Name: Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri un sistema di infezione basato su inserti a membrana permeabile per studiare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule ospiti. Questo metodo modella le interazioni ospite-patogeno in modo fisiologicamente rilevante.

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Ringraziamo i nostri colleghi del Lee Lab, che ci hanno fornito preziose informazioni e competenze che hanno aiutato notevolmente questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto dal Young Innovator Award del National Institute of Health, assegnato a S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty è supportato dalla Albertus Magnus Fellowship fornita dal Dr. Robert C. Boguslaski e da un assistente didattico presso l'Eck Institute for Global Health dell'Università di Notre Dame.

1. coltura batterica <ol><li> Generare ceppi mutanti isogeni da utilizzare per lo studio della specifica fattore secreto di interesse 21. Nota: I GASM1T1 5448 ceppi utilizzati per questi esperimenti inclusi WT GAS &#39;, una saga Δ gatto SLS-carente mutante (abbreviato nel testo come Δ Saga), e una saga ceppo complementato (abbreviato nel testo come Δ Saga + Saga) 21. </li><li> Preparare colture liquide durante la notte di ceppi batterici di interesse. Grow GAS M1T1 5448 ceppi a -10 ml di Todd-Hewitt brodo a 37 ° C per 16-20 ore prima di infettare cellule umane. </li><li> Centrifuga colture batteriche durante la notte (2,400 RCF per 10 minuti) e risospendere in media batterica fresca. Nota: Resuspension nello stesso volume come le culture overnight sono state coltivate in (5-10 ml) generalmente produce un desiderabile densità ottica iniziale. </li><li> Normalizzare colture batteriche aconcentrazioni iniziali uguali diluendo culture risospesi in mezzo batterica aggiuntiva fino alla stessa densità ottica a 600 nm (OD 600) è ottenuto per tutti i ceppi da testare (OD 600 di circa 1,0 è raccomandato per convenienza). Nota: In questi studi, colture batteriche fase stazionaria sono stati usati per infettare le cellule ospiti subito dopo la normalizzazione. Tuttavia, come alcuni ceppi di batteri uscita fase stazionaria nonsynchronously può essere più appropriato per iniziare infezioni host con culture fase log se questo è risultato essere il caso per i ceppi di interesse. </li><li> Prima di ulteriori analisi, effettuare un conteggio delle colonie test per determinare le unità formanti colonie (CFU) per millilitro presente nelle colture di partenza in modo che la molteplicità di infezione (MOI), o il rapporto di batteri per cellula ospite, può essere determinato. <ol><li> Preparare 1 ml diluizioni seriali di colture batteriche che sono stati normalizzati al densi ottica desiderataty in tampone fosfato (PBS) o opportuno terreno di coltura batterica (Todd-Hewitt brodo è stato utilizzato in questi studi). Preparare diluizioni che vanno da 10 -1 a 10 -6 per produrre almeno un set di piastre di agar con colonie numerabili (30-300 colonie). Eseguire tutte le diluizioni in triplice copia. </li><li> Trasferire 100 ml di ogni diluizione in serie su una piastra di agar contenente mezzo appropriato per le specie batteriche in fase di analisi. Nota: Todd-Hewitt agar è stato usato in questi studi. </li><li> Utilizzare un bicchiere o spreader batterica plastica per distribuire uniformemente l&#39;aliquota di 100 microlitri tutta la superficie della piastra di agar, e continuare a diffondere fino a quando il liquido è stato assorbito nel agar. Eseguire sotto fiamma con tecnica sterile. </li><li> Incubare le piastre di agar a 37 ° C durante la notte o fino alla comparsa colonie numerabili. </li><li> Contare le colonie che crescono su ciascuna piastra e calcolare i CFU / ml nella cultura originale dalla seguente formula: numero di colonie x inverso del volume di diluizione / culture seriale placcato in millilitri. es (200 colonie x 1/10 -5 diluizione) / 0,1 ml placcati = 2,0 x 10 8 UFC / ml </li></ol></li></ol> 2. Host colture cellulari <ol><li> Ottenere una linea di cellula ospite appropriato per le analisi desiderati. Nota: HaCaT cheratinociti epiteliali umane 29, un gentile dono da V. Nizet, sono stati utilizzati per questi studi. <ol><li> Mantenere le cellule HaCaT in 100 piatti della cultura mm Modified Media Dulbecco di Eagle (DMEM) con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino (FBS). Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol> 3. Host cellulare L&#39;infezione da permeabile membrana inserto Sistema <ol><li> cellule piastra in opportune piastre di coltura dei tessuti e permettere loro di crescere fino a raggiungere il 90% di confluenza. Nota: Le celle HaCaT utilizzati in questi studi generalmente raggiungano la confluenza entro 2-3 dAYS dopo la placcatura. <ol><li> Per la raccolta lisato (ad esempio analisi e dosaggi determinazione adenosina trifosfato (ATP) di segnalazione), piastra HaCaT in 6 piatti pozzetti alla densità di semina di circa 3 x 10 5 cellule / pozzetto. </li><li> Per gli esperimenti di imaging di immunofluorescenza, le cellule piastra su vetrini sterili all&#39;interno di 6 piatti e ad una densità di semina di circa 3 x 10 5 cellule / pozzetto. </li><li> Per etidio omodimero permeabilizzazione della membrana e saggi di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), piastra HaCaT in 24 piatti e ad una densità di semina di circa 5 x 10 4 cellule / pozzetto. </li></ol></li><li> Immediatamente prima del trattamento, lavare le cellule con 1x PBS sterile. </li><li> Applicare terreno di coltura fresco per le cellule. Per le condizioni qui descritte, applicare 2 ml di mezzo per pozzetto per 6 pozzetti o 0,5 ml di mezzo per pozzetto per 24 pozzetti. Se i trattamenti farmacologici sono in fase di sperimentazione, mescolare con terreno fresco e applicare durante questo step. Nota: alcuni saggi possono richiedere media alternativi. Ad esempio, il fenolo concentrazioni rosso e alta siero interferiscono con il test di rilascio di LDH, rosso fenolo privo DMEM integrato con 1% di albumina sierica bovina (BSA) (w / v), 2 mM L-glutammina e 1 mM di sodio piruvato era utilizzata per questi esperimenti. </li><li> Dopo è stato applicato mezzo fresco, posizionare accuratamente sterile 0,4 micron inserto membrana permeabile in ciascun pozzetto. Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso laminare, e utilizzare pinze sterili per trasferire l&#39;inserto membrana permeabile in ogni pozzetto. </li><li> Applicare fresco mezzo di coltura cellulare per la camera superiore di ogni pozzetto secondo le istruzioni del produttore. Per le condizioni qui descritte, applicare 1 ml di mezzo per pozzetto per 6 pozzetti o 0,1 ml di mezzo per pozzetto per 24 pozzetti. </li><li> Applicare un volume adeguato di colture batteriche normalizzate (vedi paragrafo 1) alla camera superiore del sistema di inserimento membrana permeabile. Utilizzare media batterica per contr non infettotrattamenti olo. Per i risultati qui descritti, aggiungere 25 ml di culture normalizzati per camera per 24 pozzetti e aggiungere 100 ml di culture per camera per 6 pozzetti. Nota: In questi studi, wild-type o GAS mutante è stato applicato alle cellule ospiti ad una MOI di 10. MOI è stata calcolata in base al numero di cellule eucariote finali (ad esempio 2 x 10 6 cellule / pozzetto), tale che a 10 volte il numero di batteri sono stati aggiunti per cellula ospite all&#39;inizio del periodo di infezione (ad esempio 2 x 10 7 CFU per bene). Appropriato MOI varierà con diverse specie batteriche e con le analisi di follow-up desiderati. Nota: Oltre a utilizzare media batterica per i controlli non infetti, altri controlli utili per certe applicazioni di questa tecnica possono includere batteri calore uccisi o medio batterica speso per il confronto. </li><li> Incubare le cellule infettate a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> Collezione 4. Campione &lt;ol&gt; <li> Per raccogliere mezzo di coltura cellulare, lisati cellulari host o vetrini con cellule intatte per il follow-up analisi, cominciare togliendo con cura l&#39;inserto membrana permeabile con pinza sterile. </li><li> Per la valutazione della protiens Host secreto: <ol><li> Raccogliere il mezzo dalla camera inferiore in provette da 1,5 ml. Evitare di disturbare il monostrato durante la raccolta. </li><li> Centrifugare i campioni a 14.000 rcf per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Rimuovere tutti ma 50 ml di surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e conservare a -20 ° C o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Per la valutazione della Cell Host Lystates: <ol><li> Aspirare delicatamente il supporto sopra il monostrato di cellule ospiti. Evitare di disturbare il monostrato, in quanto ciò potrebbe comportare la perdita del campione. </li><li> Lavare le cellule una volta con PBS 1x. </li><li> Delicatamente aspirare PBS. Applicare immediatamente un volume adeguato di tampone di lisi ghiacciato per raggiungere la concentrazione proteina desiderata, e incubare lacampioni in ghiaccio per 15 min. Applicare tra 200 microlitri e 350 ml di tampone di lisi per pozzetto di ciascuna piastra 6 bene per ottenere concentrazioni proteiche tra 0,5 e 1,5 mg / ml. Nota: Il tampone di lisi utilizzato in questi studi era composta di acqua deionizzata, 1% (v / v) Nonidet P40 di riserva, un cocktail inibitore fosfatasi, e un cocktail di inibitori delle proteasi. reagenti specifici sono elencati nella sezione Materiali e attrezzature. </li><li> Utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule dalla superficie della piastra di ogni pozzetto e pipettare l&#39;intero contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare i campioni a 14.000 rcf per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Per valutare i componenti lisato solubili, rimuovere il surnatante in una nuova provetta e conservare a -20 ˚C o utilizzare immediatamente. </li><li> Per valutare i componenti lisato insolubili nucleari o di altri, riservare il pellet e conservare a -20 ˚C o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Per la valutazione mediante immunofluorescenza Imaging: <ol><li> Comemedia dei pirati e lavare le cellule in 1x PBS freddo. </li><li> Fix cellule durante la notte in% paraformaldeide (PFA) soluzione 4 in PBS (w / v). Nota: In questi studi, 1 ml di PFA è stato aggiunto per pozzetto di ogni 6 pozzetti. </li></ol></li></ol> 5. Applicazioni suggerite <ol><li> Host Analisi di trasduzione del segnale mediante SDS-PAGE e Western Blotting <ol><li> Raccogliere lisati cellulari host come descritto nel paragrafo 4.3. </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​di ciascun lisato campione da acido bicinconinico (BCA) saggio o equivalenti utilizzando standard di proteine ​​30. </li><li> Normalizzare concentrazioni di proteine ​​tra i campioni prima del caricamento e l&#39;esecuzione dei campioni su un gel di poliacrilamide 4-15% o alternativa appropriata 31. <ol><li> Normalizza concentrazioni di campione pipettando la stessa quantità di proteine ​​di ogni campione (ad esempio 20 mg) in una nuova provetta da 1,5 ml e aggiungendo variabile volumi di tampone di lisi (polmone = volume totale - volume di campioneaggiunto) a ciascuna provetta per rendere il volume totale (esempio 50 microlitri) e finali equivalente concentrazione proteica di tutti i campioni. </li></ol></li><li> campioni di trasferimento in un fluoruro di polivinile (PVDF) membrana (o equivalente). Per i risultati descritti qui, campioni di trasferimento a 25 volts per 2 ore prima di aumentare la tensione a 70 volt per altri 45 min. Utilizzare buffer di trasferimento composto da 200 mm di base Tris, 1,5 M glicina e 20% di metanolo (v / v) in acqua deionizzata. </li><li> membrane di blocco in 5% di BSA + 0,1% di Tween 20 in Tris Buffered Saline (TBS). Regolare pertanto basato su raccomandazioni del produttore per l&#39;anticorpo da utilizzare. </li><li> Incubare membrane con anticorpi primari notte a 4 ° C. Utilizzare al produttore raccomanda di diluizione. </li><li> Lavare le membrane per 1,5 ore in TBS + 0,1% Tween 20; aggiornare tampone ogni 10-15 minuti. </li><li> Incubare con perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 5000 per 1,5 ore a camera temperature. </li><li> Lavare le membrane per 1,5 ore in TBS + 0,1% Tween 20; aggiornare tampone ogni 10 - 15 minuti. </li><li> Incubare membrane con il reagente di rilevamento chemiluminescenza prima di sviluppare in un film in base alle istruzioni del produttore. Altri metodi di rilevamento possono essere utilizzati come desiderato. </li></ol></li><li> Cell Host immunofluorescenza colorazione e Imaging <ol><li> Fissare vetrini contenenti cellule ospiti, come descritto nel paragrafo 4.4. </li><li> Rimuovere la soluzione PFA e lavare vetrini contenenti cellule trattate due volte in PBS, aspirare tra un lavaggio. Nota: PFA è altamente tossico e deve essere smaltito in modo appropriato. </li><li> Bloccare le lamelle per 2 ore a temperatura ambiente in PBS con 1% (w / v) di siero normale di capra, 2% (v / v) Triton X-100, e 0,5% (v / v) Tween 20. </li><li> Lavare coprioggetto con PBS per 30 minuti, rinfrescante il buffer ogni 10 min. </li><li> Incubare i vetrini con anticorpo primario con un rapporto di 01:50 (o come raccomandato dal costruttore) nel bloccare solution notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti per 1,5 ore in PBS, rinfrescante il tampone ogni 30 min. </li><li> Incubare i vetrini per 2 ore a temperatura ambiente in anticorpo secondario (capra