Name: ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Scopri il sequenziamento bisolfito a rappresentazione ridotta potenziato per l'analisi della metilazione del DNA a risoluzione di coppia di basi. Questo metodo combina digestione enzimatica e conversione bisolfitica per generare dati epigenetici ad alta copertura con quantità minime di materiale di partenza.

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Ringraziamo tutti gli autori del rapporto ERRBS originale. Si ringrazia Mame Fall per l'assistenza tecnica. Ringraziamo il Weill Cornell Medical College Epigenomics Core per i servizi tecnici e l'assistenza. Il lavoro è stato sostenuto da una Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, da un K08CA169055 NCI e da ASH-AMFDP12005 a FGB, NIH R01HG006798 e R01NS076465, da finanziamenti da Irma T. Hirschl e Monique Weill-Caulier Charitable Trusts e STARR Consortium (I7-A765) a CEM, e da una sovvenzione LLS SCORE (7006-13) a AMM.

Tutte le procedure eseguite sono approvati dalla Scuola di Medicina Istituzionale Animal Care and Use Committee Indiana University e seguono Istituto Nazionale di linee guida di salute. 1. Tecnica chirurgica <ol><li> Mantenere una tecnica asettica durante questa procedura utilizzando guanti sterili, strumenti, e un campo chirurgico sterile, secondo le linee guida NIH 25. Sterilizzare gli strumenti prima di iniziare l&#39;intervento chirurgico da loro autoclave (vedi Tabella di reagenti specifici / Attrezzature per l&#39;elenco completo). Utilizzare uno sterilizzatore perle di vetro per sterilizzare strumenti durante l&#39;operazione. </li></ol> 2. Anestesia e preparazione <ol><li> Anestetizzare il mouse in una scatola anestesia con una miscela di 0,9 L / min ossigeno e 2,5% isoflurano utilizzando un sistema vaporizzatore isoflurano veterinaria. Assicurarsi che il mouse non risponde ai cambiamenti di posizione del corpo prima di rimuoverlo dalla scatola. </li><li> Applicare una pomata oftalmica al mouGli occhi di SE per proteggerli dalla disidratazione. </li><li> Passare il flusso di gas dalla casella a cono. Posizionare il mouse esattamente sul lato sinistro su un tappetino riscaldato coperto da un tappetino chirurgica e carta assorbente con panca il naso e la bocca all&#39;interno del cono. Monitorare costantemente il ritmo del respiro del mouse e la velocità e regolare i livelli isoflurano come necessario (tra 2,5-3% isoflurano) per mantenere un adeguato livello di anestesia, e utilizzare la punta pizzico reflex per confermare sedazione totale. </li></ol> 3. Approccio chirurgico <ol><li> Allineare e mettere a fuoco lo stereoscopio con il campo operatorio. Regolare il cono e il nastro verso il basso in modo che sia posizionato lungo il bordo del campo visivo. </li><li> Con il mouse sdraiato sul suo lato sinistro, il nastro il bordo dell&#39;orecchio destro al cono, esponendo l&#39;area dietro l&#39;orecchio in cui verrà effettuata l&#39;incisione. Assicurarsi che la vena auricolare posteriore percorre orizzontalmente l&#39;orecchio. Si noti che il corretto posizionamento di tegli animali e taping dell&#39;orecchio sono fondamentali al fine di trovare rapidamente il nervo facciale. </li><li> Bagnare il pelo sopra e dietro l&#39;orecchio con il 70% di etanolo e radere il sito chirurgico con una lama di rasoio o bisturi. Pre-bagnare il pelo rende la rasatura più facile in questa posizione anatomica. </li><li> Pulire la pelle con una soluzione di iodio, come Betadine lavaggio chirurgico (7,5% povidone-iodio), seguito da 70% di etanolo. Ripetere questa pulizia due volte di più per disinfettare accuratamente la zona. </li><li> Per determinare dove fare l&#39;incisione, tracciare la vena auricolare posteriore dall&#39;orecchio caudalmente alla zona posteriore alla protuberanza orecchio. Utilizzando forbici primavera, fare un 4 millimetri un&#39;incisione 2 - 3 mm posteriormente alla protuberanza. </li><li> Sezionare attraverso il grasso sottocutaneo e la fascia con smussa. Evitare il taglio diretto con le forbici, perché i vasi sanguigni o tessuto muscolare possono essere facilmente danneggiati. </li><li> In caso di emorragia, applicare pressione al sito chirurgico con un tampone di cotone sterileper almeno 30 secondi. Se si verifica una significativa perdita di fluido, iniettare il mouse per via intraperitoneale con fino a 0,5 ml di soluzione salina sterile allo 0,9% utilizzando un ago G 25 o 