Name: Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Impara a visualizzare gli intermedi strutturali del DNA durante la replicazione in E. coli danneggiato da UV. Questo metodo utilizza l'analisi bidimensionale su gel di agarosio per studiare i meccanismi di riparazione del DNA.

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Lavoro nel nostro laboratorio è supportato da premio CARRIERA MCB0551798 dalla National Science Foundation e AREA concedere R15GM86839 dal NIGMS-NIH.

1. Crescita e di irradiazione UV. <ol><li> 200μl di una cultura fresco durante la notte contenente il plasmide pBR322 cresciuto in media 1 Davis integrato con 0,4% di glucosio, 0,2% di acidi casamino, e 10 mg / ml timina (media DGCthy) e 100 mg / ml ampicillina è pellet. Il pellet cellulare viene risospeso in medium DGCthy 200μl manca ampicillina e utilizzati per inoculare 20 ml di medium DGCthy. </li><li> Le culture sono cresciute senza selezione ampicillina in una agitazione incubatore a 37 ° C ad un diametro esterno 600 di 0,5 (~ 5 x 10 8 cellule / ml). Crescita senza ampicillina evita selezione contro intermedi replica anormale o improduttivi che possono sorgere in alcuni mutanti. Inoltre, se si utilizza la luce UV per indurre danni, la rimozione del ampicillina da parte dei media è necessario perché assorbe fortemente a queste lunghezze d'onda e scudi le cellule, riducendo la dose efficace di UV. </li><li> Lavorare sotto le luci gialle, la cultura è posto in un piatto di 15 centimetri di diametro Petri su una piattaforma rotante per l'agitazione. Le nostre culture sono posti ad una distanza da un 15-watt lampada germicida che produce un tasso di esposizione di circa 1 J/m2/sec, che viene misurata con un fotometro UVC. Le culture sono irradiati con 50 J/m2 e poi messo immediatamente in agitazione i 37 ° C incubatore per tutta la durata dell'esperimento. Questa dose produce, in media, 1 ciclobutano dimero pirimidina ogni 4,5 kb di ssDNA. La luce gialla impedisce fotoriattivazione-inversione di dimeri pirimidinici ciclobutano da fotoliasi. </li></ol> 2. Isolamento del DNA. <ol><li> A volte, quando intermedi replica sono da esaminare, una aliquota 0,75 ml di cultura viene inserito in 0,75 ml di ghiaccio freddo NET30 Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 30 mM EDTA) e messo in ghiaccio fino alla fine del la durata del corso. Noi di solito un decorso di tempo 90 minuti, con i campioni esaminati a 0, 15, 30, 45, 60 e 90 minuti. L'EDTA e la temperatura fredda servono a bloccare efficacemente la replicazione e riparazione per escissione dei nucleotidi. </li><li> Ogni campione è poi pellet, risospeso in 150 ml di 1,5 mg / ml di lisozima e 0,2 mg / ml RNaseA a TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA), e lisato a 37 ° C per 20 min. In questo momento, 10μl di proteinasi K (10 mg) e 10μl del 20% sarkosyl sono aggiunti e l'incubazione è permesso di proseguire per 1 ora. Proteinasi K e sarkosyl aiutare a liberare frammenti di DNA che possono essere associati con la membrana o proteine ​​di prima estrazione fenolo si verifica. Dal DNA replicazione attiva è spesso legato a complessi proteici o membrana, questo aiuta ad aumentare la resa di frammenti di replica che sono recuperati. </li><li> I campioni vengono poi estratti con l'aggiunta di 2 volumi di fenolo per ogni campione e i tubi sono capovolta con cautela per 5 minuti. Quindi 2 volumi di cloroformio / alcool isoamilico (24 / 1) sono aggiunte ei tubi sono capovolta con cautela per 5 minuti. </li><li> I campioni vengono centrifugati a 14.000 rpm in una microcentrifuga per 5 minuti e la fase acquosa superiore di ogni campione è stato rimosso, e collocato in una nuova provetta. Poi 4 volumi di cloroformio / alcool isoamilico (24 / 1) sono aggiunti, i tubi sono capovolta con cautela per 5 minuti, e centrifugato di nuovo a 14.000 rpm per 5 minuti. </li><li> Il piano, in fase acquosa ogni campione viene poi dializzati per 1 ora di spotting 100μl di ciascun campione