anti-IgG di coniglio AlexaFluor488 stato usato per questi studi) con un rapporto 1: 200 di anticorpi soluzione bloccante. </li><li> Lavare lamelle per 1 ora, rinfrescante il buffer ogni 20 min. </li><li> Applicare macchie desiderati. Nota: Questi studi utilizzati DAPI (macchia nucleare) e rodamina-falloidina (actina macchia) con rapporti di 1: 1.000 in soluzione bloccante. </li><li> Incubare coprioggetto con macchie nucleari e actina per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare coprioggetto in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, rinfrescante il tampone ogni 10 min. </li><li> Montare i coprioggetti su vetrini con mezzo di montaggio. </li><li> Consentire coprioggetto per impostare sulle diapositive durante la notte prima della sigillatura e di imaging. Per i risultati qui descritti, raccogliere le immagini su un microscopio a fluorescenza USIng un obiettivo standard di 20X. Utilizzare il software ImageJ e di imaging microscopio per elaborare le immagini catturate. </li></ol></li><li> Etidio omodimero Cell Death Assay <ol><li> Aspirare media da ciascun pozzetto e lavare le cellule due volte con PBS sterile. </li><li> Applicare 4 mM etidio omodimero-1 in PBS. </li><li> Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li><li> Determinare il livello di fluorescenza utilizzando un lettore di piastre impostato a 528 nm di eccitazione e 617 nm di emissione con un valore di cut-off di 590 nm. </li><li> Aggiungere 0,1% (w / v) saponina ciascun pozzetto dopo la lettura iniziale e lasciare che la piastra ad incubare per altri 20 minuti a temperatura ambiente (con dondolo) prima di leggere la piastra una seconda volta con le stesse impostazioni. </li><li> Determinare cento permeabilizzazione della membrana singolarmente per ogni pozzetto dividendo la fluorescenza iniziale lettura (post-trattamento) dal secondo fluorescenza lettura (post-saponina). </li></ol></li><li> ATP Determinazione Assay <ol><li&gt; Raccogli lisati come descritto nel precedente paragrafo 4.3. </li><li> Normalizzare i livelli di proteine ​​nei lisati tramite saggio BCA o simile 30. </li><li> Determinare i livelli cellulari di ATP utilizzando un kit di determinazione ATP luminescenza-based o equivalente in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Normalizzare i valori trattati ai rispettivi campioni di controllo non infetti. </li></ol></li><li> LDH saggio di rilascio <ol><li> Dopo l&#39;infezione, raccogliere surnatanti come descritto nel paragrafo 4.3. </li><li> Valutare il rilascio di LDH utilizzando un kit di rilevamento citotossicità per il rilascio di LDH secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui viene descritto un metodo che utilizza un sistema di un&#39;infezione inserto basato membrana permeabile per esaminare gli effetti della tossina batterica Streptolisina S sui cheratinociti epiteliali umane in un sistema in vitro. Questo protocollo può essere adattato per lo studio di altri fattori di virulenza batterici secreti e tipi di cellule ospite alternativi. Questo sistema recentemente sviluppato offre diversi vantaggi rispetto ai metodi sperimentali che utilizzano le tossine purificate o surnatanti batterici filtrati 1 - 3,8,18 - 20. Il sistema basato inserto membrana permeabile fornisce una dose mantenuta costantemente della tossina batterica pertinenti alle cellule ospiti come viene prodotto, che consente l&#39;attività di tossina massima da mantenere e aumenta anche la coerenza tra esperimenti. Inoltre, questo sistema imita più da vicino le condizioni fisiologiche, consentendo il fattore secreto di accumulare nel tempo l&#39;infezione progredisce e eliminari la necessità di selezionare arbitrariamente concentrazioni di tossine specifiche da applicare alle cellule ospiti. Inoltre, questo sistema fornirebbe inoltre mezzi per gli investigatori per valutare se un fattore batterica di interesse viene trasportato al cellule ospiti in maniera contatto-dipendente. Contatto-dipendenza è spesso testato attraverso la generazione di mutanti batterici isogenici carenti di aderenza o attraverso l&#39;uso di reagenti che impediscono l&#39;aderenza. Il sistema qui descritto fornirebbe una semplice alternativa per integrare o sostituire questi approcci tradizionali. Oltre alle applicazioni testate descritti nella sezione 5 del protocollo, altre applicazioni per cui questo sistema l&#39;infezione potrebbe essere facilmente adattato comprendono la raccolta di campioni per gli array di citochine e saggi ELISA. In entrambi i casi, un protocollo simile a quello descritto per saggi di rilascio LDH può essere seguita. Sebbene non illustrato, questo sistema è stato utilizzato per raccogliere efficacemente campioni cellula ospite per essere unnalyzed mediante citometria di flusso. In questa applicazione, l&#39;inserto membrana permeabile viene rimosso dopo il periodo di infezione, le cellule vengono lavate per rimuovere mezzo di coltura cellulare, e tripsina viene applicato per consentire la raccolta delle cellule per l&#39;analisi. La separazione fisica dei batteri da cellule ospiti è particolarmente utile per questa applicazione perché aiuta a prevenire la formazione di grandi aggregati compresi batteri aderito e cellule ospiti che altrimenti potrebbero interferire con il conteggio delle cellule accurata dal citofluorimetro. Sebbene risposta dell&#39;ospite molto consistenti sono stati osservati quando si confrontano i risultati degli studi infezione inserto basato membrana permeabile con studi infezione diretti tradizionali, alcune differenze notevoli nella cinetica di queste risposte dell&#39;ospite sono stati osservati 21. Per esempio, cambiamenti nella segnalazione host e membrane a base di citotossicità prendono 30-50% più a verificarsi nel modello di infezione inserto basato membrana permeabile che corrispondendo modelli di infezione diretti. Poiché il sistema di inserimento basato membrana permeabile richiede supporto da applicare ai compartimenti superiore e inferiore di ogni pozzetto, il sistema sviluppato per gli studi descritti qui richiesto un aumento del 30% in volume medio totale per pozzetto rispetto ai corrispondenti modelli di infezione diretti utilizzati in precedenza 21. Questa differenza di volume medio totale, accoppiato con l&#39;aumento della distanza tra i batteri e cellule ospiti quando è vietato contatto diretto, probabilmente aumenta il tempo necessario per SLS diffondere attraverso il mezzo per raggiungere cellule ospiti e suscitare gli effetti osservati. Inoltre, il sistema basato su inserto membrana permeabile rimuove molti fattori di virulenza GAS che possono contribuire a ospitare i danni delle cellule; l&#39;assenza di questi fattori aggiuntivi di questo sistema è anche in grado di contribuire al ritardo nella morte