Misurazione del TEER in cellule epiteliali irradiate con raggi X in co-coltura con PBMC

Prendere un inserto di membrana contenente un monostrato epiteliale irradiato con raggi X.

Posizionare l'inserto della membrana in un pozzetto contenente cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, cellule immunitarie che secernono citochine e altre molecole di segnalazione.

Posizionare la resistenza elettrica transepiteliale, o elettrodi TEER, nell'inserto della membrana.

Applicare una piccola corrente elettrica e misurare la resistenza per valutare la permeabilità del monostrato regolata da giunzioni strette.

Le giunzioni strette sono proteine transmembrana legate al citoscheletro attraverso proteine dell'impalcatura.

Insieme, queste proteine giunzionali formano una robusta barriera tra le membrane cellulari, limitando il passaggio di grandi molecole e agenti patogeni.

Le proteine giunzionali intatte ostacolano il flusso di corrente elettrica, determinando un elevato TEER, che indica la normale permeabilità del monostrato.

L'esposizione ai raggi X riduce i livelli di proteine giunzionali, aumentando la permeabilità del monostrato e abbassando il TEER.

Inoltre, le molecole di segnalazione provenienti da cellule irradiate attivano PBMC co-coltivate che rilasciano citochine, innescando un'ulteriore riduzione dei livelli di proteina giunzionale e interrompendo l'integrità della barriera.

Di conseguenza, la permeabilità del monostrato aumenta, causando un'ulteriore diminuzione del TEER.

Per valutare la resistenza elettrica transepiteliale, o TEER, delle cellule Caco-2 immediatamente dopo l'irradiazione, trasferire metà degli inserti di coltura cellulare Caco-2 in una nuova piastra con 3 millilitri di terreno completo fresco in ciascun pozzetto e metà delle colture inserite in una nuova piastra seminata con 2 x 10⁶ PBMC per 3 millilitri di terreno completo per pozzetto. Quindi, posizionare un elettrodo a bacchetta TEER nell'inserto di coltura cellulare ogni ora per le prime sei ore, e poi ogni tre ore fino a 48 ore dopo l'irradiazione.