27. </li><li> Utilizzare diversi punti di riferimento chiave, il nervo accessorio spinale, canale uditivo, e anteriore del muscolo digastrico (descritto di seguito), per individuare il nervo facciale. Sezionare intorno a questi punti di riferimento fino a quando sono visualizzati i rami del nervo facciale. Il nervo apparirà come una significativa struttura di solido bianco quando viene rivelato e uno strato di fascia aderisce agli strutture sottostanti. <ol><li> Trova il nervo accessorio spinale, che viaggia dalla porzione caudale del cranio per innervare il muscolo trapezio, una volta che il grasso sottocutaneo e la fascia sono stati sezionati. Il nervo facciale è profondo al nervo accessorio spinale. </li><li> Trovare il canale uditivo cartilagineo che sembra bianco perlato e può essere visto rostrale al nervo facciale. </li><li> Trova il ventre muscolare del muscolo digastrico anteriore, che si trova in cima e caudal al nervo facciale. </li></ol></li><li> Quando i principali rami del nervo facciale sono visualizzati, li risalire dorsale di trovare la loro origine dal forame stylomastoid. Utilizzando punta fine Dumont pinze # 5/45 di tenere il sito chirurgico aperto, far avanzare le punte primavera forbice seguito il percorso del nervo, quindi spostare la pinza dorsale per mantenere la nuova area Advanced Open. </li><li> Visualizza il tronco del nervo facciale con zigomatico, buccale, e rami mandibolari marginali a questo punto. NOTA: Il ramo temporale si troverà più vicino al forame. I rami marginali nervo mandibolare nelle sue parti superiore e inferiore più vicino alla mascella, pertanto quei rami nervose non saranno visibili a questo livello. <ol><li> Se si esegue una resezione del nervo, di stabilizzare il nervo delicatamente con le pinze punta fine e tagliare il nervo con le forbici a molla. Evitare di applicare troppa trazione al nervo con le pinze per evitare avulsing nervo dal tronco encefalico. Spingerei monconi distanti, o tagliare e rimuovere una porzione del nervo distale per garantire che nessun riconnessione può verificarsi. </li><li> Se si esegue una lesione da schiacciamento, utilizzare Dumont # 5/45 pinze per comprimere il nervo per 30 secondi con una pressione costante a recidere tutti gli assoni, quindi ripetere questa cotta in un secondo angolo perpendicolare al primo sito cotta. Evitare l&#39;applicazione di quantità variabili di pressione durante la 30 sec cotta, altrimenti il ​​danno non sarà coerente tra gli animali. </li></ol></li></ol> 4. Chiusura e recupero <ol><li> Riposizionare il grasso e muscoli sopra le strutture sottostanti. </li><li> Approssima i bordi dell&#39;incisione e chiudere la ferita utilizzando un clip ferita 7,5 millimetri. Suture o colla sono accettabili per la chiusura della ferita. Analgesici postoperatoria possono essere forniti in questo momento. </li><li> Rimuovere il nastro dal orecchio del mouse. Spegnere il flusso isoflurano e lasciare il mouse per respirare ossigeno puro per 30 secondi a 1 minuto. Plasso il mouse in una gabbia vuota senza biancheria da letto per recuperare da anestesia. </li><li> Quando il mouse è recuperato, esaminare il suo comportamento per i segni di conferma della paralisi facciale. I baffi saranno paralizzati e angolati verso la guancia, il naso viene deviato, e l&#39;occhio non lampeggia in risposta ad un soffio d&#39;aria. </li><li> Animali Casa congiuntamente dopo l&#39;intervento chirurgico se sono di sesso femminile. Evitare ospitano topi maschi congiuntamente perché sono più aggressivi e tendono a rimuovere forzatamente clip ferita del loro cagemate, che porta a infezioni. Fornire analgesici postchirurgiche in questo momento, se necessario. </li><li> Monitorare i topi una volta al giorno per diversi giorni dopo l&#39;operazione per assicurarsi che nessuna infezione o altre complicanze si verifica dopo l&#39;intervento. Rimuovere clip ferita 7 - 10 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico, se non sono caduti fuori da sè. </li><li> Applicare lubrificante pomata occhio l&#39;occhio interessato al giorno per prevenire le complicanze corneali, sia fino a quando il riflesso corneale occhio è recoperti o fino eutanasia. </li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