della cellula ospite e l&#39;avvio di eventi di segnalazione di accoglienza rispetto al contagio diretto 21. Questi fattori devono essere consideratidurante la progettazione di esperimenti per valutare gli altri componenti batteriche secrete. Per identificare le condizioni più significativi per testare gli effetti di fattori batterici secreti in cellule ospiti, testare una serie di punti di tempo per ogni applicazione del sistema dell&#39;infezione inserto basato membrana permeabile è raccomandato. È importante considerare in quali condizioni il fattore di virulenza di interesse specifico è ottimale prodotti (per esempio fase log, fase stazionaria, in risposta a certi segnali ambientali, etc.) al fine di osservare con successo i suoi effetti. In esperimenti focalizzati sulla valutazione cambiamenti nelle proteine ​​di segnalazione di accoglienza, è stato necessario selezionare i punti temporali che hanno permesso un tempo adeguato per SLS per raggiungere le cellule ospiti e ad essere prodotto in quantità sufficienti per indurre la segnalazione cambia 21. Allo stesso tempo, la valutazione delle variazioni ospitante segnalazione doveva essere condotto prima permeabilizzazione della membrana SLS indotta, come questo effetto complicates la raccolta dei lisati cellulari di accoglienza per l&#39;analisi. La morte cellulare indotta da SLS potrebbe essere ottimale osservato in entrambi i modelli di infezione inserto a base di membrana diretta e permeabile diverse ore dopo l&#39;inizio degli eventi di segnalazione segnalati 21. Inoltre, nella selezione punti di tempo di interesse, è anche importante garantire che i batteri in fase di studio sono in grado di penetrare la membrana porosa inserto durante il periodo di studio. La produzione di alcuni componenti batterici per un periodo prolungato può compromettere l&#39;integrità della membrana e permettere il passaggio di batteri al vano inferiore. Per determinare se questo è un problema potenziale nel sistema di interesse, i ceppi batterici da studiare possono essere applicati alla camera superiore del sistema basato inserto membrana permeabile ad una serie di punti temporali. Ad ogni punto di tempo, l&#39;inserto può essere accuratamente rimosso e il mezzo dalla camera inferiore può essere raccolto e utilizzato in una colonia co normalesaggio unting (vedi paragrafo 1.5). Se nessuna colonia sono formate dal mezzo di coltura cellulare nel vano inferiore, la membrana inserto può essere assunta da impedire efficacemente il passaggio di batteri al punto di tempo e carica batterica testato. Un altro componente disegno sperimentale che è probabile che richiedono ottimizzazione per l&#39;analisi efficace dei fattori batterici secreti è la molteplicità di infezione (MOI). La MOI si riferisce al rapporto di cellule batteriche per cellula ospite, ed è quindi influenzata dalla confluenza cellula ospite al momento dell&#39;infezione e per il numero di unità formanti colonie batteriche (CFU) applicato alle celle. In questi studi, le cellule cheratinociti sono state coltivate al 90% di confluenza, che ha permesso queste cellule a formare un monostrato coeso con giunzioni strette intatti. Riflessivo considerazione dell&#39;organizzazione fisiologica delle cellule ospiti da studiare è necessario selezionare una confluenza appropriato per esperimenti di infezione. Una volta che un appropril numero iate delle cellule ospiti per pozzetto è determinato, un CFU batterica adatta può essere calcolato in base al largo della MOI desiderato. Negli studi qui descritte, GAS è stato applicato per ospitare cellule ad una MOI di 10. appropriato MOI varierà con batteri diversi e con le analisi di follow-up desiderati. Un basso dall&#39;inizio MOI è in genere più fisiologicamente rilevanti e permette per il fattore di batteri di interesse di accumulare abbastanza lentamente per cogliere sottili cambiamenti nella segnalazione della cellula ospite prima di cambiamenti drammatici nella vitalità della cellula ospite sono evidenti. MOI superiori sono utilizzati in molti studi di valutazione citotossicità, ma questo effetto può essere ottenuta anche iniziando con un basso MOI e permettendo l&#39;infezione di progredire per un periodo di tempo più lungo. È importante determinare un accurato CFU per corollario densità ottica per tutti i ceppi batterici da testare, come mutanti isogeni possono avere un tasso di crescita alterata rispetto ai batteri wild-type e può quindi richiedere che un CFU superiore o inferiore è aggiunto per pozzetto pergarantire un opportuno confronto della risposta dell&#39;ospite tra i ceppi. Nei casi in cui le cellule ospiti di mammifero in fase di studio sono in grado di uccidere batteri o inibire la crescita o se si sospetta la crescita nonsynchronous tra ceppi batterici, può anche essere utile effettuare studi per valutare la carica batterica finale al termine del periodo di infezione. Ciò potrebbe essere realizzato raccogliendo il contenuto dell&#39;inserto permeabile ed eseguendo un test conteggio delle colonie simile a quella descritta nella sezione 1.5 della procedura. Selezione pozzi opportunamente dimensionati per il dosaggio desiderato è anche importante per ottenere risultati ottimali. inserti membrana permeabile sono disponibili in una varietà di formati, ma i risultati più consistenti per gli studi qui riportati sono stati osservati con inserti progettati per il 24 e ben 6 piastre di coltura dei tessuti e. Queste dimensioni inserto sono relativamente facili da maneggiare con pinza sterile, e la facilità di manipolazione è fondamentale nel prevenireing trasferimento indesiderato di batteri dal vano superiore al vano inferiore del pozzo. Per gli esperimenti che coinvolgono la raccolta dei lisati cellulari ospitanti, 6 piatti e forniscono un numero di cellulare adeguato per condizione per la maggior parte delle analisi e sono grandi abbastanza per ospitare raschietti cellulari per la raccolta dei campioni. Per i saggi di citotossicità in cui le cellule ospiti rimangono aderenti e sono etichettati con un fluorescenti o tintura colometriche che può essere misurata in un lettore di piastre (ad esempio etidio saggio omodimero, trypan saggio di esclusione blu), l&#39;uso di una piastra ben 24 con gli inserti corrispondenti è consigliato. Per gli esperimenti in cui mezzo di coltura cellulare verrà raccolto e analizzato (ad esempio il rilascio di LDH, studi citochine) il 24 bene o 6 piatti e possono essere utilizzati, anche se i pozzi più piccoli in genere forniscono adeguati volumi di campione per queste analisi e ridurre al minimo l&#39;uso della richiesta reagenti. Nel complesso, il metodo è molto versatile e può essere adattato a seconda delle necessità per preparare samples per numerose applicazioni di follow-up.

