Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

L'obiettivo generale della seguente procedura è determinare la localizzazione submitocondriale di una chinasi del ciclo cellulare normalmente nucleare e quindi analizzare come la sua localizzazione mitocondriale influenzi la progressione del ciclo cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca mitocondriale, come ad esempio il modo in cui il nucleo comunica con i mitocondri durante il ciclo cellulare. Marcando le proteine con una sequenza guida dei mitocondri, possiamo sfruttare le sovraespressioni specifiche delle proteine nei mitocondri, in modo da poter studiare le loro funzioni specifiche dei mitocondri.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul targeting mitocondriale di determinate proteine, può essere applicato anche ad altri organelli, come il nucleo, l'ER, il golgi e un lisosoma. Dopo la coltivazione, l'omogeneizzazione e la pellettizzazione delle celle secondo il protocollo di testo, trasferire il surnatante in una nuova provetta. Centrifugare il campione a 7.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi utilizzare 200 microlitri di tampone IBC ghiacciato per risospendere il pellet e dividere l'omogeneizzato in due aliquote. Centrifugare nuovamente i campioni a 7.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. E ripeti il lavaggio.

Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 30 microlitri di tampone di lisi cellulare a uno dei pellet e conservare il lisato a 80 gradi Celsius per l'immunoblotting. Per effettuare l'estrazione del carbonato di sodio con il secondo pellet per separare le proteine solubili da quelle legate alla membrana, aggiungere 250 microlitri di carbonato di sodio 0,1 molare pH 11,0 e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare a 100.000 g per 20 minuti.

Quindi raccogli il surnatante e aggiungi un volume uguale di acido tricloroacetico appena fatto al 20% per far precipitare le proteine. Tenere in ghiaccio per 30 minuti. Nel frattempo, aggiungere 30 microlitri di tampone di lisi cellulare al pellet e sonicare secondo il protocollo di testo prima di conservarlo a 80 gradi Celsius per l'immunoblotting.

Dopo 30 minuti di incubazione del TCA, centrifugare la reazione a 15.000 g per 10 minuti. Scartare il surnatante, quindi utilizzare 80 microlitri di tampone di lisi cellulare per risospendere il pellet. Dopo aver isolato le frazioni mitocondriali dalle cellule come descritto nel protocollo di testo, separare le frazioni mitocondriali in 10 porzioni uguali.

Pellettare i campioni a 7.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare 30 microlitri di una gamma di concentrazioni di tamponi ipotonici di saccarosio con o senza tripsina, per sciogliere ogni pellet. E incubare su ghiaccio per 30 minuti.

Aggiungere 3 microlitri di PMSF da 10 millimolari alle fiale contenenti tripsina per fermare la digestione della tripsina. E incubare su ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 14.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti.

E trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Per lisare il pellet, aggiungere 30 microlitri di tampone di lisi cellulare. Sonicare i campioni come descritto nel protocollo di testo e conservarli a 80 gradi Celsius.

Per costruire vettori Cdk-1 ciclinaB-1 marcati con GFP/RFP, clonare la sequenza di targeting dei mitocondri dal precursore della subunità 8A della citocromo-c ossidasi umana e inquadrare con l'n-terminale di GFP o RFP nei siti Nhe1 e bAmH1, di pEGFP-N1 o pERFP-N1, utilizzando tecniche di clonaggio molecolare standard. Utilizzando i primer delineati nel protocollo di testo, amplificare i geni Cdk1 e ciclinaB1 seguendo tecniche standard. Quindi utilizzare BamH1 per digerire i prodotti della PCR.

Esegui le reazioni su un gel di agarosio all'1%, prima di usare una lama di rasoio per tagliare i frammenti di DNA della dimensione corretta. Quindi utilizzare un kit di estrazione su gel per purificare il DNA. Successivamente, digerire un microgrammo di plasmidi MTS-pEGFP-N1 e MTS-pERFP-N1 con 1 microlitro di BamH1 a 37 gradi Celsius per 2 ore.

Quindi aggiungere 1 microlitro di fosfatasi alcalina intestinale di vitello e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver eseguito i prodotti della digestione su un gel di agarosio all'1% e aver purificato il DNA come appena descritto, impostare una reazione di legatura utilizzando i reagenti elencati nel protocollo di testo. Quindi incubare la reazione a 4 gradi Celsius durante la notte.

Trasformare le cellule competenti di e. coli dH5-alfa con 10 microlitri della miscela di legatura. E far crescere i batteri su piastre di agar LB più 10 milligrammi per millilitro di kanamicina a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, utilizzare una punta di pipetta sterile per prelevare una colonia da una piastra. E inserire la punta in un tubo contenente 5 millilitri di libbra di kanamicina. Incubare la coltura durante la notte e la mattina seguente, utilizzare un mini kit di preparazione secondo il protocollo di testo per isolare il plasmide.

