Un metodo di co-coltura di indagare il Crosstalk tra raggi x irradiati PBMC e cellule Caco-2

L'obiettivo generale di questo protocollo di cocoltura è misurare gli effetti delle radiazioni ionizzanti sulla permeabilità del monostrato delle cellule epiteliali Caco-2 e sulla funzione di giunzione stretta in presenza o assenza di cellule mononucleate del sangue periferico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle radiazioni e della radioimmunoterapia sui possibili effetti sinergici tra l'esposizione alle radiazioni ionizzanti e le funzioni delle cellule immunitarie. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è possibile testare diversi stimoli e popolazioni cellulari e osservare fenomeni disaccoppiati attraverso misure complementari ad hoc.

Le procedure di radioterapia mirano a considerare il monostrato cellulare Caco-2 in quanto il volume del tumore viene irradiato con il fascio appropriato e una dosimetria accurata, come nel caso della radioterapia nel paziente. Una settimana prima della loro irradiazione, il seme è di cinque volte 10 alla quinta di cellule Caco-2 in due millilitri di terreno completo in un inserto sterile di coltura cellulare con diametro dei pori di un micrometro per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti. Aggiungere tre millilitri di terreno completo fresco nello scomparto inferiore di ciascun pozzetto e posizionare le cellule in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di Co2 per sette giorni.

L'ultimo giorno di incubazione aggiungere 25 millilitri di Ficoll in una provetta conica da 50 millilitri. E sovrapporre con cura 25 millilitri di sangue intero appena raccolto sul Ficoll. Separare le celle mediante centrifugazione a gradiente di densità.

E usa una pipetta Pasteur per trasferire le cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC all'interfaccia in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Quindi lavare la PBMC isolata in due lavaggi PBS da 10 millilitri. E coltivare il PBMC in un terreno completo fresco per non più di tre-cinque ore nell'incubatore per colture cellulari.

Impostare l'energia dei raggi X del fotone a un picco di sei megavolt. E posizionare la coltura cellulare di Caco-2 su un foglio di plexiglass spesso 1,4 centimetri all'interno della traiettoria dei raggi X e a 100 centimetri dalla fonte di radiazione. Quindi posizionare un bolo di 0,57 centimetri di spessore su ciascun campione per garantire l'equilibrio della componente di radiazione retrodiffusa e delle particelle cariche.

E utilizzare un campo di radiazione piatto e simmetrico di 20 x 20 centimetri quadrati e un tasso di dose di tre grigi al minuto per irradiare le cellule. Per valutare l'attività metabolica e la vitalità delle cellule Caco-2, seminare due volte da 10 alla quinta cellula Caco-2 in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti 24 ore prima della loro irradiazione in 1,25 millilitri di terreno completo. Quindi rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 21 ore.

Il giorno successivo aggiungere 100 microlitri di soluzione MTT da cinque milligrammi per millilitro a ciascun pozzetto e incubare le cellule per altre tre ore. Dopo aver lavato le cellule con un millilitro di PBS, aggiungere 500 microlitri di dimetilsolfossido a ciascun pozzetto per sciogliere eventuali cristalli di formazane rilasciati dalle cellule Caco-2 e valutare l'assorbanza con un lettore di piastre multipozzetto a una lambda di 570 nanometri. Per valutare la vitalità delle cellule Caco-2, lavare le cellule con un millilitro di PBS per pozzetto, quindi staccare le cellule con 100 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA per due minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Arrestare la reazione con 500 microlitri di terreno completo e trasferire le cellule in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Risospendere i pellet in 50 microlitri di PBS per provetta e miscelare le sospensioni cellulari risultanti con un volume uguale di soluzione colorante vitale Trypan Blue. Dopo tre minuti a temperatura ambiente, contare il numero di cellule vitali non colorate e non colorate nell'emocitometro.

