Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Questo articolo descrive diversi metodi di coltivazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere biofilm di pseudomonas aerogen sulla superficie apicale di cellule epiteliali vive delle vie aeree umane. Ciò si ottiene stabilendo prima un monostrato confluente di cellule epiteliali delle vie aeree su una superficie di plastica o su un vetrino di vetro. Il secondo passo della procedura consiste nel far crescere costitutivamente una coltura di batteri p aerogen, che esprimono la proteina fluorescente verde.

Il passo successivo consiste nel mettere i batteri e le cellule delle vie aeree in contatto tra loro in un ambiente statico o in una camera di flusso. La fase finale della procedura consiste nel lasciare che i biofilm batterici si sviluppino nel tempo, valutando la vitalità delle cellule delle vie aeree. Si possono ottenere risultati che mostrano la formazione di biofilm su cellule vive delle vie aeree attraverso la microscopia a fluorescenza.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei pazienti con fibrosi cistica perché questi modelli di co-coltura possono essere utilizzati per sviluppare e convalidare nuovi regimi antibiotici, in grado di eradicare i biofilm responsabili della colonizzazione cronica delle vie aeree. Nei pazienti con fibrosi cistica, il modello di biofilm di co-coltura statica utilizza cellule CFBE, che sono vie aeree umane immortalizzate. Le cellule epiteliali si sono originariamente sviluppate da un individuo con fibrosi cistica da sette a 10 giorni prima dell'inoculazione batterica seminano le cellule CFBE in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.

Seminiamo le cellule a una concentrazione di due volte 10 al quinto di cellule per pozzetto in 0,5 millilitri di terreno essenziale minimo o MEM integrato con il 10% di siero fetale bovino, due millimolari di L-glutammina, 50 unità per millilitro, penicillina e 50 microgrammi per millilitro. La streptomicina fa crescere le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. 95% aria per sette-10 giorni, cambiare il fluido ogni due o tre giorni.

Queste condizioni porteranno alla formazione di giunzioni confluenti, monostrato e strette un giorno prima dell'esperimento. Inoculare una coltura LB da cinque millilitri con pierro gen da un brodo congelato e far crescere 18 ore a 37 gradi Celsius su un rotatore. A 200 RPM utilizziamo l'aerogeno p che trasporta il plasmide PSMC 21 per l'espressione costitutiva della GFP il giorno dell'inoculazione batterica.

Rimuovere il terreno dalle cellule CFPE e aggiungere un volume uguale di terreno di microscopia, che è MEM senza rosso fenolo, integrato con due confluenze millimolari di inoculo di L-glutammina, monostrati di CFBE con posa a una molteplicità di infezione di circa 30 a uno rispetto al numero di cellule CFBE originariamente seminate per una piastra a 24 pozzetti. Ciò equivale a 1,2 volte 10 del settimo CFU per millilitro in 0,5 millilitri di MEM per. Incubare bene la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, 95% di aria per un'ora.

Dopo l'incubazione di un'ora, rimuovere la boccina e sostituirla con una nuova microscopia. Medium integrato con lo 0,4% di arginina. L'aggiunta di arginina ritarda la distruzione del monostrato abbastanza a lungo da consentire la formazione di biofilm sulle cellule CFPE.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, 95% di aria per vari punti temporali fino a circa otto ore ogni due ore. Analizzare l'integrità del monostrato CFBE e la crescita del biofilm utilizzando la microscopia. Il modello di biofilm di co-coltura con celle a flusso richiede la formazione di un monostrato confluente di cellule CFBE su un vetrino di vetro di 40 millimetri di diametro.

Per fare ciò, per prima cosa posizionare un vetrino di copertura sterile in una capsula di plastica sterile di 60 millimetri di diametro. Quindi aggiungere tre millilitri di crescita cellulare di preriscaldamento, premendo mediamente sul vetrino coprioggetti con la punta della pipetta per rimuovere eventuali bolle intrappolate al di sotto e per forzare il vetrino coprioggetti sul fondo del seme del piatto di plastica, due volte 10 al sesto di cellule CFBE per piatto. Agitare delicatamente il piatto avanti e indietro, ma evitare di roteare per evitare di centrifugare le cellule contro i lati del piatto.

Metti il piatto in un incubatore al 5% di anidride carbonica e al 95% di aria a 37 gradi Celsius per otto-10 giorni. Nutri le cellule a giorni alterni con tre millilitri di terreno di coltura fresco. In queste condizioni, le celle formeranno un monostrato confluente sul vetrino coprivetro.

Il passo successivo consiste nel preparare il ceppo batterico di aerogeno P un giorno prima dell'esperimento. Far crescere p aerogen in cinque millilitri di LB per 18 ore a 37 gradi Celsius su un rotatore. A 200 RPM, utilizziamo il ceppo aerogeno P, PO uno, che trasporta il plasmide PSM C 21 per l'espressione costitutiva della GFP il giorno dell'esperimento.

A un millilitro di coltura batterica in una provetta sterile per microcentrifuga e centrifugare a 6.000 giri/min per tre minuti. Lavare il pellet batterico due volte in un millilitro di microscopia. Medium diluire 0,5 millilitri di batteri lavati e risospesi in 4,5 millilitri di terreno di microscopia per ottenere una concentrazione di circa cinque volte 10 degli ottavi CFU per millilitro.

Ora siamo pronti per osservare le cellule CFPE in tempo reale, il che richiede una camera di imaging accoppiata a una pompa peristaltica per garantire un flusso di nutrienti per lunghi periodi di tempo. E un regolatore di temperatura, utilizziamo un apparecchio standard per celle a flusso di biofilm. Le biotecnologie FCS a due camere modificate per ospitare le cellule CFPE.

