Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'assistenza polmonare, ad esempio perché i pazienti che sopravvivono alla polmonite acquisita in ospedale hanno esiti così scarsi a lungo termine? Il vantaggio di questo metodo è che è semplice e affidabile, il che significa che chiunque entri in laboratorio può essere istruito e il giorno dopo genera dati utili e ripetibili. Sebbene questi metodi analitici possano essere applicati per fornire informazioni sull'infezione delle cellule in coltura in vitro, possono essere applicati anche a modelli animali e pazienti umani.

Per produrre surnatante citotossico, lavare una piastra di 150 centimetri di cellule endoteliali con HBSS e diluire una colonia di P. aeruginosa a un'assorbanza di 0,25 a 540 nanometri. Inoltre diluire le cellule batteriche per consentire una molteplicità di infezione di 20 a uno su 20 millilitri di HBSS e seminare i batteri sulla piastra delle cellule endoteliali. Quindi posizionare le cellule infette in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per quattro o cinque ore.

È essenziale che l'incubazione dei batteri e delle cellule endoteliali avvenga per un periodo di tempo adeguato. Se l'incubazione è troppo breve, gli amiloidi non verranno rilasciati nel surnatante. Se l'incubazione è troppo lunga, le cellule si liseranno e rilasceranno tutto il loro contenuto nel surnatante.

L'indicatore che utilizziamo per una durata appropriata dell'incubazione è la formazione di lacune nel monostrato endoteliale. Quando è possibile osservare lacune nel monostrato cellulare mediante microscopia ottica, raccogliere il surnatante per la centrifugazione per rimuovere eventuali detriti cellulari. Decantare il surnatante in una siringa dotata di un filtro da 0,2 micron e far passare il surnatante attraverso il filtro per rimuovere eventuali batteri contaminanti.

Quindi mettere da parte 1,5 millilitri di surnatante sterile per i test di citotossicità e congelare il resto del campione a meno 80 gradi Celsius. Per valutare la citotossicità del surnatante raccolto, aggiungere l'aliquota da 1,5 millilitri di surnatante sterilizzato con filtro a un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente una coltura di cellule endoteliali microvascolari polmonari confluenti. Mettere la piastra in un incubatore a CO2 per 21-24 ore.

Quindi ottenere immagini delle regioni delle colture trattate e di controllo. Importa le immagini in una macro imagej personalizzata e regola il contrasto al 15% di pixel saturi. Duplica le immagini con regolazione del contrasto e utilizza Sottrai sfondo per ottenere immagini ad alto contrasto sia delle celle intatte che dell'area dello spazio all'interno del campo visivo.

Sottrai questa immagine ad alto contrasto dall'immagine originale e usa il calcolatore di immagini e la funzione per combinare l'immagine risultante con l'immagine originale. Utilizzare la funzione di soglia per convertire l'immagine combinata in una maschera con gli spazi vuoti in nero e le celle intatte in bianco. E usa la funzione di erosione binaria per rimuovere qualsiasi rumore dall'immagine.

Quindi usa la frazione di area per misurare il rapporto tra pixel bianchi e neri all'interno dell'immagine risultante. E traccia ed esprime le aree frazionarie per ogni punto temporale del trattamento, come percentuale dell'area del gap massimo. Per quantificare gli amiloidi all'interno del surnatante, aggiungere 20 microlitri di soluzione madre di tioflavina T 50X appena preparata e filtrata a un millilitro di PBS in una cuvetta spettrofotometrica da un millilitro e caricare il campione diluito su uno spettrofluorimetro.

Misurare l'emissione di fluorescenza di base utilizzando un'eccitazione a 425 nanometri. Scansione dell'emissione di fluorescenza da 450 a 575 nanometri con incrementi di due nanometri. Quindi impostare lo strumento per eseguire una scansione time lapse utilizzando un'eccitazione di 425 nanometri e un'emissione di 482 nanometri con acquisizione dati ogni 0,2 secondi per 60 secondi.

Mettere in pausa la scansione dopo 20 secondi e 10 microlitri di surnatante sterilizzato con filtro alla cuvetta. Dopo la miscelazione per inversione, ricaricare la cuvetta sullo spettrofluorimetro e riprendere la scansione basata sul tempo per gli ultimi 40 secondi. Al termine del time lapse, eseguire una scansione finale dello spettro delle emissioni di fluorescenza utilizzando le impostazioni di scansione originali.

L'aggiunta di P. aeruginosa a strati confluenti di cellule endoteliali microvascolari polmonari induce la formazione di spazi tra le cellule. Utilizzando imagej per valutare la citotossicità del surnatante, come dimostrato durante le prime 12 ore di trattamento, i monostrati cellulari confluenti ancora sani possono essere visualizzati come tutte le regioni bianche all'interno del campo microscopico. Tuttavia, entro 18 ore dall'aggiunta del surnatante raccolto da colture infette da PA 103, è possibile rilevare lacune nel monostrato con l'area della piastra di coltura priva di cellule che aumenta in modo lineare fino a 36 ore di trattamento, a quel punto non si osservano quasi cellule intatte.

Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando il rilascio di lattato deidrogenasi come marcatore di citotossicità. Con lattato deidrogenasi rilevata per la prima volta a 18 ore dopo l'aggiunta del surnatante citotossico e aumentando in modo lineare fino a quando non viene misurata la massima uccisione cellulare a 36 ore. I surnatanti possono anche essere valutati mediante analisi immunoblot o misurando la variazione dell'intensità della fluorescenza della tioflavina T dovuta a cambiamenti di conferma indotti dal legame dell'amiloide per determinare la presenza di amiloidi citotossici nei surnatanti.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come generare surnatanti citotossici in seguito all'infezione delle cellule endoteliali con citomonsis aeruginosa. Inoltre, dovresti essere esperto nei tipi di saggi necessari per caratterizzare e analizzare le citotossine presenti in quei surnatanti.