su un disco Whatman 47 millimetri 0,025 micron pori che galleggia su 250 ml di 0,1 X. TE in un bicchiere. Perché le strutture replicare con le regioni singolo filamento o punti di ramificazione sono più sensibili al taglio, di solito tagliare le nostre puntali con una lama di rasoio per rendere la bocca più ampia e minimizzare forze di taglio. In generale, pipettaggio dovrebbero essere ridotte al minimo fino a dopo il DNA è stato digerito con enzimi di restrizione. </li><li> Ogni campione viene digerito con PvuII (New England Biolabs) che linearizza il plasmide appena a valle l'origine di replicazione. </li><li> Prima di caricare nel gel di agarosio, 100μl cloroformio e 20μl di colorante di caricamento 6X che contiene bromofenolo Cyanol Blu e xilene sono aggiunti ad ogni campione e misti. Poi, 40μl della fase acquosa contenente il colorante di caricamento viene caricata nel gel. Per ridurre al minimo i pregiudizi strutturali, manufatti strutturali, e di taglio del DNA, questa procedura di isolamento non prevede alcuna misura per arricchire per le regioni singolo filamento, precipitare, o concentrato i campioni di DNA segue la lisi cellulare. </li></ol> 3. Gel 2D e analisi del sud. <ol><li> Il 2-dimensionale agarosio-gel analisi viene modificato da 3. Per la dimensione 1 °, i campioni di DNA ristretto vengono eseguiti attraverso un gel di agarosio 0,4% in TBE 1X a 1V/cm. Un litro di soluzione di TBE 10X magazzino contiene: <ul><li> 108 g Tris Base </li><li> 55 g di acido borico </li><li> 40 ml di EDTA 0,5 M (pH 8,0) </li></ul></li><li> Un Hind lambda marcatore dimensioni III è caricato nel vicolo, poi i campioni sono stati caricati in ogni altra corsia. Noi di solito eseguire il primo dimension ~ 12-15 ore. Salto di corsia rende più semplice per tagliare fuori le corsie di lanciare nella seconda dimensione. La bassa tensione e bassa percentuale gel serve per separare i frammenti di DNA in primo luogo sulla base delle dimensioni. </li><li> Per la seconda dimensione, corsie gel sono fette fuori del gel prima dimensione usando un coltello da macellaio di grande. Prima corsia contenente il marcatore lambda Hind III possono essere colorati con bromuro di etidio. Utilizzando il lambda marcatore Hind III come coltura guida, e scartare la regione del gel che è al di sotto dove il plasmide linearizzato è previsto per l'esecuzione. In queste condizioni, troviamo che pBR322 linearizzato corre leggermente al di sopra del cyanol xilene macchia. </li><li> Per lanciare la seconda dimensione, ogni corsia è posto orizzontalmente nella parte superiore di un gel caster vuoto. Una soluzione di 1,0% di agarosio in TBE 1X è preparato e raffreddato a 55 ° C. A questo punto, la soluzione gel viene versato per lanciare la seconda dimensione, avendo cura di coprire completamente le fette di gel. Una volta che il gel ha creato, è gestito in 6.5V/cm in una unità di elettroforesi che permette il buffer di ricircolo. Noi di solito eseguire la seconda dimensione ~ 5,5-7 ore. L'alta tensione e alta cento gel separa in modo efficace i frammenti di DNA in base alla loro forma, così come le dimensioni. Forme non lineari eseguire più lentamente attraverso la seconda dimensione. </li><li> A seguito di elettroforesi, il gel viene poi sciacquato in H 2 O, lavate due volte in 400 ml di acido cloridrico 0.25M per 15 minuti, sciacquati con H 2 O, e quindi lavato due volte in 400 ml di NaOH 0.4M per 30 minuti. L'acido lava servono a parzialmente nick le molecole di DNA in frammenti più piccoli che il trasferimento in modo più efficiente. Questo passaggio è necessario a causa delle grandi dimensioni e forme insolite di intermedi replicazione del DNA. </li><li> Il DNA nel gel viene poi trasferito in un Hybond N + membrana di nylon 4. Usiamo un sistema di trasferimento verso il basso alcali con NaOH 0.4M. In breve, due fogli di carta assorbente imbevuta di 0.4M NaOH sono disposti su un grande pila di tovaglioli di carta. La membrana di nylon è anche intriso di