I dati di risoluzione rendimenti base-pair protocollo presentato di citosina metilazione a biologicamente rilevanti regioni genomiche. Il protocollo come scritto è ottimizzato per 50 ng di materiale di partenza, tuttavia, può essere adattato per gestire una gamma di materiali di ingresso (5 ng o più) 26. Ciò richiederà aggiustamenti di alcuni dei passaggi del protocollo, come visto nella tabella 6. Le librerie ERRBS sono suscettibili di sequenziamento fine associato e ulteriormente la copertura genomica può anche essere realizzato mediante sequenziamento legge più di 51 cicli. Sequenziamento Multiplexed offrirà un protocollo minor costo per campione, tuttavia, questo comporta copertura ridotta per sito CpG rappresentato nei dati (Figura 5 e la Tabella 8), e non produrrà sufficiente profondità di copertura effettuare analisi che richiedono elevata copertura per sito CpG (ad esempio come descritto da Landan et al. 33). Infine, questo protocollo (o qualsiasi protoco basata bisolfito-l) non può distinguere tra metil-citosina e idrossimetil-citosina 46,47. Tuttavia, i dati generati può essere integrato con altri protocollo risultati 48,49 per delineare le diverse modifiche, e altre modifiche citosina recentemente riportato 50, dovrebbero essere di interesse. Appariranno librerie di alta qualità come mostrato nella figura 3A-C, e una volta aggregate per sequenziamento produce una traccia, come mostrato nella figura 3G (traccia rossa) rappresenta contributi molari uguali da due frazioni di libreria. Insufficienza preparazione Libreria può derivare da qualsiasi punto durante la procedura. Se il DNA degradato viene elaborato il risultato sarà in librerie che non sono arricchiti in frammenti MspI e quindi nella copertura bassa CpG utilizzando i parametri di sequenziamento descritti in questo protocollo. Se un enzima è non funzionale o inavvertitamente esclusi da una delle reazioni, il protocollo non produrrà la libreria previsto. Se la rea ​​legaturaction è inefficiente, adattatori sono ad una maggiore concentrazione del previsto, e / o la concentrazione di primer utilizzato è un reagente limitante per le fasi finali di amplificazione, può verificarsi insufficienza libreria. Adattatori in eccesso (visto come un picchi a ~ 150 bp a risultati Bioanalyzer, Figura 3D-F) nella libreria sarà anche interferire con il sequenziamento causa del raggruppamento indiscriminata sia della biblioteca e gli adattatori in eccesso. Mentre una tale libreria può sequenziare apparentemente normalmente, una parte significativa della legge sarà sequenze semplicemente adattatore. Se gli adattatori in eccesso si osservano in una libreria, è meglio ripetere la preparazione biblioteca se il materiale è disponibile usando il materiale in ingresso ottimale all&#39;adattatore rapporti quantitativi. Infine, per garantire efficienza di amplificazione PCR delle librerie, le frazioni biblioteca inferiori e superiori sono mantenuti come campioni separati per tutta la conversione bisolfito e fasi di arricchimento PCR. In caso contrario si produce efficienza differenziale dell&#39;amplificazione durante la PCR reazione di frazioni superiori e inferiori (come si vede nella Figura 3G traccia blu) e il potenziale per la rappresentazione disuguale dei rispettivi loci genomici coperto in ogni frazione libreria durante sequenziamento. L&#39;utente può scegliere di includere una PCR quantitativa passo immediatamente dopo la conversione bisolfito per ulteriore titolazione di cicli PCR ottimali necessari per amplificare le librerie generati. ERRBS protocollo di preparazione biblioteca ha diversi passaggi chiave in cui sono raccomandati reagenti specifici. Nella fase finale di riparazione, l&#39;uso di una miscela dNTP quattro nucleotidi consente end-riparazione di qualsiasi prodotto che non contengono la sporgenza CG, come quelli derivanti da attività enzimatica MspI stella e frammenti di DNA tranciate presenti nel campione di DNA originale. Ciò si traduce in una migliore rappresentazione CpG nei risultati. Al passo legatura è fondamentale utilizzare una ligasi alta concentrazione (2.000.000 unità / ml) e adattatori metilati per garantire che il riatti legaturaon è efficiente e che la conversione bisolfito non influenza le sequenze essenziali per l&#39;allineamento dei dati accurati adattatore. Nella fase PCR, utilizzando una polimerasi grado di amplificare ricchi GC frammenti di DNA bisolfito trattati è necessaria per alta specificità. Infine, per garantire l&#39;eliminazione di adattatori eccesso e primer, SPRI purificazione tallone (per esempio: Agencourt