 20 microlitri ciascuna. Il campione in pool è ora pronto per l'esecuzione del sequenziamento.

Nei saggi correlati al sequenziamento, tra cui E-R-R-B-S, la qualità e la distribuzione dimensionale delle molecole della libreria superiore e inferiore sono fattori chiave nel determinare la qualità dei dati di sequenziamento finali. Rispetto ai tradizionali protocolli di estrazione manuale dei gel, l'apparato automatizzato di estrazione dei gel utilizzato nel protocollo E-R-R-B-S produrrà una distribuzione dimensionale coerente e ridurrà al minimo il potenziale di contaminazione incrociata dei campioni. Successivamente, dopo l'invio delle molecole di libreria convertite in solfito BIS per il sequenziamento, i dati grezzi di tutti i filamenti di DNA mostrano che per ogni dato filamento, la qualità dei dati per ogni posizione nucleotidica aumenta notevolmente subito dopo i primi tre nucleotidi.

Poiché la sequenza consenso per questi tre nucleotidi si è unita a CGG per la stragrande maggioranza delle molecole della libreria, i dati suggeriscono che il protocollo E-R-R-B-S ha prodotto una collezione di librerie che contiene un insieme desiderabile di frammenti genomici che sono prevalentemente affiancati. Con MSP un digest di restrizione termina da un punto di vista a volo d'uccello. Il protocollo E-R-R-B-S può fornire dati di risoluzione delle coppie di basi dei siti di metilazione della citidina nell'intero genoma.

Ad esempio, il cromosoma 12 è mostrato qui. Il protocollo copre una rappresentazione ridotta dei CPG a livello di genoma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le librerie E-R-R-B-S per la generazione di dati di metilazione D-N-A-C-P-G con risoluzione di base Una volta padroneggiati, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare con DNA di alta qualità, includere tutti i passaggi descritti, convalidare l'efficienza della conversione del bisolfato e sequenziare utilizzando i parametri raccomandati. Non dimenticare che lavorare con fenile e cloroformio può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre le precauzioni più comuni, come lavorare in una cappa chimica e smaltire correttamente i rifiuti.

Seguendo questa procedura. Altri metodi, come il sequenziamento degli spyro o l'epitipo di matrice di massa, possono essere eseguiti per convalidare i risultati. Inoltre, il profilo di espressione genica può essere eseguito per determinare il significato biologico dei modelli di metilazione del DNA rilevati.

La capacità di generare DNA con risoluzione di coppie di basi e modelli di metilazione da quantità limitate di materiali in input ha permesso la profilazione di popolazioni cellulari rare mai prima possibile. Ha anche reso possibile la profilazione di ampie coorti di campioni clinici per l'esplorazione della regolazione epigenetica mediata e dell'eterogeneità della malattia.