NaOH 0.4M e posto sulla parte superiore della carta assorbente. Il gel viene poi accuratamente a strati in cima a questa, seguita da un altro pezzo di carta assorbente, bagnato nella soluzione di NaOH. Infine, un lungo pezzo di carta assorbente bagnata è stratificato nella parte superiore e le sue due estremità sono posti in una specialità contenente 1 L di soluzione 0.4M di NaOH a servire come uno stoppino. Noi di solito lasciare che il trasferimento del DNA per ore 6-12. </li><li> La membrana di nylon è stato rimosso, lavato 20-30 secondi a 5X Buffer SSC, e messo in una bottiglia rullo ibridazione contenente soluzione 10.5ml Prehybridization. Poi, la membrana viene incubata a 42 ° C con rotazione per più di 6 ore. Prehybridization soluzione: <ul><li> 5,0 ml formamide </li><li> 0,5 ml 20% SDS </li><li> 2,5 ml 20X SSC * </li><li> * 2,0 ml di 50X Denhardt </li><li> 0,5 ml di sperma DNA Salmon (10mg/ml) * Ricette per SSC e Denhardt si possono trovare in 5 </li></ul></li><li> Durante il periodo prehybridization, 1 mg di plasmide pBR322 è marcato con 32P dalla traduzione nick secondo il protocollo fornito da alfa Roche utilizzando l'etichetta [32 P]-dCTP. La sonda radiomarcata (100μl) è denaturato incubando a 98 ° C per 10 minuti in una provetta tappo a vite, e poi messo immediatamente in ghiaccio. </li><li> La sonda denaturato viene aggiunta a 5,9 ml di soluzione di ibridazione, che contiene: <ul><li> 3,0 ml formamide </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml di 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml 20% SDS </li><li> 0,15 ml 10mg/ml Salmone DNA dello sperma </li></ul></li><li> La soluzione prehybridization viene versata dalla bottiglia rullo e la soluzione di ibridazione viene versata in bottiglia Il rullo viene quindi restituito ai 42 ° C incubatore e ruotato per più di 12h. </li><li> La soluzione di ibridazione viene versata dalla bottiglia rullo. Poi, la macchia è lavata 4 volte per 20 minuti in bottiglia rullo con circa 150 ml di una soluzione di lavaggio contenente 0.5X SSC, 0,1% SDS a 42 ° C con rotazione. </li><li> Dopo l'ultimo lavaggio, la membrana è posta su un tovagliolo di carta fino a quando il liquido è visibilmente scomparso. La membrana viene poi avvolto in polivinile cloruro di pellicola trasparente e esposti a uno schermo phosphorimager. Noi visualizzare e quantificare la radioattività utilizzando una tempesta 840 e il suo software associati ImageQuant. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Intermedi di replicazione plasmide osservato in presenza e in assenza di raggi UV-indotto danni al DNA. Il modello migratorio di PvuII digerito pBR322 plasmide osservato da 2D-gel di agarosio-analisi è diagramma. Plasmidi lineari non replicare eseguito come lineare da 4,4 kb frammento. Plasmidi replicare forma ad Y strutture che migrano più lentamente i frammenti a causa della loro maggiore dimensione non replicare e nonforma nlinear. Questo modello migratorio forma un arco che si estende fuori dalla regione lineare verso il pozzo. In seguito a irradiazione UV, doppia-Y o X a forma di molecole sono osservate nella regione del cono che migra più lentamente l'arco a forma di Y molecole. Un esempio di analisi del sud del gel 2D sondato con marcato con 32P pBR322 è indicato per le cellule immediatamente dopo l'irradiazione UV e 15 minuti dopo l'irradiazione UV (riprodotto con il permesso dell'editore).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I risultati tipici ottenuti da cellule di tipo selvatico in presenza e in assenza di danno indotto dai raggi UV sono mostrati in figura 1. In assenza di danni, ~ 1% del DNA totale plasmide si possono trovare nell&#39;arco Y quando le cellule sono in rapida crescita in fase esponenziale. A seguito di irradiazione, un aumento transitorio delle molecole a forma di Y si osserva come le forcelle replica bloccato accumulano nei siti danneggiati. La forma di X intermedi replica anche transitoriamente si accumulano e persistono...

