Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

In questa tecnica, i vetrini coprioggetto sono funzionalizzati con una miscela di molecole inerti e di biotina. Con questa superficie funzionalizzata viene creata una cella di flusso e posizionata su un microscopio per tappeti erbosi. Le maschere biotinilate del cerchio rotante sono fissate alla superficie utilizzando streptavidina multivalente.

Quando i substrati vengono replicati mediante l'aggiunta di proteine della zona repli e nucleotidi, il DNA a doppio filamento risultante viene esteso con flusso laminare e ripreso in tempo reale utilizzando un colorante intercollante. Ciao, sono Nathan Tanner del laboratorio di Antoine Van Ian presso il Dipartimento di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare della Harvard Medical School. Sono Joe Laro, anche lui del laboratorio Van Noian.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging a fluorescenza della replicazione del DNA in tempo reale a livello di singola molecola. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le attività coordinate di sintesi del DNA di singoli complessi di replicazione. Quindi iniziamo.

Per iniziare questa procedura, l'oligo della coda biotinilata al DNA a singolo filamento M 13 aggiunge un eccesso di dieci volte di oligo nel riscaldamento del tampone TBS a 65 gradi Celsius, quindi disattivando il blocco termico per consentire un raffreddamento lento per anedurre correttamente l'innesco. Ora che l'M 13 principale è pronto, aggiungerlo a una miscela di 64 nanomolari T sette DNA polimerasi e T sette tampone di replicazione contenenti D NDP e cloruro di magnesio e incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 12 minuti. Al termine dell'incubazione, spegnere con EDTA 100 millimolare.

Successivamente purificare il DNA del prodotto riempito con cloroformio di alcol isoamilico fenolico, estrarre e dializzare in tampone TE o altro tampone di conservazione adatto estrarre indietro ogni fase organica per recuperare eventuali residui innescati. M 13 dopo la dialisi determinare la concentrazione di DNA con spettrofotometro UV vis. Un'iterazione della preparazione del modello può produrre una concentrazione nanomolare sufficiente del modello per centinaia o migliaia di esperimenti su singole molecole.

Ora che il DNA è pronto, procedi alla preparazione dei vetrini funzionalizzati. Il DNA da replicare è attaccato a vetrini funzionalizzati con Amil Lane, il gruppo Oxy dell'Amil si lega al vetro lasciando un'ammina disponibile per legare le molecole di peg biotinilate. Questo rivestimento aiuta a ridurre il legame non specifico con la superficie.

Per pulire a fondo i vetrini di copertura, metterli in barattoli per colorare e riempire i barattoli con sonicato di etanolo. Per 30 minuti, sciacquare i barattoli e riempirli con un idrossido di potassio molare Sonicate per 30 minuti e ripetere entrambi i lavaggi. Per la prima reazione di funzionalizzazione, è necessario rimuovere tutte le tracce di acqua.

Riempi i barattoli di colorazione con acetone e sonica per 10 minuti. Svuotare i barattoli e riempirli nuovamente con acetone. Procedere con l'aggiunta del reagente sinusoidale ai barattoli e agitare per due minuti.

Quindi spegnere con un abbondante eccesso di acqua. Asciugate poi i vetrini di copertura cuocendoli a 110 gradi in forno per 30 minuti. Successivamente, preparare la miscela PEG a circa lo 0,2% in peso per volume con un piolo inato, compreso un distanziatore di vetro per vetrini che consentirà la separazione dei vetrini, pipettare 100 microlitri su un vetrino di copertura siloizzato a secco.

Posizionare un secondo vetrino coprioggetto sopra. Incubare i vetrini coprioggetti nella soluzione PEG per tre ore. Quindi separare ogni paio di vetrini coprioggetti e lavare abbondantemente con acqua.

Fare attenzione a mantenere i vetrini funzionalizzati con il lato rivolto verso l'alto in quanto solo un lato sarà rivestito con il piolo. Infine, asciugare i vetrini coprioggetto con aria compressa e conservarli sottovuoto in un essiccatoio, le superfici rimangono stabili per almeno un mese. In questo modo è possibile realizzare decine di vetrini coprioggetto in un lotto e utilizzarli secondo necessità.

