Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare gli intermedi strutturali del DNA che si verificano quando la replicazione incontra le lesioni del DNA utilizzando l'analisi bidimensionale su gel. Ciò si ottiene isolando prima il DNA dalle cellule in divisione attiva in cui sono state indotte lesioni che bloccano la replicazione. Quindi l'elettroforesi su gel viene utilizzata per separare il DNA recuperato in base alle dimensioni.

Successivamente, le corsie vengono ritagliate e rifuse orizzontalmente in un secondo gel che separa ulteriormente il DNA in base alle dimensioni e alla forma. Infine, l'analisi meridionale viene utilizzata per visualizzare le strutture del DNA associate alla replicazione di frammenti di DNA a volte prima e in vari momenti dopo l'introduzione del danno indotto dai raggi UV. In definitiva, questa procedura può essere utilizzata per dimostrare che l'incapacità di elaborare le lesioni del DNA in alcuni mutanti provoca l'accumulo di intermedi di riparazione del DNA.

Ciao, mi chiamo Arthur Ian. Vengo dal Corella Lab della Portland State University. Ciao, mi chiamo Brand she, anch'io vengo dal Corella Lab.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'elettroforesi su gel bidimensionale. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la replicazione del DNA e gli intermedi di riparazione. Quindi iniziamo.

Per iniziare questa procedura, coltivare una coltura notturna da 200 microlitri di e coli contenente il plasmide PBR 3 22 in terreno di coltura DGC con ampicillina a 37 gradi Celsius. L'uso del fluido di coltura DGC riduce al minimo la schermatura UV. Dopo l'incubazione notturna, pellettare le cellule a 14.000 RRP M per 30 secondi.

Quindi risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di terreno DG C th privo di ampicillina e inoculare. 20 millilitri di terreno di coltura DG C cosce crescono colture senza selezione di ampicillina. In un'incubatrice agitata a 37 gradi Celsius a un OD 600 di 0,5, che corrisponde a circa cinque volte 10 all'ottavo di cellule Per millilitro la crescita senza ampicillina evita la selezione contro intermedi di replicazione anormali o improduttivi che possono insorgere in alcuni mutanti.

Inoltre, se si utilizza la luce UV per indurre danni, la rimozione dell'ampicillina dal mezzo è necessaria perché assorbe fortemente a queste lunghezze d'onda e schermi. Le cellule riducono la dose efficace di UV mentre le cellule crescono. Utilizzare un fotometro UVC per determinare la distanza da una lampada germicida da 15 watt che produce un tasso di esposizione di circa un JUUL per metro quadrato al secondo.

I passaggi successivi devono essere eseguiti sotto luce gialla in quanto ciò impedirà l'inversione della fotoriattivazione dei dimeri della ciclobutano perina mediante fotoliasi dopo l'irradiazione UV. Una volta raggiunta la densità cellulare desiderata, utilizzare una pipetta per trasferire la coltura in una piastra di Petri di 15 centimetri di diametro su una piattaforma rotante per garantire un'irradiazione uniforme dell'intera popolazione cellulare. Successivamente, irradiare le colture con 50 joule per metro quadrato e trasferirle immediatamente in un pallone sterile di preriscaldamento e rimetterle nell'incubatore a 37 gradi Celsius.

Per tutta la durata dell'esperimento, questa dose produce in media un dimero perinico ciclobutano, ogni 4,5 kilobasi di DNA a singolo filamento per ogni punto temporale da esaminare. Pipettare un'aliquota da 0,75 millilitri di coltura in 0,75 millilitri di ghiaccio freddo netto 30. La rete tampone 30 funge da tampone di arresto che impedisce la replicazione e la riparazione dell'escissione nucleotidica.

Una volta aggiunto il tampone di arresto, il campione può essere mantenuto in ghiaccio fino alla fine del corso temporale. Trascorso il tempo, pellettare ogni campione e risospendere i pellet. In 150 microlitri di lisi tampone licare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti senza agitazione.

Poiché le strutture replicanti con regioni a filamento singolo o punti di ramificazione sono più suscettibili al taglio, tagliare le punte delle pipette con una lama di rasoio per allargare la bocca e ridurre al minimo le forze di taglio. In generale, il pipettaggio e l'agitazione devono essere ridotti al minimo fino a quando il DNA non è stato digerito con enzimi di restrizione, dopo la lisi, aggiungere la proteinasi K e la cellula sarcas e lasciare che l'incubazione continui per un'ora. Questo serve a rilasciare frammenti di DNA associati alle proteine.

Poiché il DNA che si replica attivamente è spesso legato a complessi proteici o di membrana, questo aiuta ad aumentare la resa dei frammenti di replicazione. Dopo un'ora, estrarre i campioni aggiungendo due volumi di fenolo a ciascun campione e capovolgendo delicatamente le provette per cinque minuti. Quindi aggiungere due volumi di cloroformio, isoamile, alcol e capovolgere delicatamente le provette per altri cinque minuti.

Quindi, centrifugare i campioni a 14.000 giri/min in una microcentrifuga per cinque minuti e trasferire la fase acquosa superiore di ciascun campione in una provetta nuova. Quindi aggiungere quattro volumi di alcol ISO di cloroformio e, di nuovo, capovolgere delicatamente le provette per cinque minuti. Centrifugare nuovamente i campioni a 14.000 giri/min per cinque minuti.

Posizionare una membrana per dialisi su 250 millilitri di 0,1 xte in un becher e posizionare 100 microlitri di ciascun campione sulla membrana. Lasciare dializzare i campioni per un'ora dopo la dialisi. Mettere 80 microlitri di ciascun campione in una provetta fresca da 1,5 millilitri contenente 20 microlitri di miscela enzimatica.