<table><tbody><tr><td>Esempio di analisi Southern del gel 2D sottoposto a sonda</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>Lampada germicida da 15 &amp;mu;watt</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>Lampada UV</td></tr><tr><td>Misuratore di intensità UV Blak-Ray 254 nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>Fotometro UVC</td></tr><tr><td>Dischi con pori da 0,025 &amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Dischi per dialisi galleggianti</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Endonucleasi di restrizione</td></tr><tr><td>Kit per la traduzione a nick</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Per ottenere una sonda marcata con 32P</td></tr><tr><td>Carta da trasferimento</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Per il trasferimento Southern</td></tr><tr><td>Membrana in nylon</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Per il trasferimento Southern</td></tr></tbody></table>

visualizzazione dei raggi uv-indotta intermedi replica in e. coli utilizzando bidimensionale agarosio-gel analisi

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Replica inesatte in presenza di danno al DNA è responsabile della maggior parte dei riarrangiamenti cellulare e mutagenesi osservato in tutti i tipi di cellule ed è ampiamente creduto di essere direttamente associati con lo sviluppo del cancro negli esseri umani. Danno al DNA, come quella indotta da radiazioni UV, limita fortemente la capacità di replicazione di duplicare il modello di genomica con precisione. Un certo numero di prodotti genici sono stati identificati, che sono necessari quando la replicazione incontra le lesioni del DNA nel modello. Tuttavia, una sfida che rimane è stato quello di determinare come queste lesioni processo di proteine ​​durante la replica<em&gt; In vivo</em&gt;. Utilizzando Escherichia coli come sistema modello, si descrive una procedura in cui bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare gli intermedi strutturali che sorgono su plasmidi replicare<em&gt; In vivo</em&gt; Segue indotte dai raggi UV danno al DNA. Questa procedura è stata utilizzata per dimostrare che le forcelle replica bloccato dal danno indotto dai raggi UV subiscono un&#39;inversione transitoria che è stabilizzata da Reca e dei prodotti genici diversi relativi alla via RECF. La tecnica dimostra che questi intermedi replica vengono mantenute fino a un tempo che si correla con la rimozione delle lesioni da riparazione per escissione dei nucleotidi e riprende la replica.

Vi presentiamo una procedura che bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare la struttura degli intermedi di replica che si verificano dopo irradiazione UV.

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

La replicazione inaccurata in presenza di danni al DNA è responsabile della maggior parte dei riarrangiamenti cellulari e della mutagenesi osservati in tutti i tipi cellulari...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare gli intermedi strutturali del DNA che si formano quando la replicazione incontra lesioni del DNA, mediante analisi elettroforetica su gel bidimensionale. Questo risultato si ottiene isolando innanzitutto il DNA da cellule in attiva divisione in cui sono state indotte lesioni bloccanti la replicazione. Successivamente, l'elettroforesi su gel viene utilizzata per separare il DNA recuperato in base alle dimensioni.Successivamente, le corsie vengono ritagliate e ricollocate orizzontalmente in un secondo gel che separa ulteriormente il DNA in base a dimensione e forma. Infine, l'analisi southern viene utilizzata per visualizzare le strutture del DNA associate ai frammenti di DNA in replicazione in momenti precedenti e successivi all'introduzione di danni indotti da raggi UV. In definitiva, questa procedura può dimostrare che l'incapacità di elaborare lesioni del DNA in determinati mutanti porta all'accumulo di intermedi della riparazione del DNA.Ciao, mi chiamo Arthur Ian. Provengo dal laboratorio Corella della Portland State University. Ciao, mi chiamo Brand she, anch'io provengo dal laboratorio Corella.