Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

L'obiettivo generale della seguente procedura è determinare la localizzazione submitocondriale di una chinasi del ciclo cellulare normalmente nucleare e analizzare quindi come la sua localizzazione mitocondriale influisca sul progresso del ciclo cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca mitocondriale, come ad esempio in che modo il nucleo comunica con i mitocondri durante il ciclo cellulare. Etichettando le proteine con una sequenza di indirizzamento mitocondriale, possiamo sfruttare un'espressione specificamente sovraespressa della proteina nei mitocondri, consentendoci di studiarne le funzioni specifiche per i mitocondri.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul targeting mitocondriale di determinate proteine, può essere applicato anche ad altri organelli, come il nucleo, il reticolo endoplasmatico, l'apparato di Golgi e il lisosoma. Dopo la coltura, l'omogeneizzazione e la centrifugazione delle cellule secondo il protocollo descritto, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Quindi centrifugare il campione a 7.000 ×g e a 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi utilizzare 200 microlitri di tampone IBC freddo per risospendere il pellet e dividere l'omogenato in due aliquote. Centrifugare nuovamente i campioni a 7.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Ripetere quindi il lavaggio.

Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere 30 microlitri di buffer per la lisi cellulare a uno dei pellet e conservare il lisato a 80 gradi Celsius per l'immunoblotting. Per eseguire l'estrazione con carbonato di sodio sul secondo pellet al fine di separare le proteine solubili da quelle legate alla membrana, aggiungere 250 microlitri di carbonato di sodio 0,1 molare a pH 11,0 e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare a 100.000 ×g per 20 minuti.

Quindi raccogliere il soprannatante e aggiungere un volume uguale di acido tricloroacetico al 20%, appena preparato, per precipitare le proteine. Mantenere sul ghiaccio per 30 minuti. Nel frattempo, aggiungere 30 microlitri di buffer per la lisi cellulare al pellet e sottoporre a sonica secondo il protocollo descritto nel testo, prima di conservare a 80 gradi Celsius per l'immunoblotting.

Dopo l'incubazione con TCA di 30 minuti, centrifugare la reazione a 15.000 g per 10 minuti. Rimuovere il soprannatante, quindi utilizzare 80 microlitri di tampone per la lisi cellulare per risospendere il pellet. Dopo aver isolato le frazioni mitocondriali dalle cellule come descritto nel protocollo testuale, suddividere le frazioni mitocondriali in 10 porzioni uguali.

Centrifugare i campioni a 7.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare 30 microlitri di una serie di concentrazioni di tamponi di saccarosio ipotonici con o senza tripsina per solubilizzare ogni pellet. Incubare quindi sul ghiaccio per 30 minuti.

Aggiungere 3 microlitri di PMSF 10 millimolare ai vial contenenti tripsina per arrestare la digestione con tripsina. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 14.000 g e 4 gradi Celsius per 10 minuti.

E trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Per lisare il pellet, aggiungere 30 microlitri di buffer per la lisi cellulare. Sonicare i campioni come descritto nel protocollo testuale e conservare a 80 gradi Celsius.

Per costruire vettori mitocondriali GFP/RFP-etichettati per la ciclina B1 e Cdk1, clonare la sequenza di targeting mitocondriale dal precursore della sottounità 8A dell'ossidasi del citocromo c umano e inserirla in quadro con l'estremità N-terminale di GFP o RFP nei siti NheI e BamHI di pEGFP-N1 o pERFP-N1, utilizzando tecniche standard di clonaggio molecolare. Utilizzando i primer descritti nel protocollo testuale, amplificare i geni Cdk1 e ciclina B1 seguendo tecniche standard. Successivamente, digerire i prodotti PCR con BamHI.

Eseguire le reazioni su un gel di agarosio all'1%, quindi utilizzare una lametta per asportare i frammenti di DNA della dimensione corretta. Successivamente, purificare il DNA mediante un kit di estrazione da gel. Poi, digerire un microgrammo di plasmidi MTS-pEGFP-N1 e MTS-pERFP-N1 con 1 microlitro di BamH1 a 37 gradi Celsius per 2 ore.

Quindi aggiungere 1 microlitro di fosfatasi alcalina intestinale del vitello e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver analizzato i prodotti di digestione su un gel di agarosio all'1% e aver purificato il DNA come appena descritto, impostare una reazione di ligazione utilizzando i reagenti elencati nel protocollo del testo. Quindi incubare la reazione a 4 gradi Celsius per tutta la notte.

Trasformare cellule competenti di e. coli dH5-alpha con 10 microlitri della miscela di ligazione. E coltivare i batteri su piastre di agar LB contenente 10 milligrammi per millilitro di kanamicina a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, utilizzare una punta sterile di pipetta per prelevare una colonia da una piastra. Inserire quindi la punta in un tubo contenente 5 millilitri di LB kanamicina. Incubare la coltura tutta la notte e, la mattina seguente, utilizzare un kit per mini prep seguendo il protocollo indicato per isolare il plasmide.

