Name: Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Impara a visualizzare la replicazione del DNA a livello di singola molecola nelle cellule DT40 utilizzando la tecnica DNA Fiber. Questo metodo permette di analizzare la dinamica delle forcelle di replicazione.

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Ringraziamo il dottor T. Helleday e Dott. E. Petermann per aiutare con la tecnica della fibra così come i membri del laboratorio di discussione utile. WN è supportata da un Senior Fellowship Research International presso l&#39;Associazione per la Ricerca sul Cancro Internazionale e dal Comitato di Stato polacco per la ricerca scientifica di sovvenzione (N301 165935).

Il metodo qui descritto è stato utilizzato nel seguente pubblicazione: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 coltura cellulare Materiali: siero fetale bovino (FBS), pollo siero, penicillina / streptomicina, 2-mercaptoetanolo, RPMI <ol><li> Preparare terreno di coltura cellulare: aggiungere 7% FBS, 3% di siero di pollo, 1 penicillina / streptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanolo e medie RPMI. </li><li> DT40 cellule sono coltivate in contenitori sterili colture cellulari a 38 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Dividere le celle ogni giorno per una densità di 5 x 10 5 cellule / ml 6. </li></ol> 2. Nella etichettatura vivo Materiali: Idu, CldU <ol><li> Preparare soluzioni di analoghi nucleotidici: sciogliere Idu a 5 mm e CldU a 2,5 mm in mezzo. Calore entrambe le soluzioni brevemente a 60 ° C e fino a quando il vortice analogico nucleotideUES sono sciolti completamente. </li><li> Aggiungi IDU ad una concentrazione finale di 25 mM di crescita esponenziale DT40 cellule e mescolare bene la sospensione cellulare. Incubare le cellule per 20 minuti a 38 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo l'incubazione con la prima etichetta, aggiungere CldU ad una concentrazione finale di 250 micron e curare le cellule, come descritto nel passaggio precedente. </li><li> Lavare le cellule con PBS freddo ghiaccio e risospendere loro ad una concentrazione di 7,5 x 10 5 cellule / ml in PBS freddo. Mantenere le cellule etichettate sul ghiaccio. </li></ol> La procedura di etichettatura descritto è solo un suggerimento e può essere modificato per rispondere alle domande specifiche. Si prega di fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori informazioni sul design sperimentale. 3. Lisi delle cellule e del DNA diffusione Materiali: lastre di vetro, fibra di soluzione di lisi <ol><li> Preparare la soluzione in fibra di lisi: 50 mM EDTA e 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li spot l di sospensione cellulare ad una estremit del vetrino. far asciugare per minuti o fino a quando il volume della goccia notevolmente ridotta ma non secco.><li> Pipettare 7 soluzione di lisi microlitri in cima alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente con la punta della pipetta per miscelare le soluzioni. Incubare per 2 minuti per lisi cellulare per procedere. </li><li> Inclinazione diapositive a 15 ° per permettere di diffondere le fibre lungo lo scivolo. </li><li> Una volta che la soluzione in fibra ha raggiunto la parte inferiore della diapositiva, è posto orizzontalmente per asciugare all'aria. Dopo l'essiccazione, una linea sottile, opaco dovrebbe essere visibile lungo la diapositiva. A questo punto, l'inizio delle fibre tese deve essere contrassegnato con una matita come dopo colorazione la linea non sarà più visibile. Questo marchio sarà poi aiutare a individuare le fibre al microscopio. </li></ol> 4. Immunofluorescenza Materiali: metanolo, acido acetico, acido cloridrico, 5% BSA in PBS, vaschetta di colorazione, anti-BrdU (topo) di anticorpi,anti-BrdU (ratto) di anticorpi, di pecora anti-topo Cy3 anticorpi di capra anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpi, media Vectashield montaggio, coprioggetto, smalto per le unghie <ol><li> Immergere i vetrini in metanolo / acido acetico (3:1) in una vaschetta di colorazione e incubare per 10 minuti. </li><li> Lavare i vetrini in acqua distillata H 2 O, quindi immergere in 2,5 M HCl per 80 minuti. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti. </li><li> Rimuovere diapositive dalla vaschetta di colorazione e raccogliere PBS in eccesso con un tovagliolo di carta. Porre i vetrini in senso orizzontale e BSA pipetta 5% su ogni diapositiva. Coprire le diapositive delicatamente con un coprioggetto per diffondere la BSA uniformemente sulla slitta e incubare per 20 minuti. </li><li> Diluire gli anticorpi primari nel 5% BSA alle concentrazioni seguenti: 1:25 anti-BrdU (topo) e 1:400 anti-BrdU (ratto). </li><li> Spostare il vetrino dolcemente il vetrino per rimuoverlo. Non forzare se la polizza di copertura bastoni alla diapositiva. La presentazione può essere reidratato in PBS fino a quando il vetrino si allenta unod possono essere rimossi con facilità. Raccogliere BSA in eccesso con un tovagliolo di carta e porre le slide orizzontale. Pipettare 50 ml di soluzione di anticorpo primario su ogni diapositiva. Coprire di nuovo con un coprioggetto per diffondere la soluzione di anticorpi uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 2 ore. </li><li> Dopo aver rimosso il coprioggetto, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti </li><li> Diluire gli anticorpi secondari nel 5% BSA alle seguenti concentrazioni: 1:500 pecora anti-topo Cy3 e 1:400 capra anti-topo Alexa Fluor 488. </li><li> Applicare il 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario come descritto per gli anticorpi primari. Proteggere le diapositive dalla luce e incubare per 1 ora. </li><li> Dopo aver rimosso il coprioggetto, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti. </li><li> Aggiungere una goccia di medium Vectashield montaggio su ogni diapositiva e applicare un vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il coprioggetto e rimuovere il liquido in eccesso attorno ad esso con un tovagliolo di carta. Coprioggetto sigillo trasparente con unghie polish e lasciarle asciugare. Conservare i campioni a -20 ° C. </li></ol> 5. Acquisizione di immagini Materiali: microscopio a fluorescenza, fotocamera Mettere una goccia di olio di immersione in una diapositiva accanto al simbolo di matita e di localizzare l'origine delle fibre. Di solito, c'è un fascio di fibre principale, ma queste fibre sono troppo invischiati e non possono essere analizzati successivamente. Allontanarsi dal fascio principale per individuare le aree dove le fibre sono chiaramente separate le une dalle altre (Fig. 2). Vorremmo selezionare solo le immagini utilizzando un canale di colore in modo da evitare distorsioni. Poi, ci sarebbe di circa 10 foto di ogni linea del tempo punto di concentrazione o di cellule. Tuttavia, il numero di immagini dipende da quante fibre può contare su ogni foto. Muovetevi lungo lo scivolo per le riprese fotografiche differenti, come una zona di una diapositiva non possono fornire lunghezze fibra di rappresentanza o strutture di replica. 6. Analisi dei dati Materiale: analisi del programma Picture, ad esempio ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importare immagini in un programma di analisi dell'immagine. Misura la lunghezza dei tratti di fibre e / o contare le strutture di replica diversi (Fig. 3). Contano solo le fibre che sono chiaramente visibili e che non si estendono oltre il bordo della foto. Noi di solito misurare la lunghezza di circa 100 fibre e contano 150-200 strutture replica e vorremmo ripetere gli esperimenti individuali almeno tre volte. 7. Rappresentante dei risultati: DNA appena replicato possono essere visualizzati come linee di anticorpi marcati con analoghi nucleotidici. Nei nostri esperimenti una forcella in corso è rappresentato come adiacente segnali rosso e verde (Fig. 3). Il protocollo di doppia marcatura ci permette anche di definire quattro classi principali di strutture replica: 1) eventi nuova iniziazione può essere Divid ed in origini che hanno sparato mentre le cellule sono state incubate con la prima etichetta e le origini che hanno sparato durante l'incubazione con la seconda etichetta. I primi consistono in vicine verde-rosso-verde i segnali e il secondo di una linea verde solo. 2) cessazione eventi si manifestano come adiacente rosso-verde-rosso segnali. 3) intervallati origini sono siti nel genoma di origine ravvicinati. Tali siti sono costituiti di origini consecutivi e segnali di terminazione. 4) a seconda del disegno sperimentale, in fase di stallo / forche crollato può essere definito come un segnale rosso solo 7 o una linea rossa seguita da un breve tratto verde 8,9. Utilizzando le condizioni qui descritte, le cellule di tipo selvatico DT40 hanno una velocità media forchetta di 0,4 micron / min. Siamo in grado di rilevare circa il 63% forchette in corso, il 10% origini, il 16% forchette in fase di stallo (rosso tratti solo), l'8% e il 3% terminazioni delle fibre intervallati. URE 1 "/&gt; . Figura 1 (A) La parte sinistra del cartone animato rappresenta il primo passo della procedura di etichettatura del DNA: l'aggiunta di Idu a crescita esponenziale DT40 cellule porta l'analogo nucleotidico ad essere facilmente incorporati nella guida di nuova sintesi e in ritardo di sviluppo filamenti di DNA. Questo può essere visualizzato utilizzando un anticorpo specifico, e apparirà come una linea rossa se visto sotto il microscopio. Successivamente, la stessa procedura si ripete con CldU come mostrato sul lato destro della figura. Dopo l'incubazione con l'analogo secondo nucleotide, una forcella attivo sarà visibile come un adiacente tratto rosso-verde. La lunghezza media delle fibre è proporzionale al