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'elettroforesi in gel bidimensionale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare gli intermedi della replicazione e della riparazione del DNA. Cominciamo dunque.Per iniziare questa procedura, coltivare una cultura notturna di 200 microlitri di e coli contenente il plasmide PBR 3 22 in mezzo DGC thigh con ampicillina a 37 gradi Celsius. L'uso del mezzo DGC thigh minimizza la schermatura UV. Dopo l'incubazione notturna, centrifugare le cellule a 14.000 RRP M per 30 secondi.Sospendere quindi il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo DG C th privo di ampicillina e inoculare. Coltivare 20 millilitri di mezzo DG C thigh senza selezione con ampicillina in un incubatore sotto agitazione a 37 gradi Celsius fino a un OD 600 di 0,5, che corrisponde a circa cinque per 10 alla ottava cellule per millilitro. La crescita senza ampicillina evita la selezione contro intermediari di replicazione anomali o non produttivi che potrebbero formarsi in alcuni mutanti.Inoltre, se si utilizza la luce UV per indurre danni, è necessario rimuovere l'ampicillina dal mezzo poiché assorbe fortemente a queste lunghezze d'onda e scherma le cellule, riducendo così la dose efficace di UV durante la crescita cellulare. Utilizzare un fotometro UVC per determinare la distanza da una lampada germicida da 15 watt che produca una velocità di esposizione di circa un JUUL per metro quadrato al secondo.I passaggi successivi devono essere eseguiti sotto luce gialla, poiché ciò impedirà la reversione fotoindotta dei dimeri di ciclobutano pirimidinici mediata dalla fotoliasi dopo l'irradiazione UV. Una volta raggiunta la densità cellulare desiderata, utilizzare una pipetta per trasferire la coltura in una piastra di Petri di diametro 15 centimetri posta su una piattaforma rotante, al fine di garantire un'irradiazione uniforme dell'intera popolazione cellulare. Successivamente, irradiare le colture con 50 joule per metro quadrato e trasferirle immediatamente in un flacone sterile preriscaldato, quindi riposizionarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione. Per tutta la durata dell'esperimento, questa dose produce in media un dimero ciclobutano perinico ogni 4,5 chilobasi di DNA a filamento singolo per ciascun punto temporale da esaminare. Pipettare un'aliquote di 0,75 millilitri della coltura in 0,75 millilitri di buffer NET 30 freddo di ghiaccio. Il buffer NET 30 funge da buffer di arresto che impedisce il proseguimento della replicazione e della riparazione mediante escissione di nucleotidi.Dopo l'aggiunta del buffer di arresto, il campione può essere mantenuto sul ghiaccio fino al termine del corso temporale. Al termine del corso temporale, centrifugare ogni campione e risospendere i pellet. In 150 microlitri di buffer di lisi, lisare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti senza agitazione.Poiché le strutture replicanti con regioni a singolo filamento o punti di ramificazione sono più soggette a rottura meccanica, tagliare la punta delle pipette con una lametta per allargarne l'imboccatura e ridurre al minimo le forze di taglio. In generale, è consigliabile limitare al minimo le operazioni di pipettaggio e di agitazione fino a quando il DNA non è stato digerito con enzimi di restrizione; dopo la lisi, aggiungere proteinasi K e sarcosina e proseguire l'incubazione per un'ora. Questo passaggio serve a liberare i frammenti di DNA associati alle proteine.Poiché il DNA in replicazione attiva è spesso legato a complessi proteici o di membrane, ciò contribuisce ad aumentare il rendimento dei frammenti di replicazione. Dopo un'ora, estrarre i campioni aggiungendo due volumi di fenolo a ciascun campione e capovolgendo delicatamente i tubi per cinque minuti. Quindi aggiungere due volumi di cloroformio, isoamilico, alcol, e capovolgere delicatamente i tubi per ulteriori cinque minuti.Successivamente, centrifugare i campioni a 14.000 g in una microcentrifuga per cinque minuti e trasferire la fase acquosa superiore di ciascun campione in una provetta pulita. Aggiungere quindi quattro volumi di alcol ISO cloroformio e, nuovamente, capovolgere delicatamente le provette per cinque minuti. Centrifugare nuovamente i campioni a 14.000 g per cinque minuti.Posizionare una membrana da dialisi su 250 millilitri di 0.1 xte in un becher e applicare 100 microlitri di ogni campione sulla membrana. Lasciare dializzare i campioni per un'ora dopo la dialisi. Trasferire 80 microlitri di ogni campione in una nuova provetta da 1,5 millilitro contenente 20 microlitri di mix enzimatico.Digerire i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius. PV due linearizza il plasmide appena a valle dell'origine di replicazione. Prima di caricare il gel di agarosio, aggiungere 100 microlitri di cloroformio e 20 microlitri di colorante di carico sei x contenente bromo.Fenolo blu e xilene cianolo aggiunti a ogni campione e la miscelazione con cloroformio rimuoveranno qualsiasi residuo di PV due legato alle estremità del DNA. Iniziare l'analisi bidimensionale su gel di agarosio eseguendo i campioni di DNA digeriti nella prima dimensione. Caricare innanzitutto un marcatore di dimensione Lambda Hind tre nella prima corsia di un gel di agarosio 0,4% precedentemente preparato in 1X TBE.Quindi caricare 40 microlitri della fase acquosa contenente il colorante di caricamento per ogni campione, saltando le corsie per facilitare il taglio del gel. Dopo l'elettroforesi, eseguire la prima dimensione a un volt per