Uno dei passaggi più critici nel modello di biofilm di co-coltura di celle a flusso è l'assemblaggio della camera senza danneggiare il monitor cellulare Per assemblare la camera. Tenere la metà superiore della camera capovolta in modo che i tubi di perfusione siano visibili e allineare i fori di passaggio di una guarnizione di gomma spessa 0,75 millimetri sui tubi di perfusione. Impilare la slitta per microacquedotto fornita con la camera sopra la guarnizione in gomma, assicurandosi che il lato scanalato sia rivolto verso l'alto.

Quindi posizionare un'altra guarnizione in gomma sopra la guida. Lo spessore e la geometria interna di questa seconda guarnizione determineranno il volume della camera. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di microscopia preriscaldato al centro del vetrino.

Posizionare la camera di imaging su una superficie sterile mentre si recuperano le cellule CFPE dall'incubatore per colture cellulari. Rimuovere il terreno esaurito dal piatto e lavare una volta le cellule CFPE con tre millilitri di terreno di microscopia preriscaldato. Utilizzo di pinze lavate con etanolo.

Recuperare il vetrino coprioggetto dal piatto e abbassarlo capovolto sulla perlina di terreno per microscopia posizionata sulla camera. Il vetrino coprioggetto è ora appoggiato sulla seconda guarnizione in gomma e il monostrato di celle delle vie aeree è rivolto verso il basso. Tenendo i componenti assemblati in una mano, posizionare la base della camera sopra la pila e capovolgere rapidamente la camera in modo che tutto sia rivolto verso l'alto.

Bloccare la base in posizione ruotando l'anello. Collegare il tubo di ingresso alla pompa di microperfusione a basso flusso. Un secondo pezzo di tubo, collega la pompa a un flacone di terreno di microscopia posto nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Situato proprio accanto al microscopio. Avviare il flusso a una velocità di 20 millilitri all'ora. Questa portata rientra nella capacità di velocità di nuoto di posa.

Collegare un tubo sterile pretagliato 16th CFL ai tubi di perfusione di ingresso e uscita della camera, quindi collegare il regolatore di temperatura. Posizionare la camera assemblata sul tavolino del microscopio di un microscopio a fluorescenza invertita. Utilizzando una siringa monouso da un millilitro.

Iniettare la sospensione batterica precedentemente preparata nella camera utilizzando una valvola a due vie posta in linea tra la pompa e la camera per consentire ai batteri di legarsi alle cellule delle vie aeree. Arrestare la pompa per due ore. Dopo due ore, il flusso può essere riavviato e mantenuto a 20 millilitri all'ora.

Per il resto dell'esperimento, monitorare l'integrità delle cellule delle vie aeree mediante interferenza differenziale. Microscopia a contrasto durante l'esperimento per verificare la presenza di segni di danni al monostrato. Contemporaneamente seguire lo sviluppo di biofilm di aerogeni p marcati con GFP sulla superficie apicale delle cellule delle vie aeree.

Acquisendo immagini con un microscopio a fluorescenza confocale invertito o a campo largo sia nel saggio statico che in quello in cella di flusso, si è scoperto che il monostrato di CFPE poteva resistere alla presenza di aerogeno p fino a otto ore dopo l'inoculazione senza alcun segno di alterazione. L'integrità del monostrato epiteliale può essere valutata mediante microscopia a contrasto di fase utilizzando un invertito, come mostrato da questo esempio di un monostrato confluente di cellule CFPE coltivate su piastre di coltura tissutale. Nel tempo, l'aerogeno p produrrà tossine e fattori di virulenza che possono danneggiare il monostrato di cellule epiteliali completamente o in sezioni.

In questo esempio di monostrato di CFPE compromesso, si vedono batteri aerogeni P mostrati in verde diffondersi tra le giunzioni strette delle cellule epiteliali e ottenere l'accesso alle membrane basolaterali. La formazione di biofilm non si ottiene in genere in queste condizioni a causa del deterioramento del monostrato. Questa immagine mostra un biofilm di aerogeno troppo cresciuto osservato 24 ore dopo l'inoculazione dopo aver supportato con successo la formazione del biofilm.

Il monostrato di CFPE è stato danneggiato in modo irreparabile ed è ora praticamente assente. Il biofilm residuo che cresce come uno strato piatto di batteri viene mostrato attaccato al vetrino coprioggetto. Quando l'integrità del monostrato delle vie aeree non è compromessa.

I biofilm di aerogeno P possono formarsi e svilupparsi con successo sulla superficie apicale delle cellule delle vie aeree in entrambi i modelli di co-coltura. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa del biofilm di aerogeno p che esprime una GFP coltivato su un monostrato confluente di cellule CFPE utilizzando il modello di biofilm di co-coltura statica valutato mediante microscopia a epifluorescenza. L'immagine è una sovrapposizione del canale di contrasto del viso e del canale di fluorescenza.

L'immagine successiva mostra un aerogeno p marcato con GFP. Biofilm coltivato per sei ore su un monostrato confluente di cellule CFBE utilizzando il modello di biofilm di co-coltura con cellule a flusso per facilitare la visualizzazione delle vie aeree. I nuclei monostrato sono stati colorati con HEXT 3 33 42 prima dell'inoculazione con posa e appaiono di colore blu.

I film che si presentano come grumi verdi attaccati alla superficie apicale delle cellule CFPE sono dispersi attraverso le cellule delle vie aeree. Qui sono mostrate le tipiche strutture a fungo dei biofilm aerogenici di sei ore che si formano sul monostrato di cellule A-C-F-P-E dopo la ricostruzione 3D. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come far crescere e visualizzare con successo i biofilm batterici su un monostrato consolidato di cellule delle vie aeree utilizzando i modelli di co-coltura qui descritti e accoppiati a metodi microbiologici standard e microscopia a fluorescenza.