AMPure XP) è consigliato anziché test basati colonna per legatura ed isolamenti prodotto PCR. Al fine di generare dati di alta qualità, è importante assicurare la conversione bisolfito efficiente. Il controllo ha presentato offre all&#39;utente la possibilità di determinare l&#39;efficienza di conversione prima di sequenziamento. In alternativa, un DNA non umano come DNA lambda può essere utilizzato come controllo interno (picco-in). A causa delle differenze nelle specie, questo tipo di controllo può essere direttamente incluso nella sequenza a valle (es usati per Yu et al. 34). Tuttavia, se l&#39;i-picco ins utilizzato, non può essere utilizzato per determinare l&#39;efficienza di conversione prima sequenziamento libreria a meno amplificato modo separato ed indipendente sequenziato prima sequenziamento libreria. I tassi di conversione determinati sono basate sullo stato di metilazione in siti non-CpG. Questo può non essere adatto per l&#39;uso nel contesto di alta metilazione citosina in non-CpG contesto (ad esempio cellule staminali embrionali) e campioni paralleli o altri mezzi per valutare l&#39;efficienza di conversione può essere utilizzato per questo scopo. Ci sono alcune avvertenze da affrontare che sono unici per il sequenziamento del biblioteche ERRBS. I primi tre basi delle frazioni di libreria sequenziate sono quasi uniformemente non casuale dovuta al sito di riconoscimento MspI taglio (C ^ CGG; vedi Figura 4B, C). Il risultato è la possibilità di una significativa perdita di dati a causa di bassa qualità derivanti da letture di localizzazione grappolo scarsa nonostante apparente ad alta densità di cluster durante la sequenza. Per superare questo ostacolo,includere una libreria di complessità in una corsia indipendente (controllo Phix o altro tipo di biblioteca) come una corsia di controllo dedicato. Biblioteche elevata complessità hanno estremità che contengono una rappresentanza equilibrata di A, C, T e G nelle prime quattro basi in sequenza. Corsie di controllo adatti comprendono biblioteche, come RNA-Seq, ChIP-seq, sequenziamento dell&#39;intero genoma, o un controllo offerto dal costruttore della macchina sequenza (ad esempio Phix controllo v3). Quando designato come una corsia di controllo del rispettivo corsa sequenziamento, può servire come base per la generazione della matrice che viene utilizzata durante i primi quattro basi di sequenziamento per rilevare posizioni cluster. La qualità superiore si legge catturato aumenterà la copertura media per sito CpG 5,2 (n = 4). In alternativa, questa difficoltà tecnica può anche essere superato utilizzando un approccio di sequenziamento scuro come descritto in precedenza 23. Altri criteri di sequenziamento seguire le procedure operative standard per i protocolli del produttore. Infine, la copertura per CpG chosen per l&#39;analisi dei dati sarà guidato dall&#39;utente e in parte dalle domande biologiche di interesse. 10x soglia di copertura offre un approccio di analisi ad alta copertura, ma questa soglia può essere abbassata che dovrebbe essere di interesse. Una discussione completa di analisi dei dati ERRBS è oltre la portata di questo articolo, tuttavia, differenziale cytosines e regioni denaturato possono essere determinate utilizzando strumenti open source 31,51-53. Considerazioni ulteriori analisi e approcci sono stati ben descritto 54,55, e il lettore è incoraggiato a cercare letteratura per strumenti più adeguati per l&#39;analisi pianificata. Rispetto ad altri metodi pubblicati, ERRBS offre un protocollo di quattro giorni che, quando eseguita come descritto rendimenti elevati tassi di riproducibilità. E &#39;stato convalidato rispetto al gold standard di MassARRAY EpiTYPER 26, è conveniente per i dati di copertura alte, ed è adattabile per vari materiale in entrataimporti (favorevoli per l&#39;elaborazione del campione clinico e altri tipi di cellule a bassa frequenza) e approcci di sequenziamento. Offre risoluzione di base-pair a loci biologicamente rilevanti e può essere utilizzato in integrativo analisi con altre tecniche di profilazione genome-wide fattore di trascrizione vincolante, il rimodellamento della cromatina, segni epigenetici e altre modifiche citosina di interesse. ERRBS uso dei dati in tali studi possono contribuire ad un approccio molecolare completa e consentire per alta dimensionale analisi nello studio dei modelli biologici e le malattie umane.