Per valutare la resistenza elettrica transepiteliale o TEER delle cellule Caco-2, immediatamente dopo l'irradiazione trasferire metà degli inserti di coltura cellulare Caco-2 in una nuova piastra con tre millilitri di terreno completo fresco in ciascun pozzetto e metà delle colture inserite in una nuova piastra seminata con due volte 10 al sesto PBMC per tre millilitri di terreno completo per pozzetto. Quindi posizionare un elettrodo a bacchetta TEER nell'inserto di coltura cellulare ogni ora per le prime sei ore e poi ogni tre ore fino a 48 ore dopo l'irradiazione. Per l'analisi Western blot, 48 ore dopo la loro irradiazione, lisare le cellule Caco-2 e PBMC con 40 microlitri per una volta 10 alla sesta cellula del tampone di lisi cellulare.

Durante la lisi e la raschiatura delle cellule di Caco-2, fare attenzione a non staccare la membrana porosa dall'inserto, che può causare una perdita di lisato cellulare e un risultato distorto. Conservare i campioni di cellule lisate a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver quantificato la quantità totale di proteine in ciascun campione di lisi cellulare con il metodo dell'acido bicinconinnico, aggiungere volumi uguali di tampone campione Laemmli integrato con beta-mercaptoetanolo a ciascun campione proteico totale in singole provette per microcentrifuga.

Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raccogliere le proteine denaturate mediante centrifugazione e caricare volumi proteici totali uguali da ciascun campione in un gel prefabbricato dal quattro al 20%. Far funzionare i campioni per un'ora a 120 volt.

Quindi utilizzare un sistema di trasferimento elettrico semi-secco per trasferire le proteine su una membrana di fluoruro di polivinilidene. Posizionare quindi la membrana in un contenitore e bloccare i siti di legame aspecifici con il 5% di latte scremato in polvere in PBS integrato con lo 0,2% di Tween 20 per 60 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Al termine dell'incubazione bloccante, lavare la membrana tre volte con 10 millilitri di PBS Tween 20 allo 0,2% per cinque minuti per lavaggio ed etichettare la membrana con gli anticorpi primari appropriati di interesse per un'ora a temperatura ambiente con leggera agitazione.

Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius con leggera agitazione, lavare la membrana tre volte con PBS Tween 20 allo 0,2% come appena dimostrato e incubare la membrana con gli appropriati anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano per 60 minuti a temperatura ambiente con leggera agitazione. Dopo tre lavaggi PBS, incubare la membrana con un kit di soluzione chemiluminescente potenziato. Quindi acquisire l'immagine della pellicola risultante con un sistema di scansione appropriato e quantificare i risultati con un programma di analisi delle immagini adatto.

L'irradiazione fino a 10 grigi non altera l'attività metabolica delle cellule Caco-2 a 24 o 48 ore dopo l'irradiazione, sebbene la vitalità cellulare diminuisca nel tempo ad entrambe le dosi. La valutazione TEER delle cellule Caco-2 non cocoltivate dopo l'esposizione a due grigi di irradiazione rivela valori TEER coerenti fino a 48 ore dopo l'irradiazione. Dopo 10 grigi di irradiazione, tuttavia, le cellule dimostrano una diminuzione prolungata del TEER a partire da tre ore dopo l'irradiazione.

La cocoltura con PBMC determina una riduzione del TEER che è evidente da tre ore dopo l'irradiazione a entrambe le dosi fino a 30 ore dopo l'irradiazione, a quel punto i valori di TEER sembrano rimanere relativamente coerenti. L'analisi Western blot delle proteine a giunzione stretta non rivela differenze nell'espressione di Claudina-1 o Occludina in risposta all'irradiazione e/o alla cocoltura di PBMC, mentre si osservano grandi fluttuazioni in varie proteine dello scaffold . Inoltre, la proteina totale NF-kappa B non è influenzata da nessuna delle due dosi di irradiazione, mentre i livelli di proteina XIAP sono sovraregolati di quattro volte ad entrambe le dosi.

Utilizzando questa procedura, è possibile aggiungere altri stimoli biologici come gli enterobatteri per rispondere a ulteriori domande su come diversi stimoli biologici possono modificare la risposta del buon monostrato all'esposizione alle radiazioni ionizzanti. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'impatto delle radiazioni ionizzanti e delle cellule immunitarie sulla permeabilità delle cellule Caco-2 e sull'espressione del complesso di giunzione stretta.