La comprensione della funzione di fattori di virulenza batterica nel contesto di infezione cellula ospite è un obiettivo importante della ricerca patogenesi batterica. Molti batteri patogeni secernono attivamente tossine e altri fattori solubili per facilitare la distruzione del tessuto ospite, avviare le modifiche segnalazione in cellule ospiti o manipolare risposte del sistema immunitario nel corso dell&#39;infezione 1 - 10. Sebbene metodi sono stati sviluppati per purificare successo e produrre molti di questi importanti fattori di virulenza di studio, alcuni prodotti batterici hanno strutture uniche o estese modificazioni post-traduzionali che li rendono candidati recalcitranti per metodi di purificazione e quindi non può essere studiata isolatamente utilizzando sistemi in vitro . Ad esempio, streptococco di gruppo A, il batterio patogeno responsabile di una miriade di infezioni che vanno dalla faringite alla fascite necrotizzante e la sindrome da shock tossico, produce un secretotossina batterica noto come Streptolisina S (SLS) 11 - 17. Questo peptide ribosomally prodotto è codificata dal gene cluster Streptolisina S associato (SAG), e il prodotto maturo è stimata in 2,7 kDa di dimensioni 14 - 17. Il protossina, codificata da Saga, si modifica post-traduzionale da diversi enzimi (SAGB, SAGC, e SAGD) per produrre la forma funzionale matura 15 - 17. La complessità di queste modificazioni post-traduzionali accoppiati con insolita sequenza aminoacidica della tossina hanno reso la tossina incompatibile con tutti gli sforzi delucidazione di purificazione e di struttura che sono state tentate fino ad oggi 15,17. Queste sfide hanno sforzi complicate per determinare il ruolo specifico di questa tossina nella patogenesi host. Nei casi in cui la preparazione delle tossine purificate o altri fattori secreti è complesse o non è possibile, meccanismi perchiarire la funzione di questi prodotti sono stati tradizionalmente studiate attraverso la preparazione di surnatanti batterici filtrati, che vengono poi applicati alle cellule ospiti 18 - 20. Ci sono diverse sfide associate con questa tecnica. Innanzitutto, molti di questi fattori secreti, tra SLS, non mantengono la massima attività o coerenti quando immagazzinato e usato per ospitare le cellule in un secondo momento. Inoltre, quando supernatanti vengono raccolti in un unico punto di tempo e quindi applicati alle cellule ospiti, è difficile determinare rilevanza fisiologica e trarre conclusioni dirette sul processo di infezione naturale, in cui i fattori secreti si accumulano durante il corso di infezione per un concentrazione fisiologicamente rilevanti. Questa seconda sfida vale non solo per l&#39;uso di surnatanti batteriche, ma anche per l&#39;uso di tossine purificate studi su cellule host 1 - 3,8. Per affrontare questi problemi, un inse membrana permeabileSistema infezione rt-based è stato sviluppato per valutare gli effetti di SLS sulle cellule ospiti in un modo che mantiene l&#39;attività ottimale tossine ed elimina anche la variabile di contatto diretto tra i batteri e cellule ospiti. In questo sistema, le cellule epiteliali umane sono coltivate in un monostrato nella camera inferiore di una camera di due ben e batteri vengono introdotti nella camera superiore del pozzo stesso. Una membrana porosa (0,4 micron pori) separa le camere superiori e inferiori, consentendo fattori secreti da scambiare tra le due camere, ma impedire il passaggio di batteri. Questo sistema ha permesso per una valutazione efficace delle risposte di accoglienza che sono esclusivamente a causa di componenti batterici secreti sostenuti eliminando tutte le risposte che si possono verificare attraverso il contatto diretto durante gruppo A infezione streptococcica. Sebbene altri fattori batterici secreti oltre SLS possono passare attraverso la membrana porosa, l&#39;uso di un pannello mutante isogenico compresi wild-type (WT), un SLS-knockout (ΔsagA) e una saga ceppo complementato (ΔsagA + Saga) permette di valutare con precisione le risposte di accoglienza che sono strettamente dipendenti dalla SLS 21. Anche se simili sistemi di inserti membrana permeabile sono stati impiegati per lo studio dei fattori secreti coinvolti nelle infezioni virali, biologia del cancro, e la migrazione delle cellule immunitarie 22 - 26, pochi studi che coinvolgono le interazioni batteriche con le cellule ospiti hanno utilizzato questo approccio 6,27,28. Anche gli studi che hanno utilizzato tali sistemi per esplorare le interazioni tra batteri e cellule ospiti sono principalmente concentrati sulla migrazione di cellule infiammatorie o batteri attraverso un monostrato epiteliale o endoteliale placcato sull&#39;inserto membrana permeabile. Il sistema di infezione basato inserto membrana permeabile qui descritto è un metodo semplice ed efficace che si basa sulla separazione dei batteri e cellule ospiti tramite una membrana porosa per valutare l&#39;effeCTS della tossina secreta, SLS, sulla integrità della membrana ospite, vitalità cellulare, la trasduzione del segnale cellulare, e fattori della cellula ospite secrete. Questa tecnica può essere adattato allo studio di altri fattori di virulenza secreti su una varietà di tipi di cellule di mammifero ospitante per studiare il ruolo di un fattore specifico batterica nel corso di una infezione.

<table><tbody><tr><td>Brodo Todd-Hewitt</td><td>Acumedia</td><td>7161A</td><td>Utilizzare brodo appropriato per le specie batteriche di interesse.</td></tr><tr><td>BioSpettrometro</td><td>Eppendorf</td><td>modello base</td><td>Qualsiasi spettrofotometro UV-Vis è adatto.</td></tr><tr><td>Sono adatte piastre di Petri</td><td>, Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>altre marche.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-1kg</td><td>Sono adatte altre marche.</td></tr><tr>Cheratinociti <td></td><td></td><td>epiteliali umani HaCaT</td><td>Dono dal laboratorio di Victor Nizet.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>Utilizzare terreni appropriati per la linea cellulare di interesse.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S162H</td><td>Utilizzare additivi appropriati per la linea cellulare di interesse.</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 10 cm</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sono adatte altre marche.</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>cc7682-7506</td><td>Altre marche sono adatte, ma devono essere compatibili con l'inserto Corning.</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>cc7682-7524</td><td>Altre marche sono adatte, ma devono essere compatibili con l'inserto Corning.</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>Questi devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso per la placcatura delle celle.</td></tr>Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (PBS)</td>Il terreno privo di rosso fenolo <td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053028</td> rosso <td>fenolo è richiesto solo per il saggio di rilascio LDH.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030149</td><td>necessario solo per integrare i terreni di coltura cellulare per il test di rilascio di LDH.</td></tr><tr><td>Il piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>BP356100</td><td>necessario solo per integrare i terreni di coltura cellulare per il test di rilascio di LDH.