Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la replicazione del DNA a livello di singola molecola. Iniziare incorporando analoghi di nucleotidi alogenati nel DNA appena sintetizzato. In cellule vive, individuare le cellule con DNA marcato su un microscopio.

Far scivolare quindi le cellule e stendere il DNA sul vetrino del microscopio. La successiva immuno-marcazione delle fibre di DNA e l'analisi delle immagini di microscopia fluorescente possono chiarire la dinamica globale delle forcelle di replicazione, permettendo un'analisi quantitativa dei parametri che influenzano il programma complessivo di replicazione. Negli ultimi anni, sono state sviluppate diverse versioni delle tecniche di fluoroscenza su fibre di DNA per visualizzare il movimento delle singole forcelle di replicazione all'interno di cellule vive.

Questo esperimento in vivo in cellule DT 40 che state per osservare può essere completato in un solo giorno e richiede soltanto attrezzature di laboratorio generiche e un microscopio a fluorescenza. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Rebecca Schwab, postdottoranda del mio laboratorio. Per etichettare le cellule DT 40 in vivo, iniziare con una coltura in crescita esponenziale. Aggiungere l'etichetta IDU a una concentrazione finale di 25 micromolare e mescolare la sospensione cellulare.

Incubare bene le cellule per 20 minuti a 38 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, aggiungere l'etichetta CLDU a una concentrazione finale di 250 micromolare. Mescolare e incubare la sospensione cellulare.

Ora lavare le cellule DT 40 con PBS freddo. Sospendere i pellet cellulari in PBS freddo e mantenere le cellule etichettate sul ghiaccio. Depositare due microlitri della sospensione cellulare su un'estremità del vetrino e lasciare asciugare all'aria fino a quando il volume della goccia è notevolmente ridotto, ma non completamente secco.

Ora, aggiungere sette microlitri di soluzione di lisi delle fibre sopra la sospensione cellulare e mescolare delicatamente le soluzioni agitando con la punta di una pipetta; incubare per due minuti. Successivamente, inclinare i vetrini di 15 gradi per permettere alle fibre di disporsi lungo il vetrino. Una volta che la soluzione di fibre ha raggiunto il fondo del vetrino, posizionarlo in orizzontale per farlo asciugare all'aria.

A questo punto, dovrebbe essere visibile una linea sottile e opaca lungo il vetrino. Contrassegnare l'inizio delle fibre allungate con una matita. Immergere prima i vetrini in una soluzione di metanolo e acido acetico in rapporto tre a uno per 10 minuti.

Lavare i vetrini in acqua distillata, quindi immergerli in acido cloridrico 2,5 M per 80 minuti. Lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna. Asportare l'eccesso di PBS con un tovagliolo di carta.

Quindi orientare i vetrini in posizione orizzontale. Ora aggiungere con una pipetta la soluzione di BSA al 5% in PBS su ciascun vetrino e posizionare un coprioggetto, incubando per 20 minuti. Spostare delicatamente il coprioggetto lungo il vetrino di vetro.

Rimuovere l'eccesso di BSA con un tovagliolo di carta. Quindi pipettare 50 microlitri della soluzione di anticorpo primario anti-BRDU su ciascun vetrino.

Coprire un vetrino con un coprioggetto e incubare in una camera umidificata per due ore. Dopo aver rimosso i coprioggetti, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti. Applicare 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario, posizionare i coprioggetti e proteggere i vetrini anche dalla luce.

Quindi incubare per un'ora. Rimuovere le lamelle e lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti. Infine, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio vector shield su ciascun vetrino.

Premere delicatamente su un coprioggetto ed eliminare il liquido in eccesso intorno ad esso. Con un tovagliolo di carta, sigillare i coprioggetti con smalto trasparente per unghie e far asciugare all'aria. Conservare i vetrini a meno 20 gradi Celsius.

Posizionare una goccia di olio di immersione su un vetrino vicino al segno a matita e iniziare a localizzare le fibre. Allontanarsi dal fascio principale per trovare aree in cui le fibre sono chiaramente separate l'una dall'altra. In un esperimento tipico, selezionare le immagini utilizzando un solo canale cromatico per evitare bias.

Quindi acquisire circa 10 immagini per ogni campione. Spostarsi lungo il vetrino per scattare immagini diverse, poiché un'unica area del vetrino potrebbe non fornire lunghezze delle fibre o strutture di replicazione rappresentative. Importare le immagini in un programma di analisi dell'immagine.

Misurare le lunghezze di 100 tratti di fibre oppure contare da 150 a 200 diverse strutture di replicazione. La tecnica di marcatura doppia delle fibre consente di distinguere tra diverse strutture di replicazione. Il DNA appena replicato può essere visualizzato come linee di analoghi di nucleotidi marcati con anticorpi.

Qui, un forcellone di replicazione in allungamento è rappresentato come segnali rossi e verdi adiacenti. I nuovi eventi di inizio possono essere suddivisi in origini che si sono attivate mentre le cellule erano in incubazione con la prima etichetta e origini attivate durante l'incubazione con la seconda etichetta. I primi consistono in segnali verdi, rossi e verdi adiacenti, mentre i secondi consistono esclusivamente in una linea verde.

Gli eventi di terminazione si manifestano come aree rosse adiacenti a verdi. Segnali rossi sono disseminati. Le origini consistono in segnali di origine consecutivi e segnali di terminazione.

A seconda del disegno sperimentale, le forcelle di replicazione bloccate o collassate possono essere definite come un segnale rosso esclusivo o come una linea rossa seguita da un breve tratto verde. In questo esperimento, le cellule DT 40 di tipo selvaggio presentano una velocità media della forcella di 0,4 micron al minuto. Con il 63% di forcelle in corso, il 10% di origini, il 16% di forcelle bloccate, l'8% di terminazioni e il 3% di fibre intersperse.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e analizzare la dinamica della forca di replicazione in cellule DT 40. Questo ti fornirà uno strumento essenziale per indagare i difetti nella replicazione del DNA.