Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti

L'obiettivo generale di questo sistema di infezione basato su inserti di membrana permeabile è studiare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule ospiti durante l'infezione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni ospite-patogeno, come ad esempio il modo in cui specifici componenti batterici secreti contribuiscono alle risposte delle cellule ospiti durante l'infezione batterica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio dei componenti batterici secreti e modella più da vicino un ambiente ospite-patogeno fisiologicamente rilevante nel contesto dell'infezione umana.

A dimostrare la procedura sarà Rebecca Flaherty, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per preparare lo streptococco isogenico di tipo selvatico di gruppo A, o GAS, e i ceppi mutanti GAS M1T1 5448, iniziare le colture liquide durante la notte inoculando da cinque a 10 millilitri di brodo di Todd Hewitt e incubando a 37 gradi Celsius per 16 ore. Centrifugare le colture batteriche durante la notte e utilizzare il volume originale di terreno batterico fresco per risospendere il pellet.

Quindi, normalizzare le colture batteriche alle stesse concentrazioni iniziali diluendo le colture risospese in un terreno aggiuntivo per ottenere lo stesso OD600. Per raccogliere lisati per eseguire analisi di segnalazione e saggi di determinazione dell'ATP, le cellule HaCaT vengono piastrate in piastre a sei pozzetti con una densità di seduta di circa tre volte 10 fino alla quinta cellula per pozzetto e la coltura con una confluenza del 90%. Per eseguire la permeabilizzazione della membrana dell'omodimer di etidio e i saggi di rilascio della lattato deidrogenasi, le cellule HaCaT vengono piastrate in piastre a 24 pozzetti con una densità di seduta di circa cinque volte 10 per le quarte cellule per pozzetto e crescono fino al 90% di confluenza.

Immediatamente prima del trattamento, utilizzare 1x PBS per lavare le cellule. Quindi applicare due millilitri di terreno di coltura fresco con o senza trattamento farmacologico alle piastre a sei pozzetti, o 0,5 millilitri di terreno ai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti. Successivamente, sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare una pinza sterile per posizionare con cura un inserto a membrana permeabile sterile da 0,4 micron in ciascun pozzetto.

La manipolazione delicata e sterile degli inserti permeabili durante la preparazione dell'infezione è fondamentale per evitare che la membrana venga compromessa o contaminata durante questo processo. Applicare il terreno di coltura cellulare fresco nella camera superiore di ciascun pozzetto secondo le istruzioni del produttore. Quindi, applicare un volume appropriato di colture batteriche normalizzate nella camera superiore del sistema di inserti a membrana permeabile e applicare il mezzo batterico ai pozzetti di controllo.

Un'attenta aggiunta dei batteri alla camera superiore, così come il trasporto delicato delle cellule infette all'incubatore, sono fondamentali, perché è essenziale che i batteri non contaminino la camera inferiore durante la configurazione sperimentale. Per valutare la presenza di proteine dell'ospite secrete, utilizzare una pinza sterile per rimuovere con cura l'inserto della membrana permeabile. Quindi, senza disturbare il monostrato di cellule, raccogliere il terreno dalla camera inferiore in provette da 1,5 millilitri.

Centrifugare i campioni a 14.000 RCF e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare i detriti cellulari. Quindi, rimuovere tutti i microlitri di surnatante tranne 50, trasferirli in un tubo fresco da 1,5 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius, oppure utilizzare immediatamente. Per la valutazione dei lisati delle cellule ospiti, aspirare delicatamente il terreno sopra il monostrato senza disturbare le cellule ospiti.

Quindi, usa il PBS per sciacquare le cellule una volta. Aspirare delicatamente il PBS e applicare immediatamente un volume di tampone di lisi ghiacciato per ottenere, ad esempio, una concentrazione proteica da 0,5 a 1,5 milligrammi per millilitro. Quindi, incubare i campioni su ghiaccio per 15 minuti.

Quindi, utilizzare un raschietto per staccare le cellule dalla superficie della piastra di ciascun pozzetto e trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare i campioni a 14.000 RCF e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Per valutare i componenti solubili dello stato listatico, trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservarlo a meno 20 gradi Celsius, oppure utilizzare immediatamente.

Per valutare i componenti nucleari o altri componenti insolubili del lisato, riservare il pellet e conservarlo a meno 20 gradi Celsius, oppure utilizzarlo immediatamente. Per la valutazione mediante imaging a immunofluorescenza, aspirare il terreno e utilizzare 1x PBS freddo per lavare le cellule. Quindi, con il 4% di PFA e PBS, fissare le cellule durante la notte.

Effettuare ulteriori analisi secondo il protocollo di testo. I dati di western blot mostrati qui dimostrano un aumento significativo dell'attivazione della p38 MAP chinasi e dei cheratinociti in presenza di ceppi di gas produttori di streptolisina S o SLS, indicando che questo sistema può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nell'attivazione delle proteine di segnalazione dell'ospite indipendenti dal contatto. In questa figura, viene mostrata l'attivazione SLS-dipendente del fattore nucleare mediatore infiammatorio chiave-kappa B, che trasloca dal citoplasma al nucleo dopo l'attivazione, indicando che questo sistema può essere utilizzato per visualizzare gli effetti dei fattori batterici secreti sulle risposte proteiche dell'ospite utilizzando approcci di microscopia a immunofluorescenza.

Qui, in seguito all'esposizione a ceppi di gas che producono SLS, sono stati dimostrati aumenti significativi sia della permeabilizzazione della membrana che del rilascio di LDH dalle cellule ospiti, rispetto alle cellule non infette o alle cellule esposte a un ceppo carente di SLS. Questi risultati indicano che questo sistema è in grado di valutare i cambiamenti tossin-dipendenti nella citotossicità dell'ospite. In questo esperimento, sono stati determinati i livelli di ATP nei cheratinociti e la risposta all'infezione da gas.

16 ore dopo l'infezione, è stata osservata una significativa riduzione dell'ATP e la perdita di ATP è stata più pronunciata in presenza di SLS, coerentemente con l'aumento tossina-dipendente della segnalazione e della tossicità della risposta allo stress dell'ospite. Una volta stabilita, questa tecnica può essere utilizzata per studiare le risposte specifiche di qualsiasi fattore microbico secreto su una varietà di tipi di cellule ospiti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante praticare la tecnica sterile durante le fasi di configurazione sperimentale e mantenere un'attenta manipolazione degli inserti permeabili della membrana, sia durante la configurazione iniziale che durante la raccolta del campione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come il western blotting, l'imaging a immunofluorescenza e i saggi di permeabilizzazione della membrana, al fine di determinare in che modo il fattore batterico di interesse contribuisce ai cambiamenti nelle cascate di segnalazione e influenza la citotossicità complessiva durante l'infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni di cellule ospiti per la valutazione di una varietà di risposte delle cellule ospiti in seguito all'esposizione a uno specifico fattore batterico secreto di interesse. Non dimenticare che la manipolazione di materiali a rischio biologico, come gli agenti patogeni batterici, richiede alcune considerazioni sulla sicurezza.

Per eseguire questi esperimenti in sicurezza è necessario l'uso appropriato di occhiali di sicurezza, guanti e camici da laboratorio, insieme all'uso corretto di un cappuccio di biosicurezza.