Name: Infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in uninterfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Impara a coltivare cellule epiteliali nasali primarie in interfaccia aria-liquido per studiare le interazioni tra coronavirus umani e ospite. Questo metodo permette di analizzare cinetiche di replicazione e risposte immunitarie innate.

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Questo studio ha le seguenti fonti di finanziamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

L'uso di campioni nasali è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania (protocollo # 800614) e dal Philadelphia VA Institutional Review Board (protocollo # 00781).
1. Infezione delle colture nasali di ALI
NOTA: L'acquisizione di campioni clinici, così come la crescita e la differenziazione di colture ALI nasali, non rientrano nell'ambito di questo documento. Metodi specifici per la coltura di cellule epiteliali nasali primarie possono essere trovati in lavori pubblicati di recente che utilizzano queste colture 18,22,23. I protocolli seguenti possono essere applicati anche alle colture ALI epiteliali nasali disponibili in commercio, se lo si desidera. I protocolli e i volumi descritti di seguito sono applicabili agli inserti transwell su piastra a 24 pozzetti (diametro 6,5 mm, superficie della membrana 0,33 cm2). Se si utilizzano colture ALI coltivate su pozzetti più grandi (ad es. piastre a 12 pozzetti, diametro 12 mm, superficie 1,12 cm2), regolare i volumi proporzionalmente per riflettere la dimensione del pozzetto.
<ol><li>Il giorno prima dell'infezione:<ol><li>Lavare le colture ALI 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per via apicale (aggiungere ~200 μL di PBS riscaldato, porre in incubatore a 37 °C per 5 minuti, aspirare PBS e ripetere).</li>
		<li>Sostituire il terreno basale (500 μL).</li>
		<li>Lasciare che le colture si equilibrino alla temperatura alla quale verranno condotte le infezioni durante la notte (cioè, se si infetta a 33 °C, posizionare le colture in un incubatore a 33 °C dopo i lavaggi PBS). NOTA: È stato riportato che gli HCoV associati al comune raffreddore come HCoV-229E e HCoV-NL63 si replicano in modo più efficiente a 33 °C. Inoltre, la temperatura dell'epitelio nasale in vivo è di 33 °C (questo differisce dalla temperatura del polmone, che è di 37 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluire il virus secondo necessità nel terreno di Dulbecco modificato (DMEM) privo di siero per ottenere la molteplicità di infezione (MOI) desiderata in un volume totale di inoculo di 50 μL. NOTA: Le infezioni sono state in genere condotte a MOI = 5 (MOI alto); tuttavia, le infezioni a MOI = 0,5 (MOI basso) sono state utilizzate anche per SARS-CoV-2 e HCoV associati al raffreddore comune, e queste si traducono in titoli virali di picco comparabili, ma con cinetica variabile (entrambi i MOI sono accettabili).</li>
	<li>Aggiungere l'inoculo per via apicale e rimettere le colture nell'incubatrice per 1 ora.</li>
	<li>Scuotere delicatamente le piastre ogni 15 minuti durante l'infezione (tenendo saldamente la piastra con entrambe le mani, oscillare avanti e indietro e da un lato all'altro per garantire un adsorbimento uniforme dell'inoculo virale).</li>
	<li>Dopo 1 ora di incubazione, aspirare l'inoculo virale e lavare ogni coltura infetta 3 volte con PBS per garantire la rimozione dell'inoculo virale (per ogni lavaggio, aggiungere 200 μL di PBS, incubare per 5 minuti e aspirare o rimuovere con una pipetta).</li>
	<li>Se lo si desidera, raccogliere il terzo lavaggio PBS per confermare l'adeguata rimozione del virus in ingresso.</li>
	<li>Sostituire il terreno basale con terreno fresco sugli ALI infetti ogni 72 ore durante l'infezione.</li>
</ol>2. Prelievo del liquido superficiale apicale (ASL) e titolazione del virus
<ol><li>In momenti predeterminati dopo l'infezione, aggiungere 200 μL di PBS alla camera apicale di ciascun transwell infetto. NOTA: I punti temporali rilevanti variano a seconda dell'HCoV di interesse e vanno da 24 ore a 192 ore dopo l'infezione (vedere la sezione dei risultati rappresentativi per i dati di replicazione virale per vari HCoV).</li>
	<li>Pipettare il PBS su e giù 5 volte per garantire la massima raccolta del virus apicalmente e raccogliere l'intero volume in una provetta per microcentrifuga (questo è il campione ASL). NOTA: L'ASL include le particelle virali sparse oltre al muco e ad altri prodotti secreti apicalmente dalle colture ALI.</li>