</td></tr><tr><td>Rivestito di collagene 0,4 &mu; m Inserti Transwell (6 pozzetti)</td><td>Corning</td><td>3540</td><td></td></tr><tr><td>Rivestito di collagene 0,4 &mu; m Inserti Transwell (24 pozzetti)</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fisher</td><td>3120018</td><td>Questi devono essere sterilizzati con etanolo prima di maneggiare gli inserti Transwell.</td></tr><tr><td>Raschiatori cellulari</td><td>Fisherbrand</td><td>08-100-241</td><td>Questi sono necessari solo per la raccolta di lisati cellulari.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td>TOSSICO. Questo è necessario solo per l'imaging in immunofluorescenza.</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio dell'acido bicinconinnico (BCA)</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td>Possono essere utilizzati altri saggi di quantificazione delle proteine.</td></tr><tr><td>Tris-glicina 4 - 15% gel di poliacrilammide</td><td>BioRad</td><td>4561083</td><td>Il sistema tampone e la percentuale di poliacrilammide devono essere selezionati in base alle proteine di interesse.</td></tr>La <tr><td>cassetta per elettroforesi fornisce</td><td>BioRad</td><td>1658063</td><td>Richiesto solo per il Western Blotting.</td></tr><tr><td>Alimentatore per elettroforesi</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Richiesto solo per il Western Blotting.</td></tr><tr><td>Cassetta di trasferimento Western Blot</td><td>BioRad</td><td></td><td>Richiesta solo per il Western Blotting.</td></tr>La <tr><td>membrana in polivinilidene (PVDF)</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>necessaria solo per il Western Blotting.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio IgG-HRP anticorpo secondario</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc2030</td><td>L'anticorpo secondario deve essere determinato in base al metodo di rilevamento selezionato.</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG-HRP di topo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc2031</td><td>L'anticorpo secondario deve essere determinato in base al metodo di rilevamento selezionato.</td></tr><tr><td>Fosfo-p38 (T180 + T182) Anticorpo MAPK</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4511</td><td>Selezionare gli anticorpi primari appropriati in base alle proteine di interesse.</td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare dell'anticorpo</td> <td>p38 MAPK totale</td><td>8690</td><td>Selezionare gli anticorpi primari appropriati in base alle proteine di interesse.</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td> <td>IgG Alexafluor 488 anti-coniglio di capra</td><td>A-11034</td><td>Altri anticorpi secondari possono essere utilizzati per il rilevamento dell'imaging in immunofluorescenza.</td></tr><tr><td>Reagente di rilevamento LumiGLO</td><td>KPL</td><td>54-61-00</td><td>Richiesto solo per Western Blotting con rilevamento su pellicola.</td></tr><tr><td>Pellicola di rilevamento</td><td>Biodot</td><td>BDB57</td><td>Necessaria solo per Western Blotting con rilevamento su pellicola.</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza DeltaVision Nikon 90i</td><td>Nikon</td><td></td><td>Altri microscopi a fluorescenza sono adatti per queste analisi.</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Thermo Scientific</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500mL</td><td></td></tr><tr><td>DAPI colorazione nucleare</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td>Seleziona le colorazioni in base alle specifiche applicazioni di immunofluorescenza di interesse.</td></tr><tr><td>Colorazione rodamina-falloidina actina</td><td>Sonde molecolari</td><td>R415</td><td>Selezionare le colorazioni in base alle specifiche applicazioni di immunofluorescenza di interesse.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Richiesto solo per l'imaging in immunofluorescenza.</td></tr><tr><td>Omodimer di etidio 1</td><td>Sonde molecolari</td><td>E1169</td><td>Richiesto solo per il test di citotossicità della permeabilizzazione della membrana.</td></tr><tr><td>Lettori di micropiastre Spectramax M5</td> Dispositivi <td></td><td>molecolari</td><td>Potrebbero essere adatti altri lettori di micropiastre in grado di rilevare UV-vis, fluorescenza e luminescenza.</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036-50G-F</td><td>Richiesta solo per il test di citotossicità della permeabilizzazione della membrana.</td></tr><tr><td>Sonde molecolari Kit per la determinazione dell'ATP</td><td>Life Technologies</td><td>A22066</td><td>È probabile che altri kit siano adatti.</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento della citotossicità per il rilascio di LDH</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td>È probabile che altri kit siano adatti.</td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td>Altri fornitori sono adatti.</td></tr><tr><td>HALT Cocktail di inibitori della fosfatasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>78420B</td><td>È probabile che altri cocktail siano adatti.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST Compresse da cocktail con inibitore della proteasi, senza EDTA</td><td>Sigma</td><td>S8830-2TAB</td><td>È probabile che altri cocktail siano adatti.</td></tr></tbody></table>

implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Molti batteri patogeni secernono tossine potenti per aiutare nella distruzione del tessuto ospite, ad avviare modifiche alla segnaletica nelle cellule ospiti o di manipolare le risposte del sistema immunitario nel corso di infezione. Anche se i metodi sono stati sviluppati per purificare con successo e produrre molti di questi importanti fattori di virulenza, ci sono ancora molte tossine batteriche cui struttura unica o estesa modificazioni post-traslazionali le rendono difficili da purificare e studiare in sistemi in vitro. Inoltre, anche quando la tossina pura può essere ottenuto, ci sono molte sfide associate con studiare gli effetti specifici di una tossina in condizioni fisiologiche importanti. La maggior parte dei modelli di colture cellulari in vitro volti a valutare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule ospiti coinvolgere incubando cellule ospiti con una dose di una volta di tossina. Tali metodi poco approssimano quello cellule ospiti in realtà esperienza durante un&#39;infezione, in cui la tossina viene continuamente prodotto dacellule batteriche e lasciato accumulare gradualmente durante il corso dell&#39;infezione. Questo protocollo descrive la progettazione di un sistema di infezione batterica basato inserto membrana permeabile per studiare gli effetti di Streptolisina S, un potente tossina prodotta da streptococco di gruppo A, su cheratinociti epiteliali umane. Questo sistema imita più da vicino l&#39;ambiente fisiologico naturale durante un&#39;infezione rispetto ai metodi in cui la tossina pura o supernatanti batteriche sono applicati direttamente alle cellule ospiti. È importante sottolineare che questo metodo elimina anche la polarizzazione di risposte dell&#39;ospite che sono dovuti al contatto diretto tra i batteri e le cellule ospiti. Questo sistema è stato utilizzato per valutare efficacemente gli effetti di Streptolisina S (SLS) sull&#39;integrità ospitante membrana, vitalità cellulare, e le risposte di segnalazione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente applicata allo studio di altri fattori di virulenza secreti su una varietà di tipi di cellule di mammifero ospitante per studiare il ruolo specifico di un fattore batterica secreto durante il corso di infezione.