tempo di incubazione degli analoghi nucleotidici. (B) del DNA da cellule lisate DT40 è teso dalla forza di gravità su un vetrino da microscopio e gli analoghi nucleotidici incorporato vengono visualizzati mediante l'uso di anticorpi specifici e microscopia a fluorescenza. IGURA 2 "/&gt; Figura 2. Un'immagine rappresentativa fluorescenza mostra fibre di tipo selvaggio DT40 cellule in seguito etichettati con IDU e CldU per 20 minuti ciascuno. La maggior parte delle fibre sono ben separati gli uni dagli altri e può quindi essere facilmente analizzati. La barra bianca rappresenta 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 La doppia etichettatura in fibra tecnica permette di distinguere tra le strutture di replica diversi; 1 - forche attivamente replicando, 2 - nuovi siti di replicazione del DNA (lancio di nuove origini), 3 - cessazioni fork (due forchette convergenti), 4 - fibre intervallati (siti di origini ravvicinati) e 5 - forcelle in stallo (solo segnale rosso).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo un metodo che permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S a livello di singola molecola. Negli ultimi dieci anni, diverse versioni della tecnica del DNA Fluorografia fibra sono stati sviluppati per visualizzare il movimento delle forche replica singoli all&#39;interno delle cellule viventi. Il parametro fondamentale in tutte queste tecniche è la procedura utilizzata per ottenere la migliore possibile allungamento del DNA sulle superfici di vetro che fornisce ben separate le fibre del DNA. Un passo fondamentale per raggiungere questo obiettivo è il tempo di incubazione della sospensione cellulare sul vetrino da microscopio così come il tempo lisi. Questi parametri dipendono dalla temperatura e flusso d&#39;aria in un laboratorio di particolare e dovrebbe essere empiricamente determinato. La parte pratica di un esperimento in fibra di DNA in genere viene eseguita entro un giorno. Tuttavia, l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e successive analisi è più tempo e richiede pratica. Il protocollo di etichettatura può essere annuncioApted per rispondere a vari problemi scientifici: con un agente che interferisce con la replica durante l&#39;etichettatura secondo impulso monitor allungamento forcella / stallo in risposta allo stress replicativo. In questo scenario, la prima etichetta non ha bisogno di essere lavati come il nucleotide è aggiunto il secondo in eccesso. In alternativa, i farmaci che impediscono la replicazione può essere usato in combinazione o appena dopo l&#39;aggiunta della prima etichetta. Ciò richiede la prima etichetta e il farmaco deve essere rimosso prima l&#39;analogo secondo nucleotide è applicata. Questa procedura permette di determinare l&#39;importanza di diversi fattori di riparazione del DNA sulla stabilità replicativa forcella / recupero in condizioni di stress replicativo (forcella cioè stallo e / o collasso). Degno di nota, un&#39;analisi più dettagliata dei particolari del programma di replicazione del DNA potesse essere eseguita con l&#39;uso di un approccio alternativo che combina DNA e la pettinatura ibridazione in situ fluorescente. Questo però, è tecnicamente più impegnativo e richiede speseattrezzature SIVE. La capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente le indicazioni della replicazione del DNA offre uno strumento essenziale per studiare i difetti nella replicazione del DNA stesso, come pure i percorsi che sopprimono l&#39;instabilità genomica associata con forche di replica. Indubbiamente, questo saggio sarà ulteriormente aiutare a far luce sui meccanismi di replicazione mediata riparazione del DNA che permettono alle cellule normali di rispondere / adattarsi ai cambiamenti ambientali e come le cellule tumorali utilizzano questi meccanismi per resistere alla tossicità dei farmaci destinati forche replica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Oro siero fetale bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Pollo siero </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-deossiuridina (IDU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-cloro-2&#39;-deossi-uridina (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto No1 </td><td> Laboratorio scientifico suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield montaggio medio </td><td> H-1000 Vector laboratorio </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-BrdU (mouse) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-BrdU (ratto) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> di pecora anti-topo Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> capra anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpi </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione della replicazione del dna nei vertebrati dt40 sistema modello utilizzando la tecnica del dna fiber

