Blocco di replicazione mediato da proteine repressore marcato fluorescente in Escherichia coli

Prendiamo una coltura geneticamente modificata di E. coli che esprime un array di operatori cromosomici di tetraciclina (tetO).

I batteri portano anche un plasmide con un promotore indotto dall'arabinosa che favorisce l'espressione della proteina repressora tetraciclina marcata con YFP.

Trasferire la coltura in un mezzo nutriente arricchito contenente antibiotici e incubare con shaking per selezionare cellule contenenti plasmidi.

Man mano che le cellule crescono, si formano risposomi che avviano la replicazione cromosomica del DNA.

Nella fase esponenziale, raccogli una porzione come controllo non indusso.

Aggiungi arabinose, un induttore, alla coltura rimanente e incuba entrambe le colture con lo shaking.

Nella coltura non indotta, il dimero AraC rimane legato al loop del DNA, inibendo l'espressione del repressore.

Nella cultura indotta, l'arabinose si lega al dimero AraC, inducendo espressione repressiva.

Le proteine repressore si legano all'array cromosomico tetO, fermando la progressione della forchetta di replicazione.

Usa la microscopia a fluorescenza per osservare entrambe le colture.

I focus fluorescenti nella coltura indotta di E. coli confermano un blocco di replicazione mediato dal