	<li>Quantificare il virus infettivo nell'ASL tramite il test standard della placca virale (diluire in serie campioni contenenti virus per quantificare la concentrazione di particelle virali). NOTA: I tipi di cellule e il periodo di incubazione utilizzati per il test della placca dipenderanno dal virus utilizzato: SARS-CoV-2 (cellule VeroE6); MERS-CoV (cellule VeroCCL81); HCoV-NL63 (cellule LLC-MK2); HCoV-229E (cellule Huh7). Le specifiche su come condurre i saggi delle placche virali esulano dallo scopo di questo manoscritto, ma sono state dettagliate in precedenza in una pubblicazione del Journal of Visualized Experiments (JoVE)24.</li>
	<li>Se lo si desidera, raccogliere il terreno basale in vari momenti dopo l'infezione per confermare l'assenza di virus rilasciato per via basale. Gli HCoV sono tipicamente rilasciati apicalmente dalle cellule epiteliali nasali, ma lo confermano attraverso il dosaggio della placca del terreno basale non diluito.</li>
	<li>Conservare i campioni ASL a -80 °C se il giorno del prelievo non si verifica la quantificazione mediante test della placca.</li>
</ol>3. Quantificazione del virus intracellulare
<ol><li>Dopo aver raccolto il campione di ASL, spostare ciascun transwell in una piastra pulita a 24 pozzetti precaricata con 500 μL di DMEM contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) per via basale. NOTA: DMEM con FBS al 2% viene utilizzato per stabilizzare il virus durante i successivi cicli di gelo-disgelo.</li>
	<li>Lavare ogni transwell 3 volte per via apicale con PBS per garantire la completa rimozione del virus apicale.</li>
	<li>Dopo l'aspirazione per rimuovere il lavaggio finale del PBS, aggiungere 100 μL di DMEM con FBS al 2% nello scomparto apicale.</li>
	<li>Spostare la piastra contenente i pozzetti con terreni apicali e basali in un congelatore a -80 °C e completare tre cicli consecutivi di gelo-disgelo per lisare le cellule.</li>
	<li>Dopo l'ultimo ciclo di gelo-disgelo, raggruppare i terreni apicali (100 μL) e basali (500 μL) in una provetta pulita.</li>
	<li>Centrifugare a 500 × g per 10 minuti a 4 °C per pellettare eventuali detriti cellulari.</li>
	<li>Raccogli il surnatante. Questo è il campione di virus intracellulare per la titolazione tramite il test della placca standard. NOTA: Durante il processo di raccolta si verifica una diluizione tripla rispetto alla raccolta ASL; I campioni di ASL vengono raccolti in 200 μL di PBS, mentre i campioni di virus intracellulari vengono raccolti in un volume totale di 600 μL.</li>
</ol>4. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
NOTA: Per la misurazione del TEER, è necessario utilizzare PBS integrato con calcio e magnesio (PBS + Ca 2+/Mg2+). Viene utilizzato un volt/ohmmetro epiteliale impostato per leggere in ohm (vedere la tabella dei materiali).
<ol><li>Pulire, equilibrare e svuotare lo strumento EVOM secondo le istruzioni del produttore; Utilizzare un pozzetto "vuoto" senza cellule nasali aggiunte per il blanking. Registrare la misurazione del TEER in bianco. NOTA: Se si utilizzano più virus, lo strumento EVOM deve essere pulito rigorosamente tra una condizione e l'altra per evitare la contaminazione incrociata (sono sufficienti lavaggi con etanolo al 70% seguiti da acqua deionizzata).</li>
	<li>Spostare ciascun transwell infetto in una piastra a 24 pozzetti pulita e premarcata con 500 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ per via basale per lavare il terreno basale residuo dai pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ al compartimento apicale di ciascun transwell.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS + Ca 2+/Mg2+ alla camera di misurazione Endohm-6.</li>
	<li>Spostare ciascun transwell nella camera di misura Endohm-6 e riposizionare il coperchio della camera in modo che l'elettrodo apicale poggi nei 200 μL di PBS nel compartimento apicale; l'elettrodo basale è integrato nella parte inferiore della camera Endohm-6.</li>
	<li>Consenti alla lettura EVOM di stabilizzarsi e registra la misurazione TEER grezza.</li>
	<li>Raccogliere il campione ASL come descritto sopra dopo aver effettuato la misurazione del TEER, se si desidera titolare (raccogliere i 200 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ che sono stati aggiunti per la misurazione del TEER). NOTA: La raccolta del campione ASL può indurre micro-lacerazioni nella barriera epiteliale che possono confondere le letture TEER, quindi l'ASL deve essere raccolto dopo la misurazione del TEER. Inoltre, il terreno basale non deve essere cambiato immediatamente prima delle letture TEER, in quanto ciò potrebbe influire sui valori TEER.</li>
	<li>Per convertire le letture TEER grezze in misurazioni finali in Ohm/cm2, sottrarre il valore TEER vuoto e moltiplicare questo valore per l'area della superficie della membrana del pozzetto utilizzando l'equazione (1): TEER = [Lettura TEER - valore TEER in bianco] × (superficie del pozzetto) (1)</li>
