Name: Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Impara a visualizzare la replicazione del DNA a singola molecola con microscopia a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo consente di studiare le attività coordinate dei replisomi individuali.

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Samir Hamdan aiutato nello sviluppo di questa tecnica. E. coli sono proteine ​​dal laboratorio del Prof. Nick Dixon, proteine ​​dell&#39;Università di Wollongong, e T7 sono dal Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. Il lavoro è supportato dal National Institutes of Health (GM077248 a AMvO) e Jane Coffin Childs Foundation (JJL).

Prima di eseguire una singola molecola esperimento replica, alcuni materiali devono essere preparate in anticipo. 1. DNA replica Template Il substrato per la reazione di replica è un biotinilato, coda M13 cerchio di rotolamento preparato utilizzando le normali tecniche di biologia molecolare 1,2. Materiali: M13mp18 DNA a singolo filamento, biotinilato fondo oligonucleotidi coda (5&#39;-Biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), la DNA polimerasi T7, blocco di calore, fenolo / alcool isoamilico / cloroformio <ol><li> Temprare il oligo biotinilato coda alla M13 con l&#39;aggiunta di 10 volte l&#39;eccesso di oligo in tampone TBS (330 nM coda di oligo, 33 nM M13). </li><li> Scaldare la miscela a 65 ° C nel blocco di calore. Una volta riscaldato, ruotare il blocco fuoco spento e consentire il raffreddamento lento a temprare correttamente il primer. </li><li> Aggiungere la M13 pronti a una miscela di 64 nM T7 polimerasi del DNA e la replicazione del buffer T7 contenente dNTP e MgCl 2. </li><li> Incubare la reazione a 37 ° C per 12 minuti e spegnere con 100 mM EDTA. </li><li> Purificare la compilati nel DNA del prodotto con fenolo / cloroformio / alcool isoamilico estrazione e Dializzare nel buffer TE o altri buffer di stoccaggio e determinare la concentrazione del DNA (Back-estrarre ogni fase organica di recuperare eventuali residui innescato M13). </li><li> Una iterazione di preparazione modello può facilmente rendere diversi ml di concentrazione nanomolari modello, sufficiente per centinaia di migliaia di singola molecola esperimenti. </li></ol> 2. Coprivetrini funzionalizzati Per fissare il DNA alla coprioggetto di vetro, il vetro viene prima funzionalizzati con un aminosilane, che viene poi accoppiato a molecole PEG biotinilato. Questo rivestimento consente di ridurre le interazioni non specifiche di DNA e proteine ​​replica con la superficie di 1,3. Materiali: coprioggetto di vetro, barattoli di colorazione, 3-amminopropiltrietossisilano, metossi-PEG5k NHS-estere, biotina-PEG5k-NHSester, acetone, KOH 1M, etanolo, Forno, sonicatore Bagno <ol><li> Pulire accuratamente i coprioggetti vetro mettendoli in colorazione vasi e riempire i vasi con etanolo. Con ultrasuoni per 30 minuti e sciacquare i vasi e riempire con 1 M KOH. Ultrasuoni per 30 minuti Ripetere i due lavaggi. </li><li> Per la reazione di funzionalizzazione primo, tutte le tracce di acqua devono essere rimosse. Riempite i barattoli con acetone e ultrasuoni per 10 min. Sciacquare i vasetti di nuovo con acetone. </li><li> Preparare un 2% v / v soluzione del reagente silano in acetone. Aggiungi ai contenitori per i lavaggi e agitare per 2 minuti. Questa reazione coppie del gruppo alcossi del aminosilane al vetro, lasciando una ammina reattiva per il passo successivo accoppiamento. Spegnere la reazione con un eccesso d&#39;acqua. </li><li> Asciugare il coprioggetto dalla loro cottura a 110 ° C in forno per 30 minuti. </li><li> Preparare un 50:1 metossi: biotina miscela PEG in 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Obiettivo