La metilazione del DNA a citosina (5-metilcitosina) è un marchio epigenetico critica in cellule di mammifero per una varietà di processi biologici, compreso ma non limitato a imprinting, inattivazione del cromosoma X, lo sviluppo, e la regolazione dell&#39;espressione genica 1-8. Lo studio della metilazione del DNA in maligne e altri disturbi ha determinato malattie modelli specifici e contribuito alla comprensione della patogenesi della malattia e potenziali scoperte biomarker 9-17. Ci sono molti protocolli che interrogano dell&#39;epigenoma per lo stato di metilazione del DNA. Questi possono essere suddivisi in base affinità, enzima di restrizione-based, e saggi basati conversione-bisolfito che utilizzano le piattaforme di microarray o sequenziamento valle. Inoltre, ci sono alcuni protocolli che colmano queste categorie generali compresi, ma non limitatamente a, combinato bisolfito Restriction Analysis 18 e ridotto Rappresentanza bisolfito Sequencing (RRBs 19). </p&gt; RRBs stato originariamente descritto da Meissner et al. 19,20. Il protocollo ha introdotto un passo per arricchire regioni genomiche ricche di GC seguiti da sequenziamento bisolfito, che ha portato i dati risoluzione di base-pair quantitativo, che è economicamente vantaggioso 21,22. Le regioni ricche di GC sono mirati dal MspI (C ^ CGG) enzima di restrizione, e citosina metilazione si risolve con la conversione bisolfito di cytosines (deamination di cytosines modificati a uracile), seguita dalla reazione a catena della polimerasi (PCR). RRBs coperto la maggioranza dei promotori genici e isole CpG in una frazione del sequenziamento richiesto per un intero genoma; tuttavia RRBs avevano copertura limitata delle coste CPG e altre regioni intergeniche di rilevanza biologica. Diversi gruppi hanno pubblicato aggiornati protocolli RRBs rispetto alla relazione originale che migliorano la metodologia e la copertura risultante di queste regioni genomiche 23-25. Maggiore rappresentanza ridotta Bisulfite Sequscere (ERRBS) include modifiche preparazione di libreria e di un allineamento di dati alternativo approccio 26 quando rispetto al RRBs. ERRBS provocato un maggior numero di CPGs rappresentata nei dati generati e aumentato la copertura di tutte le regioni genomiche interrogato 26. Questo metodo è stato utilizzato per risolvere schemi di metilazione del DNA in paziente umano e altri esemplari di animali 26-30. Il protocollo ERRBS descritto particolari offerte su tutti i passi necessari per il completamento e dati sono stati generati utilizzando rappresentante DNA umano (i campioni sono stati ottenuti da precedentemente riportati, i campioni dei pazienti de-identificati 31, e CD34 + midollo osseo da un campione normale donatore umano). Il protocollo comprende una procedura automatica di selezione del formato, che riduce il tempo di elaborazione per campione e consente una maggiore precisione nella selezione della libreria dimensioni. Il protocollo combina una serie di tecniche di biologia molecolare stabiliti. Alto peso molecolare DNA viene digerito won una metilazione-insensitive enzima di restrizione (MspI) seguita da fine-riparazione, A-tailing, e legatura di adattatori denaturato. Dimensione selezione dei frammenti ricchi di GC è seguita da conversione bisolfito e PCR di amplificazione prima sequenziamento. Conversione bisolfito è stato descritto in precedenza 32 e dettagliata revisione di analisi e applicazioni dati è oltre la portata di questo articolo, tuttavia consigli e riferimenti sono inclusi per l&#39;uso dei lettori. Il protocollo può essere eseguita in quattro giorni ed è suscettibile di piccolo ingresso (50 ng o meno) importi rilevanti. Il protocollo, come descritto produce dati con elevata copertura per sito CpG sufficiente non solo per differenziali sito metilazione e regione determinazioni, ma anche per il rilevamento del polimorfismo epigenetico come descritto da Landan, et al. 33.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100.000 unità/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S Tampone</td><td>di reazione per l'enzima MspI; fase del protocollo 1.2</td></tr><tr><td>Soluzione fenolica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Equilibrato con 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0; vedere le istruzioni di sicurezza e manipolazione su http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Vedere le istruzioni di sicurezza e manipolazione su http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Tampone EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5</td></tr><tr><td>tris(idrossimetil)amminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>preparare una soluzione da 1 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Acido tris-etilendiamminotetraacetico (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Diluire in 1x soluzione tampone secondo le raccomandazioni</td></tr> <tr><td>del produttoreTampone di reazione DNA ligasi T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>Concentrazione 10x</td></tr><tr><td>Miscela di soluzioni di deossinucleotide trifosfato (dNTP) New</td><td>England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM per nucleotide</td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3.000 unità/ml</td></tr><tr><td>DNA polimerasi I, frammento grande (Klenow)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5.000 unità/ml</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10.000 unità/ml</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Utilizzato per la purificazione del prodotto DNA nella fase del protocollo 2.3</td></tr><tr><td>2'-deossiadenosina 5'-trifosfato (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Frammento di Klenow (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5.000 