Ora che i vetrini coprioggetti sono pronti, è possibile assemblare la camera di flusso per l'esperimento della singola molecola. Inizia mettendo da 20 a 25 millilitri di tampone bloccante contenente BSA in un essiccante per rimuovere eventuali bolle d'aria per i passaggi successivi. Successivamente, diluire 25 microlitri di streptavidina in 100 microlitri di PBS e stendere la soluzione sulla superficie di un piolo funzionalizzato Cover slip incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire alla streptavidina di legarsi alla biotina superficiale mentre si preparano altre parti della camera.

Mentre il vetrino coprioggetto è in incubazione, tagliare un pezzo di nastro biadesivo con supporto su entrambi i lati in modo che corrisponda alle dimensioni del vetrino di quarzo utilizzato per assemblare la camera di flusso. Segnare la posizione dei fori del tubo sul nastro con una matita in modo che sul nastro possa essere disegnato un contorno della camera di flusso. Dopo aver segnato i fori, creare un rettangolo largo due millimetri attorno ai segni.

Questo rettangolo fungerà da canale di flusso, quindi assicurati di fare i lati dritti e lasciare spazio attorno all'ingresso e all'uscita del tubo. Ora taglia il nastro segnato lungo il contorno disegnato, facendo tagli dritti e netti per assicurarti che l'adesivo non sporga nel canale. Pulire accuratamente il vetrino di quarzo utilizzando acetone per rimuovere l'adesivo dalla struttura della cella di flusso utilizzata negli esperimenti precedenti.

Trova il miglior allineamento del contorno del canale. Rimuovere un lato del supporto adesivo e posizionare con cura il nastro sul vetrino del campo. Fare attenzione ad allineare correttamente il nastro poiché i fori di ingresso e uscita devono rimanere non ostruiti.

Quindi, preparare le lunghezze di taglio del tubo di 0,76 millimetri per l'ingresso e l'uscita della cella di flusso. Aiuta a tagliare l'estremità del tubo con un angolo di circa 30 gradi in modo che il tubo non prema contro il fondo della camera. Sospendere il tubo su rack per provette per un facile fissaggio alla cella di flusso nei passaggi successivi.

A questo punto l'incubazione del vetrino coprioggetto è terminata. Sciacquare accuratamente il vetrino coprinte rivestito con ENC con acqua e asciugarlo con aria compressa. Fare attenzione a non capovolgere il vetrino coprioggetto in quanto solo un lato è funzionalizzato.

Infine, completare il montaggio della camera di flusso rimuovendo l'altro lato del supporto del nastro e posizionando il vetrino al quarzo sul vetrino coprioggetti. Premere leggermente sul vetrino coprioggetti per espellere l'aria intrappolata nell'adesivo. Ciò contribuirà a prevenire l'ingresso di bolle d'aria nel canale di flusso.

Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e sigillare in posizione con resina epossidica e lasciare asciugare per alcuni minuti. Quando la guarnizione epossidica è asciutta, iniziare a bloccare la superficie.

Utilizzando un ago calibro 21. Tirare un po' del tampone di blocco Degas attraverso uno dei tubi. Sciacquare alcune volte per rimuovere le bolle d'aria e lasciare incubare la camera per almeno mezz'ora prima di passare alla replicazione della singola molecola. Rsperimento.

Ora che la cella di flusso è stata bloccata, posizionarla sul tavolino del microscopio. Tenere la camera in posizione con le clip del tavolino e assicurarsi che il canale di flusso sia allineato lungo l'asse y. Collegare il tubo di uscita della cella di flusso alla pompa a siringa utilizzando un tubo di collegamento di diametro maggiore.

Posizionare l'ingresso nel tampone di blocco e tirare indietro la siringa per rimuovere l'aria nel tubo. Un leggero movimento del tubo di uscita aiuterà a eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nella cella di flusso. Ora aggiungi il DNA, diluisci il modello di DNA stock a 25 picomolari in un millilitro di blocco del flusso di tampone nella camera a una velocità di flusso moderata come 0,025 millilitri al minuto per 30 minuti per consentire una buona copertura superficiale del DNA.