Per trasfettare le cellule MCF-10A in crescita esponenziale, utilizzare plasmidi Cdk1 o ciclinaB-1 per preparare un reagente di trasfezione plasmidico in un rapporto di 1:2 in 100 microlitri di siero e terreno privo di antibiotici. Trasfettare le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Colora e visualizza i mitocondri secondo il protocollo di testo.

Per eseguire la selezione cellulare, trasfettare da 2 volte 10 alla 5a cellula con i vettori desiderati in una piastra a 6 pozzetti utilizzando un rapporto 1:2 tra DNA e reagente di trasfezione preparato in 2,5 millilitri di siero e terreno privo di antibiotici. Dopo aver incubato la trasfezione per 48 ore, utilizzare la citometria a flusso per selezionare in vivo le cellule che esprimono stabilmente le proteine Cdk-1 marcate con GFP e cliclinaB1 marcate con RFP secondo il protocollo di testo. Per misurare la lunghezza del ciclo cellulare utilizzando il saggio di citometria a flusso con marcatura EdU, le cellule sono state selezionate in piastre a 6 pozzetti con una densità di 2,5 volte 10 fino alla quinta cella per pozzetto.

Dopo un'incubazione notturna, aggiungere EdU al terreno di coltura a una concentrazione finale di 25 micromolari e incubare per un'altra ora. Quindi, a intervalli di due ore, utilizzare l'1% di BSA in 500 microlitri di PBS per lavare un pozzetto di cellule. E raccogli in un tubo da 1,5 millilitri.

Centrifugare le celle a 350 g per 5 minuti. Quindi scartare il surnatante. Sganciare il pellet aggiungendo 100 microlitri di soluzione fissante.

Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, utilizzare 1 millilitro di BSA all'1% in PBS per lavare le cellule tre volte. Quindi utilizzare 0,5 millilitri di etanolo al 70% per fissare le celle a 4 gradi Celsius durante la notte.

Quando si esegue la marcatura EdU con cellule trasfettate con proteine marcate GFP e RFP, è fondamentale spegnere i segnali fluorescenti da GFP e RFP. Per raggiungere questo obiettivo, aggiungiamo un ulteriore passaggio di fissaggio notturno delle celle utilizzando il 70% di etanolo. Il giorno seguente, dopo aver lavato e permeabilizzato le cellule secondo il protocollo di testo, aggiungere 0,5 millilitri di cocktail di reazione in ogni provetta e mescolare bene.

Dopo l'incubazione al buio e un altro lavaggio, utilizzare 50 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio o PI in PBS all'1% di BSA per colorare il DNA. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso per seguire la popolazione EdU-positiva. Presenta un dot plot sparso di cellule marcate con EdU colorate per il contenuto di DNA e EdU.

Usa il canale APC per Alexa 647 EdU utilizzando un filtro passa-banda 670 a 30 con tutta la luce presente, meno di 685 nanometri che colpisce quel filtro e il canale ficoeritrina per PI con un filtro passa-banda 581 a 15 davanti ad esso, con tutta la luce presente a meno di 600 nanometri che colpisce quel filtro. Con una strategia di gating standard per l'acquisizione, tracciare l'area FSC per l'area SSC per la morfologia, seguita da PI di Alexa 647 EdU per la colorazione cellulare. Registra i dati per tutte le provette una per una, acquisendo 10.000 eventi per campione.

In questa figura, la proteina della matrice mitocondriale Hsp60 e la proteina spaziale intermembrana Timm13 sono state utilizzate come marcatori di localizzazione submitocondriale. Simile a Hsp60, ma a differenza di Timm13, la ciclinaB1 e Cdk1 sono state protette dalla digestione della tripsina, indicando che si localizzano nella matrice mitocondriale. Come mostrato qui, mediante Western blotting delle frazioni mitocondriali isolate, utilizzando i costrutti ciclinaB1 e Cdk-1 marcati con MTS e GFP, è stata raggiunta una sovraespressione di ciclinaB1 e/o Cdk-1 nei mitocondri.

Utilizzando un saggio di inseguimento dell'impulso EdU, è stato dimostrato che le cellule marcate in fase S progrediscono attraverso la fase G2M e appaiono in fase G1 alla velocità di 4 ore in cellule che esprimono ciclina mitocondriale B1 Cdk-1 wild-type. Rispetto a 6 ore, in cellule trasfettate con un vettore di controllo o ciclina mutante B1 Cdk-1, indicando che l'aumento della ciclina mitocondriale B1 Cdk-1 accelera la progressione del ciclo cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile misurare altri metodi come la generazione di ATP mitocondriale, il consumo di ossigeno, il potenziale di membrana e le specie reattive dell'ossigeno per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui la localizzazione mitocondriale della chinasi del ciclo cellulare Cdk-1 altera la respirazione mitocondriale e la produzione di energia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la localizzazione mitocondriale e le funzioni specifiche dei mitocondri di una chinasi nucleare.