centimetro per circa 12-15 ore. La bassa tensione e il gel di AGROS a bassa percentuale servono a separare i frammenti di DNA principalmente in base alla dimensione.Dopo aver eseguito la prima dimensione, utilizzare un grande coltello da macellaio per ritagliare la prima corsia contenente il marcatore Lambda HindIII e colorare con bromuro di ateridio. Per la seconda dimensione, ritagliare le corsie del gel utilizzando il coltello da macellaio e il marcatore Lambda HindIII come guida di riferimento, scartando la regione al di sotto della posizione in cui ci si aspetta che il plasmide linearizzato migri in ciascuna corsia. Per realizzare la seconda dimensione, posizionare ogni frammento orizzontalmente lungo il bordo superiore di un supporto per gel vuoto.Preparare una soluzione di AROS al 1% in un XTBE e raffreddarla a 55 gradi Celsius. Una volta raffreddata, versare la soluzione del gel per realizzare la seconda dimensione, assicurandosi di coprire completamente le fette di gel. È importante garantire che le fette siano orientate uniformemente e che il supporto sia in bolla prima di versare il gel.Una volta che il gel si è solidificato, eseguire la seconda dimensione per cinque ore e mezza fino a sette ore a 6,5 volt per centimetro in un apparato di elettroforesi che permette al tampone di ricircolare; il gel ad alta percentuale di agarosio separa efficacemente i frammenti di DNA in base alla loro forma oltre che alle dimensioni. Le forme non lineari migrano più lentamente attraverso la seconda dimensione dopo l'elettroforesi. Risciacquare il gel una volta con acqua, quindi lavarlo due volte in 400 millilitri di acido cloridrico 0,25 molare per 15 minuti con agitazione delicata.I lavaggi acidi hanno lo scopo di intaccare parzialmente le molecole di DNA, frammentandole in pezzi più piccoli che si trasferiscono in modo più efficiente durante l'analisi Southern; tali lavaggi sono necessari a causa delle grandi dimensioni e della forma insolita degli intermedi della replicazione del DNA. Per preparare il gel al trasferimento alcalino, risciacquare nuovamente il gel in acqua, quindi lavarlo due volte in 400 millilitri di idrossido di sodio 0,4 molare per 30 minuti. Il DNA presente nei gel viene quindi trasferito su una membrana di nylon ad alto legame n+ mediante un sistema di trasferimento alcalino verticale discendente, utilizzando idrossido di sodio 0,4 molare come descritto nella parte scritta di questa procedura; lasciare avvenire il trasferimento del DNA per sei-dodici ore. Al termine del trasferimento del DNA, procedere con l'ibridazione della sonda come indicato nel protocollo scritto.Dopo aver effettuato la sonda sulla membrana e averla lavata, posizionare la membrana su un tovagliolo di carta finché il liquido non sarà visibilmente scomparso. Quindi avvolgere la membrana in una pellicola di cloruro di polivinile e esporla a uno schermo di un fospoimager. Infine, la radioattività può essere visualizzata e quantificata utilizzando un Storm Eight 40 e il software associato Image Quant.Il profilo di migrazione del plasmide PBR 322 digerito con PV, osservato mediante analisi in gel aros 2D, è schematizzato. I plasmidi lineari non replicanti migrano come frammento lineare di 4,4 kb, mentre i plasmidi replicanti formano strutture a forma di Y che migrano più lentamente rispetto ai frammenti non replicanti a causa delle loro maggiori dimensioni e della conformazione non lineare. Questo profilo di migrazione forma un arco che si estende dalla regione lineare verso il pozzetto dopo irradiazione con UV.Si osservano molecole a forma di doppia Y o X nella regione del cono e queste migrano più lentamente rispetto all'arco di molecole a forma di Y. Un esempio dell'analisi southern su gel 2D sonda con PBR 3 22 marcato con P 32 è mostrato per cellule immediatamente dopo l'irradiazione con UV e 15 minuti dopo l'irradiazione con UV immediatamente dopo l'irradiazione con UV. Circa l'1% del DNA plasmidico totale può essere trovato nell'arco Y quando le cellule sono in rapida crescita nella fase esponenziale successiva a una radiazione.Si osserva un aumento transitorio di molecole a forma di YS quando le forcelle di replicazione bloccate si accumulano in corrispondenza di siti danneggiati. Gli intermedi di replicazione a forma di L si accumulano anch'essi in modo transitorio e persistono fino a un momento che corrisponde al tempo di riparazione delle lesioni. Vi abbiamo appena mostrato come visualizzare gli intermedi della riparazione del DNA mediante elettroforesi su gel bidimensionale.Quando si esegue questa procedura, è importante prestare attenzione alle forze di taglio che possono ridurre il rendimento e trattare con delicatezza tutti i campioni e i gel. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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