Una volta che il DNA è nella camera, lavare via il DNA in eccesso utilizzando il tampone bloccante per almeno 200 volumi di cellule a flusso. Per sbarazzarsi di tutto il DNA libero, accendi il laser e la fotocamera. Il CCD raffreddato deve raggiungere la temperatura prima di poter essere utilizzato.

Dopo aver lavato via il DNA in eccesso e degassato il tampone di replicazione, preparare la reazione di replicazione, mescolare i nucleotidi DTT e la citossina del tampone di replicazione. Quindi aggiungere le proteine e mescolare delicatamente. Quindi far fluire la miscela di reazione nella cella di flusso.

La velocità del flusso qui deve essere sufficiente per allungare il DNA a doppio filamento per una larghezza di due millimetri. Il canale di flusso alto 100 micrometri, 0,04 millilitri al minuto, funziona bene. Lasciare che la miscela entri nella camera per circa 10 minuti.

Spostare il campo visivo sul lato del canale e concentrarsi sul materiale adesivo per assicurarsi di essere vicini alla superficie per la messa a fuoco e per iniziare l'imaging. Regola la potenza del laser, la messa a fuoco del microscopio e l'angolo del tappeto erboso. Mantenere la potenza bassa per evitare qualsiasi fotoscissione del DNA macchiato.

Acquisisci da uno a cinque fotogrammi al secondo per diversi minuti a seconda della velocità di replicazione del DNA. Ripetere per ottenere traiettorie di replicazione più lunghe o passare a un nuovo campo per vedere più molecole quando quasi tutta la miscela di reazione è stata pompata nel flusso cellulare in più tampone con cyt per vedere altri campi visivi. L'acquisizione di più immagini di diverse molecole replicate fornisce statistiche per la determinazione della produttività.

Nel cerchio rotante. La sintesi della forza principale del saggio di replicazione estende la coda che collega il cerchio e la superficie, la coda viene convertita in DNA a doppio filamento dalla polimerasi del filamento in ritardo e allungata dal flusso laminare mostrato. Ecco un esempio di campo visivo con cyt orange a 532 nanometri di eccitazione.

I piccoli spot fluorescenti sono substrati legati e non replicati. Si noti l'estrema lunghezza dei prodotti e il gran numero di prodotti per campo. Un tipico campo visivo mostrerà numerose molecole replicanti visibili mentre le linee luminose crescenti degli esperimenti di DNAE Coli colorati a 37 gradi Celsius danno da cinque a 50 molecole per campo a seconda della densità della superficie.

La zona T seven repla si avvia in modo molto più efficiente e replica più del 50% delle molecole in un campo. Con una densità così elevata, è difficile risolvere le singole molecole come si vede qui. Quindi esegui l'esperimento T sette a concentrazioni proteiche più basse o densità superficiale I grafici di carillon delle tipiche molecole replicanti da e coli e gli esperimenti T sette includono le traiettorie finali delle molecole da e coli e T sette tracciate rispetto al tempo le traiettorie sono adattate con regressione lineare per ottenere tassi di replicazione, che in questo esempio sono 467,1 coppie di basi al secondo per e coli e 99,4 coppie di basi al secondo.

Per T sette, le distribuzioni di velocità delle traiettorie di singole molecole si adattano alle gaussiane singole danno una media di 535,5 più o meno 39 coppie di basi al secondo per e coli e 75,9 più o meno 4,8 coppie di basi al secondo. Per T sette, le distribuzioni di lunghezza dei prodotti di replicazione sono adattate con un singolo decadimento esponenziale per ottenere una produttività, che è 85,3 più o meno 6,1 coppie di kilobasi per e coli e 25,3 più o meno 1,7 coppie di kilobasi per G sette. Allora ti abbiamo appena mostrato come misurare la replicazione coordinata del DNA con singole molecole.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di funzionalizzare correttamente i vetrini coprioggetto e di creare canali di flusso rettilinei puliti. Assicurati di mantenere il carico di potenza del laser e di ridurre al minimo la scissione fotografica del DNA lungo. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.