Blocco di replicazione mediato da proteine repressore marcato fluorescente in Escherichia coli

Prendiamo una coltura geneticamente modificata di E. coli che esprime un array di operatori cromosomici di tetraciclina (tetO).

I batteri portano anche un plasmide con un promotore indotto dall'arabinosa che favorisce l'espressione della proteina repressora tetraciclina marcata con YFP.

Trasferire la coltura in un mezzo nutriente arricchito contenente antibiotici e incubare con shaking per selezionare cellule contenenti plasmidi.

Man mano che le cellule crescono, si formano risposomi che avviano la replicazione cromosomica del DNA.

Nella fase esponenziale, raccogli una porzione come controllo non indusso.

Aggiungi arabinose, un induttore, alla coltura rimanente e incuba entrambe le colture con lo shaking.

Nella coltura non indotta, il dimero AraC rimane legato al loop del DNA, inibendo l'espressione del repressore.

Nella cultura indotta, l'arabinose si lega al dimero AraC, inducendo espressione repressiva.

Le proteine repressore si legano all'array cromosomico tetO, fermando la progressione della forchetta di replicazione.

Usa la microscopia a fluorescenza per osservare entrambe le colture.

I focus fluorescenti nella coltura indotta di E. coli confermano un blocco di replicazione mediato dalla proteina repressiva.

Per questa procedura viene utilizzato un ceppo di E. coli che trasporta un array operatore di tetraciclina nel plasmide pKM1. pKM1 codifica per TetR-YFP, una proteina repressore tetraciclina indotta con fluorescenza gialla.

Diluire una coltura fresca notturna di questo ceppo di E. coli a una densità ottica di 600 nanometri di 0,01 in un mezzo complesso diluito con antibiotici necessari per la selezione. Far crescere la coltura a 30 gradi Celsius con scuotimento fino a una densità ottica di 600 nanometri da 0,05 a 0,1. Rimuovi un campione da 10 millilitri per servire come controllo non indotto.

Aggiungere lo 0,01% di arabinosio alla coltura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a far crescere sia le colture non indotte che quelle indotte a 30 gradi Celsius con tremori. Dopo un'ora, si verifica la presenza di un singolo punto focale all'interno di ciascuna cellula della coltura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Se le cellule indotte sono confermate bloccate, indicato da oltre il 70% delle cellule con un unico foco, registrare la densità ottica e rimuovere 7,5 millilitri del campione per l'analisi tramite elettroforesi bidimensionale su gel. Rimuovere un campione equivalente dalla coltura di controllo non indotta.