Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber
October 27th, 2011
DT40, un sistema modello vertebrato genetico, fornisce un potente strumento per analizzare la funzione delle proteine. Qui si descrive un metodo semplice che permette l'analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S in DT40 cellule a livello di singola molecola.
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la replicazione del DNA a livello di singola molecola. Inizia incorporando analoghi nucleotidici alogenati nel DNA appena sintetizzato. Nelle cellule viventi individuare le cellule con DNA marcato su un microscopio.
Far scorrere quindi le cellule e distendere il DNA sul vetrino del microscopio. La successiva colorazione immunologica delle fibre di DNA e l'analisi delle immagini al microscopio fluorescente possono illuminare la dinamica globale della forcella di replicazione per consentire l'analisi quantitativa dei parametri che influenzano il programma di replicazione complessivo. Negli ultimi anni, sono state sviluppate diverse versioni delle tecniche Fluor in fibra di DNA per visualizzare il movimento della singola forcella di replicazione all'interno delle cellule viventi.
Questo esperimento in vivo su cellule DT 40 a cui state per assistere può essere realizzato in un giorno e richiede solo attrezzature di laboratorio generali e un microscopio a fluorescenza che dimostri che la procedura sarà la dottoressa Rebecca Schwab, un postdoc per il mio laboratorio. Per marcare le cellule DT 40 in vivo, iniziare con una coltura in crescita esponenziale. Aggiungere l'etichetta IDU a una concentrazione finale di 25 micromolari e mescolare la sospensione cellulare.
Incubare bene le cellule per 20 minuti a 38 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, aggiungere l'etichetta CLDU a una concentrazione finale di 250 micromolari. Mescolare e incubare la sospensione cellulare.
Lavare ora le celle DT 40 con PBS reus ghiacciato. Sospendi i pellet di celle in PBS freddo e mantieni le celle etichettate sul ghiaccio. Posizionare due microlitri di sospensione cellulare su un'estremità del vetrino di vetro, asciugare all'aria fino a quando il volume della goccia non è notevolmente ridotto ma non completamente asciutto.
Ora, aggiungere sette microlitri di soluzione di lisi delle fibre sopra la sospensione cellulare e mescolare delicatamente le soluzioni mescolando con la punta di una pipetta e incubare per due minuti. Quindi, inclinare le guide di 15 gradi per consentire alle fibre di diffondersi lungo la diapositiva. Una volta che la soluzione di fibre ha raggiunto il fondo del vetrino, posizionarlo orizzontalmente ad asciugare all'aria.
A questo punto, una sottile linea opaca dovrebbe essere visibile lungo il vetrino. Segna l'inizio delle fibre tese con una matita. Per prima cosa immergere i vetrini in metanolo tre a uno in acido acetico per 10 minuti.
Lavare i vetrini in acqua distillata, quindi immergerli in acido cloridrico molare 2,5 per 80 minuti. Lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti di tamponamento. Raccogli il PBS in eccesso su un tovagliolo di carta.
Quindi orientare le diapositive orizzontalmente. Pipettare ora il 5% di BSA in PBS sopra ogni vetrino e incubare un vetrino coprioggetto per 20 minuti. Spostare delicatamente il vetrino coprioggetto lungo il vetrino.
Rimuovere l'eccesso di BSA con un tovagliolo di carta. Quindi pipettare 50 microlitri della soluzione di anticorpi primari anti BRDU. Su ogni diapositiva.
Coprire un gioco con un vetrino coprioggetti e incubare in una camera umidificata per due ore. Dopo aver rimosso i vetrini coprioggetti, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti. Applicare 50 microlitri di soluzione anticorpale secondaria posizionare i vetrini coprioggetto e proteggere anche i vetrini dalla luce.
Quindi incubare per un'ora. Rimuovere i vetrini coprioggetti e lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti. Infine, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio dello scudo vettoriale su ogni diapositiva.
Premere delicatamente su un vetrino coprioggetti e rimuovere il liquido in eccesso attorno ad esso. Con un tovagliolo di carta, sigillare i vetrini coprioggetto con smalto trasparente e asciugare all'aria. Conservare i vetrini a meno 20 gradi Celsius.
Metti una goccia di olio da immersione su un vetrino vicino al segno della matita e inizia a localizzare le fibre. Allontanati dal fascio principale per trovare le aree in cui le fibre sono chiaramente separate l'una dall'altra. In un esperimento tipico, seleziona le immagini utilizzando un solo canale di colore per evitare distorsioni.
Quindi scatta circa 10 foto di ogni campione. Spostarsi lungo la diapositiva per scattare le diverse foto, poiché un'area di una diapositiva potrebbe non fornire lunghezze di fibre rappresentative o strutture di replicazione. Importa le immagini in un programma di analisi delle immagini.