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Mantenimento della stabilità replica forcella è della massima importanza per la divisione delle cellule per preservare la vitalità e prevenire le malattie. I processi coinvolti non solo garantire la duplicazione del genoma fedeli di fronte a danni al DNA endogeno ed esogeno, ma anche prevenire l&#39;instabilità genomica, un fattore riconosciuto causale nello sviluppo del tumore. Qui, descriviamo un microscopio a base semplice e conveniente fluorescenza metodo per visualizzare la replicazione del DNA nelle cellule B aviaria linea DT40. Questa linea cellulare fornisce un potente strumento per studiare la funzione delle proteine ​​in vivo dalla genetica inversa nelle cellule dei vertebrati 1. Fibra Fluorografia DNA in cellule DT40 manca un gene specifico permette di chiarire la funzione di questo prodotto del gene nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. I metodi tradizionali per analizzare le dinamiche forcella di replicazione nelle cellule dei vertebrati si basano sulla misurazione del tasso globale di sintesi del DNA in una popolazione di cellule etichettate impulsi. Si tratta di un approccio quantitativo e non consente per l&#39;analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA. Al contrario, il tasso di circolazione delle forche attivo può essere seguito direttamente quando si utilizza la tecnica del DNA in fibra di 2-4. In questo approccio, il DNA nascente è etichettato in vivo per incorporazione di nucleotidi alogenati (Fig. 1A). Successivamente, le singole fibre sono allungati su un vetrino da microscopio, e con l&#39;etichetta tratti di replicazione del DNA sono colorate con anticorpi specifici e visualizzati al microscopio a fluorescenza (Fig. 1B). Avvio di replica e direzionalità forcella è determinato mediante l&#39;uso consecutivo di due analoghi diversamente modificati. Inoltre, la doppia etichettatura approccio permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S, ovvero la replica di strutture quali le forcelle in corso e in fase di stallo, l&#39;origine densità replica così come terminazioni forchetta. Infine, la procedura sperimentale può essere realizzareed in un giorno, e richiede solo attrezzature generali di laboratorio e un microscopio a fluorescenza.