L&#39;inserto basato protocollo di sistema infezione membrana permeabile sviluppato per lo studio dei fattori batterici secreti è dettagliato in figura 1. Questo sistema si basa sulla separazione dei batteri e cellule ospiti tramite una membrana porosa per valutare gli effetti di fattori batterici secreti, in questo caso Streptolisina S (SLS), sulle risposte di accoglienza come l&#39;integrità dell&#39;host membrana, vitalità cellulare, la trasduzione del segnale cellulare, e fattori cellula ospite secreti. la Figura 2 fornisce dati rappresentativi Western Blot che dimostrano che questo sistema può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella attivazione di contatto segnalazione di accoglienza proteine ​​-indipendenti. In particolare, i dati rappresentativi mostrano significativamente migliorati attivazione p38 MAPK in presenza di ceppi GAS SLS producono. Questo sistema può essere applicato anche per visualizzare gli effetti di fattori batterici secreti sulla localizzazione proteina ospite di immunofluorescenza (&lt;strong&gt; Figura 3). I dati mostrano attivazione SLS-dipendenti del mediatore infiammatorio chiave Nuclear Factor kappa B (NFκB), che trasloca dal citoplasma al nucleo al momento dell&#39;attivazione 21. I risultati in figure 2 e 3 indicano che sia SLS-dipendente risposte infiammatorie segnalazione non richiedono il contatto diretto tra i batteri e cellule ospiti. Come esperimenti precedenti hanno già dimostrato SLS-dipendente p38 e l&#39;attivazione NFκB in modelli di infezione diretti 21, simili livelli di p38 o l&#39;attivazione NFκB tra i tre ceppi di gas nel sistema di inserimento a base di membrana permeabile avrebbero indicato che la risposta necessaria contatto diretto tra il batteri e cellule ospiti. Figura 4 dimostra che questo sistema infezione può essere applicato per valutare i cambiamenti tossina-dipendenti citotossicità host tramite saggi di etidio omodimero e rilascio di LDH. Ciò è dimostrato dal significativo incremento in sia permeabilizzazione della membrana e nel rilascio di LDH da cellule ospiti esposte a ceppi gas contenente SLS rispetto alle cellule non infette o cellule esposte al ceppo SLS-carenti. Questi cambiamenti nella citotossicità non sono immediati, come effetti significativi non sono evidenti fino dall&#39;infezione 12 ore nel caso di permeabilizzazione della membrana e 16 ore nel caso di rilascio di LDH. I dati rappresentativi illustrano l&#39;importanza di selezionare adeguati punti di tempo e le condizioni di infezione per la valutazione di queste risposte di accoglienza. Oltre a consentire per la valutazione di accoglienza segnalazione cambiamenti e citotossicità, il sistema di infezione inserto basato membrana permeabile è applicabile allo studio delle variazioni metaboliche come accurata determinazione dei livelli di ATP ospitante impedendo la contaminazione batterica dei lisati cellulari host (figura 5) . Questi dati mostrano una significativa perdita di cheratinociti ATP in risposta alle infezioni GAS da 16 ore dopo l&#39;infezione, con una maggiore perdita di ATP in la presenza di SLS. Questi risultati sono coerenti con le osservati incrementi tossina-dipendente in Host segnalazione dello stress-risposta e la citotossicità. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig1.jpg" /> Figura 1: Schema di infezione permeabile membrana Insert-Based System Protocol per valutare gli effetti di fattori batterici secreti su cellule ospiti cheratinociti umani sono placcati nel vano inferiore e cresciuto al 90% di confluenza.. Una membrana rivestita di collagene con 0,4 micron pori separa le camere superiori e inferiori, e batteri vengono aggiunti alla camera superiore del sistema di inserto membrana permeabile per il periodo di infezione desiderato. Surnatanti coltura cellulare e le cellule ospiti possono essere raccolte dopo il periodo di infezione e utilizzati per una serie di analisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande</a>di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig2.jpg" /> Figura 2:. Il sistema di infezione permeabile membrana Insert-based può essere utilizzato per Cell Host lisato analisi mediante SDS-PAGE e Western Blotting I dati rappresentativi dimostrano che la SLS aumenta l&#39;attivazione della via p38 MAPK nei cheratinociti infetti. (A) HaCaTs sono stati infettati con il gas per 7 ore tramite il sistema di infezione inserto membrana permeabile (al MOI = 10) e lisati sono stati valutati per l&#39;attivazione di p38. (B) Densitometria da tre macchie indipendente occidentale è stata effettuata per quantificare la relativa attivazione di p38 in risposta a GAS&#39;infection. Medie da tre repliche biologiche sono indicati, con barre di errore rappresentano la deviazione standard. relativa attivazione di p38 è rappresentato come livello di proteina fosforilata / totale. La significatività statistica è stata determinata rispetto alcellule non infettate. Il p-valore complessivo è stato determinato ANOVA (p = 0,0063). test di Dunnett sono stati eseguiti post hoc per confrontare ogni condizione al corrispondente di controllo non infetto significare. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig3.jpg" /> Figura 3:. Il sistema di infezione permeabile membrana Insert-Based permette la visualizzazione di Host segnalazione modifiche mediante immunofluorescenza Microscopia I dati rappresentativi mostrano che Streptolisina S aumenta di segnalazione pro-infiammatorie attraverso l&#39;attivazione di NFκB. HaCaT cheratinociti umani sono stati infettati con il gas a una M<html> OI 10 per 8 ore utilizzando il sistema di infezione basato inserto membrana permeabile. (A e B) la localizzazione nucleare di NFκB stata valutata mediante imaging immunofluorescenza. La percentuale di cellule localizzate nucleari stato calcolato contando il numero di cellule in cui NFκB aveva traslocati dal citoplasma al nucleo per un dato campo e dividendo questo numero per il numero totale di cellule per lo stesso campo. Barre di scala indicano 100 micron. (A) La media di tre repliche biologiche sono rappresentate per ogni condizione con barre di errore rappresentano la deviazione standard. Il p-valore complessivo è stato determinato ANOVA; p &lt;0,0001. test di Dunnett sono stati eseguiti per confrontare ogni condizione alla condizione di controllo non infetto corrispondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig4.jpg" /> Figura 4:. Il Sistema di infezione permeabile membrana Insert-Based consente la determinazione di batterica-Mediated membrana Permeabilization e citotossicità in assenza del diretto contatto tra i batteri e le cellule ospiti I dati rappresentativi dimostrano che cheratinociti vitalità diminuisce in presenza di attiva tossina SLS . GAS - indotta morte cellulare è stata valutata in HaCaT in presenza di WT, SLS-carente o SAGA GAS complementato cheratinociti sono stati esposti a GAS utilizzando il sistema di infezione inserto basato membrana permeabile per 8-16 ore ad una MOI di 10. (. A) La vitalità è stata valutata mediante test di etidio omodimero o saggio di rilascio B) LDH (. In entrambi i pannelli, 3 REplicates viene calcolata la media e le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Significato per ogni punto di tempo è stata determinata mediante ANOVA (A) 8 ore, p = 0,0241; 12 ore, p &lt;0,0001 (B) 8 ore, p = 0,0287; 12 hr, p = 0,1977; 16 ore, p = 0,0031. test di Dunnett sono stati eseguiti per confrontare le medie da ciascuna condizione all&#39;infezione wild-type per il punto di tempo corrispondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig5.jpg" /> Figura 5: Il sistema di infezione permeabile membrana Insert-based consente per la determinazione accurata dei livelli di ATP Host impedendo Bacterial contaminazione di Cell Host lisati. I dati rappresentativi dimostrano SLS dipendenti dalla perdita di ATP durante gruppo A infezione streptococcica. HaCaT sono state infettate con gas per 8-16 ore usando il sistema di infezione a base di inserto membrana permeabile. Repliche tecniche (n = 3) da un replicato biologica rappresentante (2 x 10 6 cellule per campione) sono stati mediati per ogni condizione, con barre di errore rappresentano la deviazione standard. Il P-valori complessivi sono stati determinati da ANOVA (12 ore, p &lt;0,0001; 16 ore, p &lt;0,0001). test di Dunnett sono state effettuate per confrontare ogni condizione con l&#39;infezione da wild-type per il punto di tempo corrispondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, un metodo che utilizza un sistema di un&#39;infezione inserto basato membrana permeabile per studiare gli effetti di Streptolisina S, una tossina secreta prodotta da streptococco di gruppo A, sui cheratinociti è descritto. Questo sistema può essere facilmente applicata allo studio di altre proteine ​​batteriche secrete con diverse tipologie cellula ospite durante l&#39;infezione.

Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

L'obiettivo generale di questo sistema di infezione basato su inserti con membrana permeabile è studiare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule dell'ospite durante l'infezione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle interazioni ospite-patogeno, ad esempio in che modo specifici componenti batterici secreti influenzano le risposte delle cellule dell'ospite durante l'infezione batterica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio dei componenti batterici secreti, modellando in modo più accurato un ambiente ospite-patogeno fisiologicamente rilevante nel contesto dell'infezione umana.La procedura sarà dimostrata da Rebecca Flaherty, studentessa laureata senior del mio laboratorio. Per preparare ceppi isogenici di streptococco di gruppo A, o GAS, e ceppi mutanti GAS M1T1 5448, avviare colture liquide notturne inoculando da cinque a dieci millilitri di brodo Todd Hewitt e incubando a 37 gradi Celsius per 16 ore. Centrifugare le colture batteriche notturne e utilizzare il volume originale di mezzo batterico fresco per risospendere il pellet.Quindi, normalizzare le colture batteriche a concentrazioni iniziali uguali diluendo le colture ri-sospese in ulteriore mezzo fino a raggiungere lo stesso OD600. Per raccogliere lisati da utilizzare nei saggi di analisi del segnale e di determinazione dell'ATP, piastrare cellule HaCaT in piastre a sei pozzetti a una densità di semina di circa tre per dieci alla quinta cellule per pozzetto e coltivare fino a raggiungere una confluenza del 90%. Per eseguire i saggi di permeabilizzazione della membrana con etidio omodimero e di rilascio della lattato deidrogenasi, piastrare cellule HaCaT in piastre a 24 pozzetti a una densità di semina di circa cinque per dieci alla quarta cellule per pozzetto e far crescere fino a raggiungere una confluenza del 90%.Immediatamente prima del trattamento, lavare le cellule utilizzando PBS 1x. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo di crescita fresco con o senza trattamento farmacologico nelle piastre a sei pozzetti, oppure 0,5 millilitri di mezzo nei pozzetti delle piastre a 24 pozzetti. Quindi, sotto cappa a flusso laminare, utilizzare pinze sterili per posizionare con attenzione un inserto sterile con membrana permeabile da 0,4 micron in ciascun pozzetto.La manipolazione delicata e sterile degli inserti permeabili durante la preparazione dell'infezione è fondamentale per evitare che la membrana venga compromessa o contaminata in questo processo. Aggiungere mezzo fresco per colture cellulari nella camera superiore di ogni pozzetto seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, applicare un volume appropriato delle colture batteriche normalizzate nella camera superiore del sistema di inserti con membrana permeabile e aggiungere il mezzo batterico nei pozzetti di controllo.L'aggiunta accurata dei batteri nella camera superiore, così come il trasporto delicato delle cellule infette nell'incubatrice, è fondamentale, poiché è essenziale che i batteri non contaminino la camera inferiore durante l'allestimento dell'esperimento. Per valutare le proteine prodotte dall'ospite, utilizzare pinze sterili per rimuovere con attenzione l'inserzione con membrana permeabile. Successivamente, senza disturbare il monostrato di cellule, raccogliere il mezzo dalla camera inferiore in provette da 1,5 millilitri.Centrifugare i campioni a 14.000 RCF e a quattro gradi Celsius per 10 minuti per ottenere un pellet di detriti cellulari. Successivamente, rimuovere tutto tranne 50 microlitri del soprannatante, trasferirli in una nuova provetta da 1,5 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius oppure utilizzare immediatamente. Per la valutazione dei lisati delle cellule ospiti, aspirare delicatamente il mezzo sovrastante il monostrato senza disturbare le cellule ospiti.Quindi, risciacquare le cellule una volta con PBS. Aspirare delicatamente il PBS e applicare immediatamente un volume di buffer di lisi ghiacciato per ottenere, ad esempio, una concentrazione proteica compresa tra 0,5 e 1,5 milligrammi per millilitro. Successivamente, incubare i campioni sul ghiaccio per 15 minuti.Successivamente, utilizzare una spatola per cellule per staccare le cellule dalla superficie della piastra in ogni pozzetto e trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare quindi i campioni a 14.000 RCF e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Per valutare i componenti solubili del lisato, trasferire il soprannatante in una provetta nuova e conservarlo a meno 20 gradi Celsius oppure utilizzarlo immediatamente.Per valutare i componenti nucleari o altri componenti insolubili del lisato, conservare il pellet e mantenerlo a meno 20 gradi Celsius, oppure utilizzarlo immediatamente. Per la valutazione mediante imaging a fluorescenza immunoistochimica, aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS freddo 1x. Successivamente, fissare le cellule con PFA al 4% in PBS durante la notte.Eseguire ulteriori analisi seguendo il protocollo descritto nel testo. I dati del western blot mostrati qui dimostrano un significativo aumento dell'attivazione della chinasi p38 MAP e dei cheratinociti in presenza di streptolisina S o ceppi di gas produttori di SLS, indicando che questo sistema può essere utilizzato per valutare le variazioni nell'attivazione di proteine di segnalazione dell'ospite indipendenti dal contatto. In questa figura viene mostrata l'attivazione dipendente da SLS del principale mediatore infiammatorio fattore nucleare-kappa B, che si trasloca dal citoplasma al nucleo in seguito all'attivazione, indicando che questo sistema può essere impiegato per visualizzare gli effetti dei fattori batterici secreti sulle risposte proteiche dell'ospite mediante approcci di microscopia a fluorescenza immunologica.Qui vengono dimostrati aumenti significativi sia nella permeabilizzazione della membrana sia nel rilascio di LDH dalle cellule ospiti dopo l'esposizione a ceppi di gas produttori di SLS, rispetto a cellule non infette o esposte a un ceppo privo di SLS. Questi risultati indicano che questo sistema può valutare le variazioni della citotossicità dell'ospite dipendenti dalla tossina. In questo esperimento, sono stati determinati i livelli di ATP nei cheratinociti e la risposta all'infezione da gas.16 ore dopo l'infezione, si è osservata una significativa riduzione dell'ATP, e la perdita di ATP è risultata più marcata in presenza di SLS, coerentemente con l'aumento dipendente dalla tossina della segnalazione della risposta allo stress dell'ospite e della tossicità. Una volta stabilita, questa tecnica può essere utilizzata per studiare le risposte specifiche di qualsiasi fattore microbico secreto su diversi tipi di cellule ospiti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale adottare una tecnica sterile in tutte le fasi di preparazione dell'esperimento e maneggiare con attenzione gli inserti con membrana permeabile, sia durante l'allestimento iniziale sia durante il prelievo dei campioni.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come il western blotting, l'immunofluorescenza e saggi di permeabilizzazione della membrana, al fine di determinare in che modo il fattore batterico di interesse contribuisce ai cambiamenti nelle cascate di segnalazione e influenza la citotossicità complessiva durante l'infezione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni di cellule ospiti per valutare diverse risposte cellulari a seguito dell'esposizione a un particolare fattore batterico secreto di interesse. Non dimenticare che la manipolazione di materiali pericolosi per la salute, come i patogeni batterici, richiede specifiche precauzioni di sicurezza.L'uso appropriato di occhiali di sicurezza, guanti e camici da laboratorio, insieme all'impiego corretto di una cappa a sicurezza biologica, è necessario per eseguire questi esperimenti in sicurezza.

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Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti (Video) | JoVE Journal

Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti

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