Digerire i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius. PV 2 linearizza il plasmide appena a valle dell'origine della replicazione. Prima di caricare il gel agros, aggiungere 100 microlitri di cloroformio e 20 microlitri di colorante da carico 6 x contenente bromo.

Il blu fenolo e il ciano xilene a ciascun campione e il cloroformio miscelato rimuoveranno i due PV rimanenti legati alle estremità del DNA. Inizia l'analisi bidimensionale dell'aros gel facendo passare i campioni di DNA ristretti attraverso la prima dimensione. Per prima cosa caricare un marcatore Lambda hind di tre dimensioni nella prima corsia di un gel agros allo 0,4% precedentemente preparato in un XTBE.

Quindi caricare 40 microlitri della fase acquosa contenente il colorante di caricamento per ogni campione, saltando le corsie per facilitare l'affettatura del gel. Dopo l'elettroforesi, far funzionare la prima dimensione a un volt per centimetro per circa 12-15 ore. Il gel AGROS a basso voltaggio e bassa percentuale serve a separare i frammenti di DNA principalmente in base alle dimensioni.

Dopo che la prima dimensione è stata eseguita, usa un grosso coltello da macellaio per ritagliare la prima corsia contenente il tre marcatori posteriori Lambda e colorare con bromuro di aterio. Per la seconda dimensione, tagliare le corsie di gel usando il grande coltello da macellaio usando il marcatore Lambda Hind tre come coltura guida e scartare la regione sottostante dove si prevede che il plasmide linearizzato corra su ciascuna corsia. Per lanciare la seconda dimensione, posiziona ogni fetta orizzontalmente sulla parte superiore di una rotella di gel vuota.

Preparare una soluzione all'1% di AROS in un XTBE e raffreddare a 55 gradi Celsius. Una volta raffreddata, versare la soluzione di gel per fondere la seconda dimensione, avendo cura di coprire completamente le fette di gel. È importante assicurarsi che le fette siano orientate in modo uniforme e che la ruota sia a livello prima di versare il gel.

Una volta che il gel si è solidificato, eseguire la seconda dimensione, da cinque ore e mezza a sette ore a 6,5 vol per centimetro in un'unità di elettroforesi che consente al tampone di ricircolare l'alta tensione e l'alta percentuale di gel Agros separa efficacemente i frammenti di DNA in base alla loro forma e alle loro dimensioni. Le forme non lineari corrono più lentamente attraverso la seconda dimensione dopo l'elettroforesi. Sciacquare il gel in acqua una volta e poi lavarlo due volte in 400 millilitri di acido cloridrico molare 0,25 per 15 minuti con una leggera agitazione.

I lavaggi acidi servono a intaccare parzialmente le molecole di DNA in frammenti più piccoli che si trasferiscono in modo più efficiente durante l'analisi meridionale e sono necessari a causa delle grandi dimensioni e della forma insolita degli intermedi di replicazione del DNA. Per preparare il gel per il trasferimento degli alcali, sciacquare nuovamente il gel in acqua, quindi lavarlo due volte in 400 millilitri di idrossido di sodio molare 0,4 per 30 minuti. Il DNA nei gel viene quindi trasferito a una membrana di nylon n plus ad alto legame utilizzando un sistema di trasferimento alcalino verso il basso con idrossido di sodio 0,4 molare come descritto nella parte scritta di questa procedura, lasciare che il trasferimento del DNA per sei-12 ore dopo il trasferimento del DNA continui con l'ibridazione della sonda come indicato nel protocollo scritto.

Una volta che la membrana è stata sondata e lavata, posizionare la membrana su un tovagliolo di carta fino a quando il liquido non è visibilmente scomparso. Quindi avvolgere la membrana in un involucro di plastica di cloruro di polivinile ed esporla a uno schermo imager fosfo. Infine, la radioattività può essere visualizzata e quantificata utilizzando una tempesta 8 40 e la sua immagine quantitativa associata.

Viene schematizzato il modello di migrazione del plasmide PBR 3 22 digerito PV two osservato dall'analisi 2D aros gel. I plasmidi lineari non replicanti funzionano come strutture lineari a forma di Y a forma di plasmide replicanti frammenti da 4,4 KB che migrano più lentamente dei frammenti non replicanti a causa delle loro dimensioni maggiori e della forma non lineare. Questo modello di migrazione forma un arco che si estende dalla regione lineare verso il pozzo dopo l'irradiazione UV.

Le molecole doppie a forma di Y o X si osservano nella regione del cono e migrano più lentamente rispetto all'arco di molecole a forma di Y. Un esempio dell'analisi meridionale del gel 2D sondato con P 32 marcato PBR 3 22 è mostrato per le cellule immediatamente dopo l'irradiazione UV e 15 minuti dopo l'irradiazione UV immediatamente dopo l'irradiazione UV. Circa l'1% del DNA plasmatico totale si trova nell'arco Y quando le cellule crescono rapidamente in fase esponenziale a seguito di una radiazione.

Si osserva un aumento transitorio delle molecole a forma di YS quando le forcelle di replicazione bloccate si accumulano nei siti danneggiati. La replicazione a forma di L intermedia anche transitoriamente, si accumula e persiste fino a un tempo correlato con la riparazione delle lesioni. Vi abbiamo appena mostrato come visualizzare gli intermedi di riparazione del DNA utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale.

Quando si esegue questa procedura, è importante essere consapevoli delle forze di taglio che possono ridurre la resa ed essere delicati con tutti i campioni e i gel. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.