DT40, un sistema modello vertebrato genetico, fornisce un potente strumento per analizzare la funzione delle proteine. Qui si descrive un metodo semplice che permette l&#39;analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S in DT40 cellule a livello di singola molecola.

Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

Il mantenimento della stabilità della forca di replicazione è di fondamentale importanza per le cellule in divisione per preservare la vitalità e prevenire le malattie. I processi coinvolti non...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la replicazione del DNA a livello di singola molecola. Iniziare incorporando analoghi di nucleotidi alogenati nel DNA appena sintetizzato. In cellule vive, individuare le cellule con DNA marcato su un microscopio.Far scivolare quindi le cellule e stendere il DNA sul vetrino del microscopio. La successiva immuno-marcazione delle fibre di DNA e l'analisi delle immagini di microscopia fluorescente possono chiarire la dinamica globale delle forcelle di replicazione, permettendo un'analisi quantitativa dei parametri che influenzano il programma complessivo di replicazione. Negli ultimi anni, sono state sviluppate diverse versioni delle tecniche di fluoroscenza su fibre di DNA per visualizzare il movimento delle singole forcelle di replicazione all'interno di cellule vive.Questo esperimento in vivo in cellule DT 40 che state per osservare può essere completato in un solo giorno e richiede soltanto attrezzature di laboratorio generiche e un microscopio a fluorescenza. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Rebecca Schwab, postdottoranda del mio laboratorio. Per etichettare le cellule DT 40 in vivo, iniziare con una coltura in crescita esponenziale. Aggiungere l'etichetta IDU a una concentrazione finale di 25 micromolare e mescolare la sospensione cellulare.Incubare bene le cellule per 20 minuti a 38 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, aggiungere l'etichetta CLDU a una concentrazione finale di 250 micromolare. Mescolare e incubare la sospensione cellulare.Ora lavare le cellule DT 40 con PBS freddo. Sospendere i pellet cellulari in PBS freddo e mantenere le cellule etichettate sul ghiaccio. Depositare due microlitri della sospensione cellulare su un'estremità del vetrino e lasciare asciugare all'aria fino a quando il volume della goccia è notevolmente ridotto, ma non completamente secco.Ora, aggiungere sette microlitri di soluzione di lisi delle fibre sopra la sospensione cellulare e mescolare delicatamente le soluzioni agitando con la punta di una pipetta; incubare per due minuti. Successivamente, inclinare i vetrini di 15 gradi per permettere alle fibre di disporsi lungo il vetrino. Una volta che la soluzione di fibre ha raggiunto il fondo del vetrino, posizionarlo in orizzontale per farlo asciugare all'aria.A questo punto, dovrebbe essere visibile una linea sottile e opaca lungo il vetrino. Contrassegnare l'inizio delle fibre allungate con una matita. Immergere prima i vetrini in una soluzione di metanolo e acido acetico in rapporto tre a uno per 10 minuti.Lavare i vetrini in acqua distillata, quindi immergerli in acido cloridrico 2,5 M per 80 minuti. Lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna. Asportare l'eccesso di PBS con un tovagliolo di carta.Quindi orientare i vetrini in posizione orizzontale. Ora aggiungere con una pipetta la soluzione di BSA al 5% in PBS su ciascun vetrino e posizionare un coprioggetto, incubando per 20 minuti. Spostare delicatamente il coprioggetto lungo il vetrino di vetro.Rimuovere l'eccesso di BSA con un tovagliolo di carta. Quindi pipettare 50 microlitri della soluzione di anticorpo primario anti-BRDU su ciascun vetrino.Coprire un vetrino con un coprioggetto e incubare in una camera umidificata per due ore. Dopo aver rimosso i coprioggetti, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti. Applicare 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario, posizionare i coprioggetti e proteggere i vetrini anche dalla luce.Quindi incubare per un'ora. Rimuovere le lamelle e lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti. Infine, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio vector shield su ciascun vetrino.Premere delicatamente su un coprioggetto ed eliminare il liquido in eccesso intorno ad esso. Con un tovagliolo di carta, sigillare i coprioggetti con smalto trasparente per unghie e far asciugare all'aria. Conservare i vetrini a meno 20 gradi Celsius.Posizionare una goccia di olio di immersione su un vetrino vicino al segno a matita e iniziare a localizzare le fibre. Allontanarsi dal fascio principale per trovare aree in cui le fibre sono chiaramente separate l'una dall'altra. In un esperimento tipico, selezionare le immagini utilizzando un solo canale cromatico per evitare bias.Quindi acquisire circa 10 immagini per ogni campione. Spostarsi lungo il vetrino per scattare immagini diverse, poiché un'unica area del vetrino potrebbe non fornire lunghezze delle fibre o strutture di replicazione rappresentative. Importare le immagini in un programma di analisi dell'immagine.Misurare le lunghezze di 100 tratti di fibre oppure contare da 150 a 200 diverse strutture di replicazione. La tecnica di marcatura doppia delle fibre consente di distinguere tra diverse strutture di replicazione. Il DNA appena replicato può essere visualizzato come linee di analoghi di nucleotidi marcati con anticorpi.Qui, un forcellone di replicazione in allungamento è rappresentato come segnali rossi e verdi adiacenti. I nuovi eventi di inizio possono essere suddivisi in origini che si sono attivate mentre le cellule erano in incubazione con la prima etichetta e origini attivate durante l'incubazione con la seconda etichetta. I primi consistono in segnali verdi, rossi e verdi adiacenti, mentre i secondi consistono esclusivamente in una linea verde.Gli eventi di terminazione si manifestano come aree rosse adiacenti a verdi. Segnali rossi sono disseminati. Le origini consistono in segnali di origine consecutivi e segnali di terminazione.A seconda del disegno sperimentale, le forcelle di replicazione bloccate o collassate possono essere definite come un segnale rosso esclusivo o come una linea rossa seguita da un breve tratto verde. In questo esperimento, le cellule DT 40 di tipo selvaggio presentano una velocità media della forcella di 0,4 micron al minuto. Con il 63% di forcelle in corso, il 10% di origini, il 16% di forcelle bloccate, l'8% di terminazioni e il 3% di fibre intersperse.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e analizzare la dinamica della forca di replicazione in cellule DT 40. Questo ti fornirà uno strumento essenziale per indagare i difetti nella replicazione del DNA.