unità/ml</td></tr><tr><td>Kit di purificazione MinElute PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilizzato per la purificazione del prodotto DNA nella fase del protocollo 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2.000.000 unità/ml</td></tr><tr><td>Adattatore di metilazione Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Utilizzato nelle sezioni di protocollo che implementano passaggi di purificazione con biglie magnetiche (passaggi 4.3 e 8.2). Equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Cassette Pippin Prep Gel, 2% agarosio, senza coloranti</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>con standard interni</td></tr><tr><td>Certificato Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borato-EDTA (TBE) tampone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caricamento Colorante, Arancione (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi&nbsp; Lama&nbsp; No. 11</td><td>Fisher Scientific 3120030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit di metilazione del DNA EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Utilizzato nel protocollo passo 6.2</td></tr><tr><td>Kit di metilazione-fulmine del DNA EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternativa al passaggio 6.2</td></tr><tr><td>Standard universale del DNA umano metilato Zymo</td><td>Research</td><td>D5011</td><td>Utilizzato come controllo della conversione del bisolfito</td></tr><tr><td>Sistema PCR ad alta fedeltà</td><td>FastStart Kit</td><td>di</td> saggi ad alta sensibilità Roche 03553426001 <td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Life</td><td>Technologies</td><td>Q32854</td><td>Un test di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza; utilizzato nelle fasi del protocollo 1.1, 9.1 e 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td> Kit DNA ad alta sensibilità <td>12321D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Kit cluster TruSeq SR v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>Kit TruSeq SBS v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Preparazione del campione</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Adattatori con codice a barre utilizzati per librerie multiplexing; Vedere File supplementare per il protocollo di multiplexing.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Block Heater</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentazione</td><td></td><td></td><td></td>elettroforesi</tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Transilluminatore <td></td><td></td><td></td><td>UV o a luce blu</td></tr></tbody></table>

enhanced ridotto rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del dna in risoluzione coppia di basi

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA metilazione mapping è fortemente studiato in tessuti normali e patologici. Una varietà di metodi sono stati stabiliti per interrogare i modelli citosina metilazione nelle cellule. Rappresentazione ridotta di sequenziamento dell&#39;intero genoma bisolfito è stato sviluppato per individuare coppie di basi modelli risoluzione citosina metilazione quantitativi a ricchi di GC loci genomici. Questo si ottiene combinando l&#39;uso di un enzima di restrizione seguita da conversione bisolfito. Maggiore ridotto Rappresentanza bisolfito Sequencing (ERRBS) aumenta la loci genomici biologicamente rilevanti coperti ed è stato usato per profilare citosina metilazione del DNA da umano, mouse e altri organismi. ERRBS inizia con enzimi di restrizione del DNA per generare frammenti a basso peso molecolare per la redazione biblioteca. Questi frammenti sono sottoposti alla costruzione della libreria standard per la prossima generazione di sequenziamento. Conversione bisolfito di cytosines non metilato prima della amplificati finalesul gradino permette per la risoluzione di base quantitativa dei livelli di metilazione citosina in coperta loci genomici. Il protocollo può essere completata nel giro di quattro giorni. Nonostante bassa complessità nei primi tre basi in sequenza, le biblioteche ERRBS producono dati di alta qualità quando si utilizza una corsia di controllo sequenza designato. Mappatura e bioinformatica analisi viene quindi eseguita e dati produce che può essere facilmente integrato con una varietà di piattaforme genoma. ERRBS può utilizzare piccole quantità di materiale in entrata rendendo così possibile elaborare campioni clinici umani e applicabile in una vasta gamma di applicazioni di ricerca. Il video prodotto dimostra passaggi critici del protocollo ERRBS.

Il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta potenziata è un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento per l'analisi della metilazione del DNA basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la conversione del bisolfito di citosina. Questo protocollo richiede 50 ng di materiale di partenza e produce dati di risoluzione delle coppie di basi in regioni genomiche ricche di GC.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare librerie di sequenziamento per la risoluzione di coppie di basi D-N-A-C-P-G, analisi di metilazione basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la citosina mediante conversione del solfito. Ciò si ottiene eseguendo prima il digest dell'enzima di restrizione MSP one di DNA di alta qualità, seguito dalla riparazione finale, dalla coda e dalla legatura degli adattatori metilati. Il passo successivo consiste nell'eseguire la conversione del solfito su frammenti selezionati di dimensioni successive alla conversione del solfito.I frammenti vengono amplificati mediante PCR. La fase finale consiste nell'esecuzione del controllo qualità e del sequenziamento, seguiti dalla visualizzazione e dall'analisi dei dati. In definitiva, una rappresentazione ridotta migliorata del sequenziamento del bisolfito rileva la risoluzione quantitativa delle coppie di basi dei pattern di metilazione della citidina in loci genomici ricchi di CG.