	<li>Per gli HCoV, valutare il TEER ogni 24 o 48 ore dopo l'infezione; la cinetica delle modifiche di TEER spesso varia tra i virus e richiede la risoluzione dei problemi in vari momenti.</li>
	<li>Quando si misura il TEER, includere sempre colture finte infette e valutarle in ogni momento (controllo negativo). NOTA: Per le colture simulate, le misurazioni TEER devono rimanere stabili o possono aumentare leggermente rispetto al basale dopo il completamento della differenziazione delle colture. L'area superficiale dei supporti a membrana varia a seconda delle dimensioni e del produttore dei pozzetti; I transwell a 24 pozzetti hanno in genere una superficie di 0,33 cm2.</li>
</ol>5. Misurazione della citotossicità durante l'infezione tramite il saggio della lattato deidrogenasi (LDH)
NOTA: In questo lavoro, il contenuto di LDH nei campioni di ASL è stato quantificato utilizzando un kit di rilevamento della citotossicità disponibile in commercio. Il segnale LDH in terreno basale era spesso al di sotto del limite di rilevabilità e spesso meno riproducibile rispetto all'LDH quantificato nei campioni ASL provenienti da colture infette da HCoV.
<ol><li>Preparare i controlli aggiuntivi necessari per il dosaggio dell'LDH.<ol><li>Controllo di fondo: utilizzare PBS (utilizzare PBS contenente calcio e magnesio se i campioni ASL sono stati raccolti in questo modo).</li>
		<li>Controllo positivo (valore massimo): trattare gli ALI apicalmente con Triton X-100. Raccogliere i pozzi di controllo Triton (in genere utilizzare tre colture ALI per questo in ogni punto temporale).<ol><li>Aggiungere 200 μL di Triton X-100 al 2% in PBS direttamente nel compartimento apicale del transwell.</li>
			<li>Incubare per 10-15 minuti per consentire alle cellule di lisarsi completamente.</li>
			<li>Raccogli l'intero volume come campione di soffitto Triton.</li>
		</ol></li>
		<li>Controllo negativo (basso controllo/rilascio basale di LDH): raccogliere ASL da colture ALI finte-infette derivate dallo stesso donatore di colture infette.<ol><li>Raccogliere l'ASL simulato del controllo negativo seguendo la procedura di raccolta ASL di cui sopra. NOTA: Gli stessi transwell possono essere utilizzati per questo controllo negativo per tutti i punti temporali, mentre saranno necessari nuovi transwell per ogni punto temporale per il controllo Triton.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Per consentire la quantificazione del virus sparso oltre alle letture LDH da ciascun campione ASL, caricare una piastra nera a 96 pozzetti a fondo piatto otticamente trasparente come segue:<ol><li>Diluire tutti i campioni in PBS, utilizzando 45 μL di campione e 55 μL di PBS (100 μL di volume totale).</li>
		<li>Trattare allo stesso modo i campioni di controllo positivo Triton e di controllo dello sfondo simulato. NOTA: Questa diluizione consente il carico triplicato di ciascun campione sperimentale (45 μL x 3) e un volume ASL residuo sufficiente per la titolazione tramite il test della placca.</li>
		<li>Caricare la piastra LDH in triplice: soffitto Triton, controllo dello sfondo simulato, controllo PBS e campioni sperimentali.</li>
		<li>Preparare la miscela di reazione come indicato dal produttore (soluzione colorante + catalizzatore).<ol><li>Aggiungere 100 μL di miscela di reazione a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti al riparo dalla luce.</li>
		</ol></li>
		<li>Dopo 20 minuti, misurare l'assorbanza a 492 nm.</li>
		<li>Calcolare la percentuale di citotossicità rispetto al valore del limite di Triton utilizzando l'equazione (2). Citotossicità (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparazione di colture nasali di ALI per l'imaging in immunofluorescenza (IF)
<ol><li>Spostare il transwell in una nuova piastra a 24 pozzetti e lavare 3 volte apicalmente con PBS (raccogliere il primo lavaggio PBS come ASL se si titolano; quindi, eseguire altri due lavaggi PBS per rimuovere il virus in eccesso che potrebbe ostacolare la qualità del digiuno intermittente)</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale del PBS, coprire il transwell apicale e basale con PFA al 4%.</li>
	<li>Incubare per 30 minuti per fissare in PFA al 4%, quindi rimuovere e lavare 3 volte con PBS.</li>
	<li>Eseguire l'asportazione del supporto del pozzetto contenente le celle utilizzando una lama di rasoio affilata o delle forbici.</li>
	<li>Per aumentare il numero di bersagli IF per ciascun transwell, tagliare ciascuna membrana a metà e colorare ogni metà con diverse combinazioni di anticorpi.</li>
	<li>Permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 min.</li>