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Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Questo protocollo presenta una tecnica per la mappatura ad alta risoluzione dei siti di replicazione in cromatina strutturalmente conservata in situ che impiega una combinazione di marcatura EdU-streptavidin-Nanogold pre-incorporante e ChromEMT.

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

La metodologia assiste nell'analisi della variazione nelle dinamiche di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle. Diverse metodologie possono essere adottate in base al livello di citotossicità del materiale di interesse. Inoltre, viene fornita una descrizione dell'analisi delle immagini per aiutare nell'analisi delle fibre del DNA.

Dimostrazione del saggio delle fibre di DNA per lo studio del danno al DNA e delle dinamiche di riparazione indotte dalle nanoparticelle

Questo protocollo dimostra l'esecuzione di un saggio a singola molecola per la visualizzazione dal vivo dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG. Descrive (1) la preparazione di un substrato di DNA, (2) la purificazione dell'elicasi CMG di Drosophila melanogaster marcata in fluorescenza, (3) la preparazione di una cella a flusso microfluidico per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e (4) il saggio di svolgimento del DNA a singola molecola.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Qui, descriviamo la procedura per analizzare la progressione della replicazione attraverso ripetizioni patogene e inclini alla struttura utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale.

Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Questo protocollo delinea un saggio di replicazione del DNA a singola molecola basato su microscopia a fluorescenza, che consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra le DNA polimerasi e gli ostacoli come le strutture G-quadruplex.

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Impara a visualizzare la replicazione del DNA a livello di singola molecola nelle cellule DT40 utilizzando la tecnica DNA Fiber. Questo metodo permette di analizzare la dinamica delle forcelle di replicazione.

Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

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