Misurare le lunghezze dei 100 tratti di fibre e/o contare da 150 a 200 diverse strutture di replicazione. La tecnica della doppia marcatura delle fibre consente di distinguere tra diverse strutture di replicazione. Il DNA appena replicato può essere visualizzato come linee di analoghi nucleotidici marcati con anticorpi.
Qui, una forca allungata in corso è rappresentata come segnali rossi e verdi adiacenti. I nuovi eventi di iniziazione possono essere suddivisi in origini che si sono attivate mentre le cellule erano incubate con la prima etichetta e origini che si sono attivate durante l'incubazione con la seconda etichetta. Il primo è costituito da segnali verdi e rossi vicini e il secondo da una linea verde. Soltanto.
Gli eventi di terminazione si manifestano come adiacenti in rosso, verde. Segnali rossi intervallati. Le origini sono costituite da origini consecutive e segnali di terminazione.
A seconda del disegno sperimentale, le forche in stallo o collassate possono essere definite come un segnale solo rosso o una linea rossa, seguita da un breve tratto verde. In questo esperimento, le celle DT 40 wild type hanno una velocità media della forchetta di 0,4 micron al minuto. Con il 63% di fork in corso, il 10% di origini, il 16% di fork in stallo, l'8% di terminazioni e il 3% di fibre intervallate.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e analizzare la dinamica della forcella di replicazione nelle celle DT 40. Questo ti fornirà uno strumento essenziale per indagare sui difetti nella replicazione del DNA.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la replicazione del DNA a livello di singola molecola nelle cellule DT40, un sistema genetico modello vertebrato. La tecnica consente un'analisi qualitativa dei parametri di sintesi del DNA durante la fase S.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- Le cellule DT40 sono un potente modello per studiare la funzione delle proteine.
- Comprendere le dinamiche di replicazione del DNA è cruciale per comprendere la stabilità genetica.
- Le tecniche a singola molecola forniscono informazioni dettagliate sui processi di replicazione.
- I metodi precedenti si sono evoluti per visualizzare i singoli forconi di replicazione.
Scopo dello studio
- Visualizzare le dinamiche di replicazione del DNA in cellule DT40 viventi.
- Analizzare l'influenza di vari parametri sulla sintesi del DNA.
- Fornire un protocollo sperimentale semplice per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Incorporazione di analoghi di nucleotidi alogenati nel DNA.
- Immunomacchia di fibre di DNA per la visualizzazione.
- Microscopia fluorescente per analizzare la dinamica dei forconi di replicazione.
- Analisi quantitativa delle lunghezze delle fibre e delle strutture di replicazione.
Risultati principali
- La velocità media del forcone nelle cellule DT40 di tipo selvatico è di 0,4 micron al minuto.
- Il 63% dei forconi è in corso, con il 10% di origini e il 16% di forconi bloccati.
- Sono stati caratterizzati anche gli eventi di terminazione e le fibre intersperse.
- La tecnica consente di differenziare tra varie strutture di replicazione.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce informazioni essenziali sulle dinamiche di replicazione del DNA.
- Può essere utilizzato per indagare i difetti nella replicazione del DNA.
- Il protocollo è accessibile e può essere completato in un giorno.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization of DNA replication in DT40 cells enables precise interrogation of replication fork dynamics, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative and qualitative insights into genome stability mechanisms, directly informing target validation and pathway analysis. The method's rapid turnaround and accessibility facilitate integration into high-throughput discovery pipelines for portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of replication fork speed and structure for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ongoing, stalled, and terminated forks in gene-modified systems.
- Facilitates pathway clarification by quantifying replication origin density and fork termination events.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets affecting genome stability.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DT40 cell-based systems for downstream compound screening targeting replication processes.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs for assay development.
- Enables scalable analysis of replication dynamics across genetic backgrounds.
- Supports reliable evaluation of candidate molecules impacting DNA synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling genomic instability linked to tumorigenesis.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for genome maintenance targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying replication defects in engineered models.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker development in genome stability pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This DNA fiber technique positions within the early discovery to lead identification continuum, enabling hypothesis testing and mechanistic validation before preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing replication fork behavior in gene-edited cells.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for replication dynamics, supporting compound evaluation workflows.
- Analytics: Delivers measurable readouts such as fork speed, origin density, and structure frequencies for comparative analysis.
- Translational Research: Connects replication phenotypes to disease-relevant genomic instability when supported by genetic models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and compound mechanism studies in vertebrate cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genome stability research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable single-molecule analysis with general lab infrastructure.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of genome maintenance targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program comparability for replication-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to general laboratory equipment and a fluorescence microscope.
- Demands cross-team standardization for image acquisition and tract measurement protocols.
- Adaptable to various gene-edited or compound-treated DT40 cell models.
- Limited to systems where single-molecule DNA fiber stretching and labeling are feasible.