	<li>Bloccare con il 10% di siero d'asina normale e l'1% di BSA in PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) per 60 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Proteggere i campioni dall'esposizione alla luce da questo passaggio in avanti.</li>
	<li>Incubare in soluzione di anticorpi primari per una notte a 4 °C. Diluire tutti gli anticorpi 1:1.000 in tampone bloccante. NOTA: Di seguito sono elencati gli anticorpi rappresentativi per la colorazione del nucleocapside HCoV, nonché i marcatori del tipo di cellula epiteliale e le colorazioni del citoscheletro (vedere la Tabella dei materiali per le informazioni sul produttore e i numeri di catalogo).<ol><li>Per la colorazione dell'antigene HCoV, utilizzare anticorpi mirati al nucleocapside SARS-CoV-2, al nucleocapside MERS-CoV e al nucleocapside HCoV-NL63.</li>
		<li>Per identificare i tipi di cellule epiteliali, utilizzare anticorpi che hanno come bersaglio il marcatore delle cellule caliciformi MUC5AC e il marcatore delle cellule ciliate di tipo IV β-tubulina.</li>
		<li>Per i marcatori del citoscheletro, utilizzare anticorpi diretti contro la falloidina (lega la F-actina) e il marcatore di adesione delle cellule epiteliali: EpCAM (CD326).</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare in soluzione anticorpale secondaria per 60 minuti a temperatura ambiente; Utilizzare coloranti anticorpali secondari diluiti 1:1.000 in tampone bloccante.</li>
	<li>Al termine della colorazione, trasferire la membrana su un vetrino con una spatola, orientare il pozzetto con il lato apicale verso il vetrino e aggiungere la soluzione di montaggio. Lasciare riposare per 15-30 minuti prima di applicare lo smalto trasparente intorno ai bordi.</li>
	<li>Acquisizione di immagini con microscopio confocale (passo dell'asse Z: 0,5 μm; scansione sequenziale)1,16,17. NOTA: Dopo la fissazione delle colture in PFA al 4% e il lavaggio con PBS, le colture fissate possono essere conservate a 4 °C per settimane o mesi prima della colorazione e della preparazione per l'imaging. Dopo la colorazione e il montaggio delle membrane, i campioni possono essere conservati a lungo termine (&gt;2 anni) a 4 °C al buio.</li>
</ol>7. Raccolta di proteine intracellulari per l'immunoblotting occidentale o di RNA per l'analisi RT-qPCR
<ol><li>Raccogliere l'ASL come descritto sopra se si quantificano i titoli virali (sezione 2 del protocollo).</li>
	<li>Spostare il pozzetto su una piastra pulita a 24 pozzetti, poiché la raschiatura della membrana può portare alla rottura dell'inserto.</li>
	<li>Per l'analisi western blot, raccogliere il lisato proteico totale in 125 μL di tampone RIPA (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS, 1% NP40) integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi.</li>
	<li>Aggiungere 125 μL di tampone RIPA al compartimento apicale e incubare per 5-10 minuti.</li>
	<li>Raschiare la membrana utilizzando un puntale per pipetta P200 per rimuovere eventuali cellule attaccate rimanenti e raccogliere l'intero volume (raschiare energicamente su tutta la superficie della membrana, quindi pipettare su e giù più volte per raccogliere l'intero campione).</li>
	<li>Incubare i campioni di lisato proteico su ghiaccio per 10 minuti, quindi centrifugare alla massima velocità (20.000 × g) per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Miscelare il surnatante con 4 tamponi per campioni Laemmli con β-mercaptoetanolo (agente riducente) secondo i protocolli del produttore.</li>
	<li>Far bollire i campioni proteici a 95 °C per 5 minuti, quindi eseguire utilizzando i tradizionali protocolli di western blotting 1,16,17.</li>
	<li>Per la raccolta dell'RNA totale, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio a scelta. NOTA: Il compartimento apicale degli inserti transwell a 24 pozzetti ha un volume massimo di ~200 μL; Pertanto, eseguiamo due lavaggi sequenziali su ciascuna coltura per raggiungere il volume totale raccomandato. I dettagli riportati di seguito corrispondono alla raccolta raccomandata di campioni di RNA in un volume totale di 350 μL.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al compartimento apicale del pozzetto infetto.</li>
	<li>Lasciare riposare per 5-10 minuti, raschiare le cellule rimanenti dalla membrana utilizzando un puntale per pipette e raccogliere l'intero volume in una provetta per microcentrifuga etichettata.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di tampone di lisi aggiuntivo al compartimento apicale del transwell e pipettare su e giù prima di raccogliere nella stessa provetta per microcentrifuga.</li>
	<li>Estrarre l'RNA secondo il protocollo del produttore.</li>
</ol>