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi di metilazione del DNA, come i microarray, è che può utilizzare piccole quantità di materiale in ingresso per generare dati di metilazione D-N-A-C-P-G ad alta copertura con risoluzione di coppie di basi e siti biologicamente rilevanti. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando eravamo interessati a esplorare i modelli epigenetici al di là delle regioni coperte dai saggi tradizionali. Eravamo interessati a sviluppare questa tecnica per passare dai microarray alla generazione di dati di metilazione del DNA con risoluzione di coppie di basi che potrebbero essere integrati con i dati generati da altre tecniche di prossima generazione.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica. Ad esempio, il pattern epigenetico e l'eterogeneità nei campioni biologici rispetto ai normali controlli o ad altri stati patologici. In generale, le persone che non conoscono questo metodo lo troveranno difficile a causa della lunghezza della procedura, dei numerosi requisiti specifici e delle caratteristiche di sequenziamento uniche delle librerie generate Mamie Fall.Uno specialista di ricerca nel nostro laboratorio assisterà nella dimostrazione della procedura per iniziare questo protocollo. In primo luogo, preparare aliquote purificate di campioni di DNA genomico che sono stati sottoposti a un MSP un digestato enzimatico di restrizione, una reazione di riparazione dell'estremità smussata e un'aggiunta di un singolo nucleotide alle tre estremità prime. A questo punto, i prodotti del DNA saranno pronti per le legature dell'adattatore per iniziare a trasferire 10 microlitri del campione A-A-L-D-N-A in una provetta PCR da 0,2 millilitri e posizionare la provetta sul ghiaccio.Inoltre, posizionare un'aliquota delle molecole adattatrici sul ghiaccio. Quindi, preparare la miscela di reagenti di legatura con ghiaccio. Aggiungere sia il reagente di legatura che le molecole di adattamento al campione di DNA e pipettare su e giù alcune volte per mescolare.Posizionare una provetta per PCR in un termociclatore e lasciare che la reazione di legatura proceda durante la notte a 16 gradi Celsius del giorno successivo. Purificare i prodotti della legatura utilizzando un kit di estrazione del DNA in fase solida basato su perle magnetiche o colonna di silice. Nell'ultima fase del processo di purificazione.Eluire il DNA aggiungendo 30 microlitri di acqua libera dal DNA. Il prodotto del DNA purificato può essere conservato a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a quando non è necessario per i campioni, che hanno iniziato con il DNA totale di 25 nanogrammi o superiore. Utilizzare un apparato automatizzato per l'estrazione del gel come il PI e il prep per selezionare prodotti legati con lunghezze comprese tra 150 paia di basi e 400 paia di basi.Assicurati di escludere i coloranti per la visualizzazione del DNA come il bromuro di Ethereum o il verde cibernetico dalla cassetta agros perché possono alterare le proprietà di migrazione del DNA dei frammenti legati all'adattatore biforcuto. Per questa fase del protocollo è possibile utilizzare anche i protocolli standard di selezione delle dimensioni a base di gel agros per impostare l'elettroforesi del DNA su una cassetta aros senza colorante al 2%. Creare un nuovo protocollo nella console Pippin Prep e selezionare l'opzione 2%DF marker L come cassetta desiderata.Quindi abilitare l'opzione Usa standard interni e verificare che il numero di corsia di riferimento corrisponda ai numeri di corsia per l'isolamento di frammenti di DNA che vanno da 150 coppie di basi e 400 coppie di basi. Seleziona l'opzione range come modalità di raccolta e inserisci i seguenti parametri limite: 135 per l'inizio della coppia di base, 410 per l'inizio della coppia di basi e 240 per le zampe della coppia di basi. Questo indica all'apparecchio di allineare il campo elettroforetico alla porta di uscita dell'elettroeluizione.Quando i frammenti di DNA all'interno di quell'intervallo viaggiano vicino alle vicinanze dello sbocco. Dopo aver salvato il file di protocollo, preparare la cassetta del gel e i pozzetti di caricamento del campione dello strumento seguendo le procedure operative standard di Pippen Prep al momento della configurazione dello strumento. Preparare i campioni di DNA per l'elettroforesi aggiungendo 10 microlitri del marcatore di DNA a un'aliquota di 30 microlitri di un dato campione post-legatura per caricare le miscele sulla cassetta del gel.Innanzitutto, rimuovere 40 microlitri di tampone per elettroforesi da ciascun campione. Sostituire quindi il volume pipettando ogni miscela di marcatori campione da 40 microlitri in singoli pozzetti. Tornando alla console, caricare il protocollo salvato e premere start per iniziare l'elettroforesi.Quando il programma raggiunge la coppia di 240 basi, la fase di pausa raccoglie manualmente 40 microlitri di ouit da ciascuna porta di uscita con una pipetta. Etichettare queste frazioni come frazione di libreria inferiore. Dopo aver raccolto le frazioni inferiori della libreria, lavare immediatamente le porte di uscita aggiungendo 40 microlitri di tampone per elettroforesi fresco.Pipettare il tampone su e giù almeno tre volte, quindi aspirare la snet. Ripetere questo lavaggio altre due volte per rimuovere tutte le tracce di specie di DNA di breve lunghezza dagli uscite. Ora aggiungere 40 microlitri di tampone per elettroforesi al campione.Sigillare bene le porte eluciane e premere il pulsante di esecuzione per riprendere il processo eluciano. Al termine