Per trasfettare cellule MCF-10A in crescita esponenziale, utilizzare plasmidi Cdk1 o cyclinB-1 per preparare il reagente di trasfezione plasmidica in un rapporto di 1:2 in 100 microlitri di mezzo privo di siero e antibiotici. Trasfettare le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Colorare e visualizzare i mitocondri secondo il protocollo descritto nel testo.

Per eseguire il sorting cellulare, trasfettare 2 volte 10 alla 5a cellule con i vettori desiderati in una piastra a 6 pozzetti utilizzando un rapporto 1:2 di DNA rispetto al reagente di trasfezione preparato in 2,5 millilitri di mezzo privo di siero e antibiotici. Dopo aver incubato la trasfezione per 48 ore, utilizzare la citometria a flusso per eseguire il sorting delle cellule vive che esprimono stabilmente le proteine Cdk-1 marcate con GFP e ciclinaB1 marcata con RFP, seguendo il protocollo descritto nel testo. Per misurare la durata del ciclo cellulare mediante il saggio di citometria a flusso con marcatura EdU, seminare le cellule ordinate in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2,5 volte 10 alla 5a cellule per pozzetto.

Dopo un'incubazione notturna, aggiungere EdU al mezzo di coltura a una concentrazione finale di 25 micromolare e incubare per un'ulteriore ora. Quindi, a intervalli di due ore, utilizzare il 1% di BSA in 500 microlitri di PBS per lavare un pozzetto di cellule. E raccogliere in un tubo da 1,5 millilitri.

Centrifugare le cellule a 350 g per 5 minuti. Quindi eliminare il soprannatante. Staccare il pellet aggiungendo 100 microlitri di soluzione fissante.

Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, utilizzare 1 millilitro di BSA al 1% in PBS per lavare le cellule tre volte. Quindi, utilizzare 0,5 millilitri di etanolo al 70% per fissare le cellule a 4 gradi Celsius durante la notte.

Quando si esegue l'etichettatura con EdU su cellule trasfettate con proteine marcate con GFP e RFP, è fondamentale sopprimere i segnali fluorescenti di GFP e RFP. Per ottenere questo risultato, si aggiunge un ulteriore passaggio di fissazione cellulare notturna utilizzando etanolo al 70%. Il giorno successivo, dopo aver lavato e permeabilizzato le cellule secondo il protocollo descritto, aggiungere 0,5 millilitri di cocktail di reazione in ogni provetta e mescolare accuratamente.

Dopo l'incubazione al buio e un ulteriore lavaggio, utilizzare 50 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio o PI in PBS con 1% di BSA per colorare il DNA. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso per seguire la popolazione positiva per EdU. Presentare un grafico a dispersione di cellule marcate con EdU, colorate per contenuto di DNA ed EdU.

Utilizzare il canale APC per Alexa 647 EdU con un filtro passa-banda 670 30, con tutta la luce presente inferiore a 685 nanometri che colpisce il filtro e il canale della ficoeritrina per PI con un filtro passa-banda 581 15 davanti, con tutta la luce presente inferiore a 600 nanometri che colpisce il filtro. Con una strategia standard di gating per l'acquisizione, tracciare l'area FSC rispetto all'area SSC per la morfologia, seguita da PI rispetto ad Alexa 647 EdU per la colorazione cellulare. Registrare i dati per tutti i tubi uno alla volta, acquisendo 10.000 eventi per campione.

In questa figura, la proteina della matrice mitocondriale Hsp60 e la proteina dello spazio intermembrana Timm13 sono state utilizzate come marcatori di localizzazione sub-mitocondriale. Simili a Hsp60, ma a differenza di Timm13, la ciclina B1 e la Cdk1 sono risultate protette dalla digestione con tripsina, indicando che si localizzano nella matrice mitocondriale. Come mostrato qui, mediante analisi di Western blot delle frazioni mitocondriali isolate, utilizzando le costruzioni di ciclina B1 e Cdk-1 marcate con MTS e GFP, è stata ottenuta un'overespressione della ciclina B1 e/o della Cdk-1 nei mitocondri.

Utilizzando un saggio di chase con EdU, si è dimostrato che le cellule marcate in fase S progrediscono attraverso la fase G2M e compaiono in fase G1 già dopo 4 ore nelle cellule che esprimono la ciclinaB1 mitocondriale di tipo selvatico associata a Cdk-1, rispetto a 6 ore nelle cellule trasfettate con un controllo vettoriale o con la ciclinaB1 mutante associata a Cdk-1, indicando che il potenziamento della ciclinaB1 mitocondriale associata a Cdk-1 accelera il progresso del ciclo cellulare. Seguendo questa procedura, altri metodi come la generazione mitocondriale di ATP, il consumo di ossigeno, il potenziale di membrana e la produzione di specie reattive dell'ossigeno possono essere misurati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo la localizzazione mitocondriale della chinasi del ciclo cellulare Cdk-1 altera la respirazione mitocondriale e la produzione di energia.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la localizzazione mitocondriale e le funzioni mitocondriali specifiche di una chinasi nucleare.