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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118(2021).</li>
<li>Comar, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MERS-CoV+endoribonuclease+and+accessory+proteins+jointly+evade+host+innate+immunity+during+infection+of+lung+and+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119(2022).</li>
<li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+D-amino+acids+suppress+sinonasal+innate+immunity+through+sweet+taste+receptors+in+solitary+chemosensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells.</a> Science Signaling. 10 (495), (2017).</li>
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<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li>
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<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222(2019).</li>
<li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749(2020).</li>
<li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333(2013).</li>
<li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753(2020).</li>
<li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air%E2%88%92liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract%3A+Promises%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+NanoBiomed+Research%22%5BJournal%5D)">Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111(2021).</li>
<li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li>
<li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding%2C+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119(2022).</li>
</ol>

Susan Weiss fa parte del comitato consultivo scientifico di Ocugen. Noam A. Cohen è consulente per GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron e Oyster Point Pharmaceuticals e ha un brevetto statunitense, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865), e un accordo di licenza con GeneOne Life Sciences.

I metodi qui descritti descrivono un sistema di coltura epiteliale primaria in cui le cellule epiteliali nasali derivate dal paziente vengono coltivate ad un'interfaccia aria-liquido e applicate allo studio delle interazioni HCoV-ospite. Una volta differenziate, queste colture nasali di ALI ricapitolano molte caratteristiche dell'epitelio nasale in vivo, tra cui una popolazione cellulare eterogenea con cellule ciliate, caliciformi e basali rappresentate, nonché una funzione mucociliare intatta con ciglia e secrezione di ...