del programma Ellucian con l'impostazione di 410 coppie di basi, raccogli i 40 microlitri di Inuit da tutte le porte di uscita ed etichetta queste frazioni come frazione superiore della libreria. A questo punto, entrambe le frazioni di libreria sono purificate in gel e già per la conversione del bisolfito.Utilizzando un kit disponibile in commercio, eseguire il saggio di conversione del bisolfito su entrambe le frazioni della libreria. Nella fase finale del processo di conversione, eluire i campioni di DNA in 40 microlitri di acqua priva di DNA. Dopo la conversione del bisolfito, i frammenti della libreria di DNA risultanti saranno sottoposti a un'amplificazione PCR di arricchimento utilizzando primer che ibridano alle estremità dell'adattatore di ciascuna molecola di DNA.Per preparare prima la PCR di arricchimento, aggiungere 160 microlitri della miscela master PCR a ogni aliquota di 40 microlitri di un campione convertito da solfuro. Quindi dividere la miscela risultante da 200 microlitri in quattro aliquote da 50 microlitri. In provette PCR separate.Posizionare le provette in un termociclatore e amplificare il modello di DNA convertito. Dopo l'arricchimento, estrarre i quattro prodotti post PCR in un'unica provetta da 1,5 millilitri e purificare il DNA con un kit di pulizia PCR commerciale. Se si utilizza un kit di estrazione in fase solida con biglie magnetiche per purificare i prodotti PCR, modificare le procedure operative standard mescolando prima i prodotti PCR combinati della libreria inferiore con 1,7 volte il loro volume totale in microsfere.Quindi mescolare i prodotti PCR combinati della libreria superiore con 1,1 volte il loro volume totale in perline. Quindi seguire il protocollo del produttore fino alle fasi di lavaggio con etanolo al 70%, in cui ciascuno dei volumi di lavaggio deve essere modificato a 800 microlitri nell'ultima fase del processo di purificazione. Eluire il DNA con 50 microlitri di tampone di eluizione privo di DNA.Conservare le librerie purificate a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a quando non sono necessarie, utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza selettivo per il DNA a doppio filamento, quantificare la quantità di contenuto di DNA post-arricchimento per ciascuna frazione di libreria. Inoltre, valutare le dimensioni e la qualità della libreria di post-arricchimento con un bioanalizzatore. Calcola la molarità efficace del DNA di una particolare frazione di libreria utilizzando la lunghezza media del DNA espressa in coppie di basi.Una volta nota la molarità, utilizzare l'acqua libera del DNA per diluire ogni frazione di libreria superiore e inferiore corrispondente fino a due concentrazioni finali nanomolari. Combina le coppie di librerie inferiore e superiore in un'unica provetta per creare una miscela di librerie di due fori nanomolari da 20 microlitri ciascuna. Il campione in pool è ora pronto per l'esecuzione del sequenziamento.Nei saggi correlati al sequenziamento, tra cui E-R-R-B-S, la qualità e la distribuzione dimensionale delle molecole della libreria superiore e inferiore sono fattori chiave nel determinare la qualità dei dati di sequenziamento finali. Rispetto ai tradizionali protocolli di estrazione manuale dei gel, l'apparato automatizzato di estrazione dei gel utilizzato nel protocollo E-R-R-B-S produrrà una distribuzione dimensionale coerente e ridurrà al minimo il potenziale di contaminazione incrociata dei campioni. Successivamente, dopo l'invio delle molecole di libreria convertite in solfito BIS per il sequenziamento, i dati grezzi di tutti i filamenti di DNA mostrano che per ogni dato filamento, la qualità dei dati per ogni posizione nucleotidica aumenta notevolmente subito dopo i primi tre nucleotidi.Poiché la sequenza consenso per questi tre nucleotidi si è unita a CGG per la stragrande maggioranza delle molecole della libreria, i dati suggeriscono che il protocollo E-R-R-B-S ha prodotto una collezione di librerie che contiene un insieme desiderabile di frammenti genomici che sono prevalentemente affiancati. Con MSP un digest di restrizione termina da un punto di vista a volo d'uccello. Il protocollo E-R-R-B-S può fornire dati di risoluzione delle coppie di basi dei siti di metilazione della citidina nell'intero genoma.Ad esempio, il cromosoma 12 è mostrato qui. Il protocollo copre una rappresentazione ridotta dei CPG a livello di genoma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le librerie E-R-R-B-S per la generazione di dati di metilazione D-N-A-C-P-G con risoluzione di base Una volta padroneggiati, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare con DNA di alta qualità, includere tutti i passaggi descritti, convalidare l'efficienza della conversione del bisolfato e sequenziare utilizzando i parametri raccomandati. Non dimenticare che lavorare con fenile e cloroformio può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre le precauzioni più comuni, come lavorare in una cappa chimica e smaltire correttamente i rifiuti.Seguendo questa procedura. Altri metodi, come il sequenziamento degli spyro o l'epitipo di matrice di massa, possono essere eseguiti per convalidare i risultati. Inoltre, il profilo di espressione genica può essere eseguito per determinare il significato biologico dei modelli di metilazione del DNA rilevati.La capacità di generare DNA con risoluzione di coppie di basi e modelli di metilazione da quantità limitate di materiali in input ha permesso la profilazione di popolazioni cellulari rare mai prima possibile. Ha anche reso possibile la profilazione di ampie coorti di campioni clinici per l'esplorazione della regolazione epigenetica mediata e dell'eterogeneità della malattia.

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