Ad oggi sono stati identificati sette coronavirus umani (HCoV) che causano una serie di malattie respiratorie2. Gli HCoV comuni o stagionali (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) sono tipicamente associati alla patologia del tratto respiratorio superiore e causano circa il 10%-30% dei casi di raffreddore comuni ogni anno. Sebbene questo sia il tipico fenotipo clinico associato ai comuni HCoV, questi virus possono causare malattie più significative del tratto respiratorio inferiore nelle popolazioni a rischio, inclusi bambini, anziani e individui immunocompromessi 3,4. Negli ultimi 20 anni sono emersi tre HCoV patogeni che hanno causato significative emergenze di salute pubblica, tra cui la sindrome respiratoria acuta grave (SARS)-CoV, la sindrome respiratoria mediorientale (MERS)-CoV e SARS-CoV-2. Gli HCoV letali sono associati a una patologia del tratto respiratorio più grave, il che è chiaramente illustrato dal tasso di mortalità del >34% associato ai casi di MERS-CoV (894 decessi su oltre 2.500 casi dalla sua comparsa nel 2012)5,6. È importante notare che gli HCoV letali causano anche una serie di malattie del tratto respiratorio, dalle infezioni asintomatiche alla polmonite letale, come si è visto con la pandemia di COVID-19 in corso7.
Gli HCoV, come altri patogeni respiratori, entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono un'infezione produttiva nell'epitelio nasale8. Si ritiene che la diffusione alle vie aeree inferiori sia associata all'aspirazione dalla cavità orale/nasale al polmone, dove gli HCoV causano una patologia più significativa del tratto respiratorio inferiore 9,10,11. Pertanto, il naso funge da portale iniziale per l'ingresso virale ed è la barriera primaria all'infezione con il suo robusto meccanismo di clearance mucociliare e meccanismi immunitari innati unici volti a prevenire un'ulteriore diffusione virale alle vie aeree inferiori12,13. Ad esempio, è stato riportato che le cellule epiteliali nasali esprimono livelli basali superiori alla media di interferoni antivirali e geni stimolati dall'interferone, indicando che le cellule nasali possono essere innescate per risposte precoci ai virus respiratori14,15,16.
In precedenza abbiamo utilizzato cellule epiteliali nasali primarie derivate da pazienti cresciute in un'interfaccia aria-liquido (ALI) per modellare le interazioni HCoV-ospite nel naso, dove iniziano le infezioni da HCoV. Le colture nasali di ALI sono permissive sia per gli HCoV patogeni (SARS-CoV-2 e MERS-CoV) che per quelli comuni (HCoV-NL63 e HCoV-229E) e offrono vari vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari epiteliali delle vie aeree come A549 (una linea cellulare di adenocarcinoma polmonare)16,17. Dopo il differenziamento, le colture nasali di ALI contengono una popolazione cellulare eterogenea e presentano molte delle funzioni attese dall'epitelio nasale in vivo, come il meccanismo di clearance mucociliare18. Le cellule nasali offrono anche vantaggi rispetto ai sistemi di coltura delle vie aeree inferiori (come le cellule epiteliali bronchiali umane, HBEC), poiché l'acquisizione di cellule epiteliali nasali tramite spazzolamento citologico è significativamente meno invasiva rispetto all'utilizzo di tecniche come la broncoscopia per ottenere HBEC 19,20,21.
Questo documento descrive i metodi per l'utilizzo di questo sistema di coltura ALI nasale per caratterizzare le interazioni HCoV-ospite nell'epitelio nasale. Abbiamo applicato questi metodi in lavori pubblicati di recente per confrontare SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E 1,16,17. Sebbene questi metodi e risultati rappresentativi enfatizzino lo studio degli HCoV in questo modello di cellule nasali, il sistema è altamente adattabile ad altri HCoV, così come ad altri patogeni respiratori. Inoltre, questi metodi possono essere applicati in modo più ampio ad altri sistemi di coltura ALI al fine di studiare la replicazione virale e il tropismo cellulare, nonché la citotossicità e l'induzione immunitaria innata a seguito di infezione.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor anticorpi secondari (488, 594, 647)</td><td>Invitrogen</td><td>Vari</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina sierica bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini inibitore della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il rilevamento della citotossicità</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + calcio + magnesio</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Camera di misura Endohm-6G</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM; CD326)</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore epiteliale volt/ohm (TEER) (EVOM)</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS (siero bovino fetale)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW software per l'imaging</td><td>Olympus</td><td>versione 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 (coronavirus umano, NL63)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo nucleocapside HCoV-NL63</td><td>Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione Hoescht</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tampone campione Laemmli (4x)Cellule</td> <td>BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>LLC-MK2</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>Per titolare HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV (Coronavirus umano, Sindrome respiratoria mediorientale Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td><td>BEI Risorse&nbsp;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>MERS-CoV anticorpo nucleocapside</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>MUC5AC anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAB91539</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 colorante</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack (inibitori della fosfatasi)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>Qualsiasi lettore di piastre o lettore ELISA è sufficiente; deve essere in grado di leggere l'assorbanza a 492 nm</td></tr><tr><td>di tampone RIPA (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% desossicolato; 0,1% SDS; 1% NP40)</td><td>Thermo Fisher</td><td>89990</td><td>Può essere preparato internamente o acquistare</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-52281</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo nucleocapside SARS-CoV-2</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific BP151100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo IV &beta;- anticorpo tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>Cellule VeroCCL81</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Per titolare le cellule MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>Per titolare SARS-CoV-2</td></tr></tbody></table>

infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in un'interfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

Negli ultimi 20 anni sono emersi tre coronavirus umani ad alta patogenicità (HCoV) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) - che hanno causato significative crisi di salute pubblica. Quattro HCoV aggiuntivi causano una parte significativa dei casi di raffreddore comune ogni anno (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), evidenziando l'importanza di studiare questi virus in sistemi fisiologicamente rilevanti. Gli HCoV entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono l'infezione nell'epitelio nasale, il sito primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Utilizziamo un sistema di coltura epiteliale nasale primaria in cui i campioni nasali derivati dal paziente vengono coltivati in un'interfaccia aria-liquido (ALI) per studiare le interazioni ospite-patogeno in questo importante sito sentinella. Queste colture ricapitolano molte caratteristiche delle vie aeree in vivo , compresi i tipi di cellule presenti, la funzione ciliare e la produzione di muco. Descriviamo i metodi per caratterizzare la replicazione virale, il tropismo della cellula ospite, la citotossicità indotta dal virus e l'induzione immunitaria innata in colture nasali di ALI a seguito di infezione da HCoV, utilizzando un recente lavoro che confronta HCoV letali e stagionali come esempio1. Una maggiore comprensione delle interazioni ospite-patogeno nel naso ha il potenziale per fornire nuovi bersagli per terapie antivirali contro HCoV e altri virus respiratori che probabilmente emergeranno in futuro.

Le cifre rappresentative sono parzialmente adattate dai dati che si possono trovare nel manoscritto Otter et al.1. Le colture nasali di ALI derivate da quattro o sei donatori sono state infettate con uno dei quattro HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E) secondo i protocolli sopra descritti e i titoli virali medi apicali per ciascun virus sono illustrati nella Figura 1A. Mentre tutti e quattro questi HCoV si replicano in modo produttivo nelle colture ALI n...

L'epitelio nasale è il sito di barriera primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare le cellule epiteliali nasali primarie cresciute come colture di interfaccia aria-liquido (ALI) per caratterizzare le interazioni coronavirus-ospite umano in un sistema fisiologicamente rilevante.

Infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in un'interfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

I protocolli qui descritti affrontano questioni chiave come la cinetica di replicazione, il tropismo delle cellule ospiti, l'induzione immunitaria innata e l'induzione della citotossicità nell'epitelio nasale durante le infezioni da coronavirus umani. Questo protocollo consente lo studio delle interazioni tra l'ospite e il coronavirus umano in un microambiente organoide che ricapitola da vicino le caratteristiche dell'epitelio nasale in vivo, compresa la sua popolazione cellulare eterogenea e le funzioni mucociliari. Questa tecnica può essere applicata ad altri sistemi di coltura ALI, come quelli derivati dalle vie aeree inferiori.Inoltre, il sistema può essere utilizzato per imitare stati clinici di malattia come le vie aeree asmatiche o cistiche della fibrosi. Far crescere e differenziare l'interfaccia aria-liquido nasale, o colture ALI, in pozzetti con una camera basale e una apicale. Espandere le cellule sinonasali umane dissociate in condizioni sommerse, dopodiché rimuovere il terreno dalla camera apicale per consentire la differenziazione delle colture in un'interfaccia aria-liquido.Il giorno prima dell'infezione, lavare apicalmente le colture di ALI con soluzione salina tamp

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Immunologia e Infezioni

Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all'interfaccia aria-liquido, un biologicamente...

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Descriviamo l'isolamento rapido di primarie murine di tipo II le cellule epiteliali alveolari (AECII) per selezione di citometria di flusso negativo. Questi AECII mostrano alta vitalità e purezza e sono adatte per una vasta gamma di studi funzionali e molecolari riguardanti il ​​loro ruolo in condizioni respiratorie come le malattie autoimmuni o infettive.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Fonte: Otter, C. J., et al. Infezione di cellule epiteliali nasali primarie coltivate a interfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni tra coronavirus umano e ospite. J. Vis. Exp. (2023)Questo video dimostra la crescita del coronavirus in cellule epiteliali nasali umane coltivate a un'interfaccia aria-liquido, simulando l'infezione e la replicazione virale nella cavità nasale umana.

Crescita virale in cellule epiteliali nasali umane coltivate all'interfaccia aria-liquido

I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista dei Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

Cellule epiteliali nasali, ottenuti attraverso superficiale raschiare la biopsia di volontari umani, vengono ampliati e trasferite su inserti di coltura tissutale. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono coltivate a interfaccia liquido aria, ottenendo colture di cellule ciliate e non ciliate. Colture di cellule epiteliali nasali differenziate offrono modelli sperimentali validi per lo studio della mucosa respiratoria.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

Il virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) può causare grave bronchiolite nei neonati. Parte della patogenesi della malattia grave da HRSV è causata dalla risposta immunitaria dell'ospite. La stimolazione delle cellule immunitarie umane primarie con HRSV fornisce un sistema modello rapido e riproducibile per studiare l'attivazione delle vie infiammatorie e delle infezioni.

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Questo protocollo descrive in dettaglio un'indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.

Cellule epiteliali nasali umane primarie: biobanking nel contesto della medicina di precisione

Questo articolo descrive la generazione di un modello complesso di barriera multicellulare delle vie aeree composto da epitelio polmonare derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), mesenchima, cellule endoteliali e macrofagi in una coltura di interfaccia aria-liquido.

Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da iPSC per modellare l'integrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare

Impara a coltivare cellule epiteliali nasali primarie in interfaccia aria-liquido per studiare le interazioni tra coronavirus umani e ospite. Questo metodo permette di analizzare cinetiche di replicazione e risposte immunitarie innate.

Infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in uninterfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite (Video) | JoVE Journal

Infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in un'interfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite

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