per circa lo 0,2% w / v PEG biotinilato. </li><li> Pipettare 100 ul della miscela PEG su un vetrino asciutto silanizzata e posto un altro coprioggetti sopra. Compreso un distanziatore coprioggetto di vetro permette la separazione delle lamelle. </li><li> Incubare i coprioggetti nella soluzione di PEG per 3 ore, poi separare ogni coppia di coprioggetto e lavare a lungo con acqua. Fare attenzione a tenere i coprioggetti funzionalizzate verso l&#39;alto come unico lato una volta saranno rivestiti con PEG. </li><li> Asciugare il coprioggetto e conservare sotto vuoto. Le superfici sono stabili per almeno un mese, in modo da decine di coprioggetto può essere fatta in un batch ed utilizzato secondo necessità. </li></ol> Questi materiali devono essere fatte prima del tempo, e poi utilizzati per ogni esperimento. Per iniziare a sperimentare ogni singola molecola, iniziare l&#39;assemblaggio della camera di flusso. 3. Flusso Camera di preparazione L&#39;esperimento viene eseguita utilizzando una camera di flusso semplice costruito con un coprioggetto funzionalizzati, nastro biadesivo, una diapositiva quarzo e tubi. Una camera di flusso viene preparato per ogni singola molecola 1,4 esperimento. Materiali: su entrambi i lati del nastro, lametta, scivolo al quarzo con fori per tubi, ad asciugatura rapida epossidica, coprioggetto funzionalizzati (vedi sopra), soluzione Streptavidina (25 ml di 1 mg / ml in PBS), tubi, buffer di blocco (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Iniziare a collocarlo 20-25 mL di tampone di bloccaggio in un essiccatore per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria per fasi successive. </li><li> Prendete un PEG-funzionalizzati coprioggetto e diffusione di PBS-125 una soluzione diluita di streptavidina sulla superficie. Lasciare questo ad incubare per 20 minuti durante la preparazione di altre parti della camera, che permette di legare streptavidina biotins superficie. </li><li> Tagliare un pezzo di doppio latoNastro d in base alle dimensioni della diapositiva quarzo. Segnare la posizione dei fori tubo sul nastro con una matita in modo che il contorno della camera di flusso si possono trarre sul nastro (1 mg / mL). </li><li> Fai di 2 mm di larghezza rettangolo intorno ai fori. Questo servirà come canale di flusso, in modo da essere sicuro di fare i lati dritti e lasciare spazio attorno al tubo di ingresso e di uscita. Se lo si desidera, più canali o dimensioni diverse possono essere utilizzati. </li><li> Tagliare lungo il contorno disegnato, rendendo dritto, tagli netti per assicurarsi che non sporge adesivo nel canale. </li><li> Pulire il quarzo accuratamente con acetone o etanolo per rimuovere l&#39;adesivo dalla costruzione precedente cella di flusso. </li><li> Trova la migliore allineamento del contorno canale, rimuovere un lato del supporto adesivo e posizionare con attenzione il nastro sul vetrino di quarzo. Prestare attenzione ad allineare il nastro correttamente, come i fori di ingresso e di uscita devono rimanere sbloccato. </li><li> Tagliare le lunghezze dei tubi per l&#39;ingresso el&#39;uscita della cella di flusso. Essa aiuta a tagliare l&#39;estremità del tubo a circa 30 ° di inclinazione in modo che il tubo non si stampa contro il fondo piatto della camera. Posizionare i tubi su una sorta di sostegno di sospenderli per un facile montaggio della cella di flusso nelle fasi successive. </li><li> Sciacquare la streptavidina rivestite coprioggetto accuratamente con acqua e asciugare con aria compressa. Ricordati che solo un lato è funzionalizzato; fare attenzione a non trasformare il coprioggetto sopra. Rimuovere l&#39;altro lato del supporto a nastro e posto il vetrino di quarzo sul vetrino. </li><li> Premere leggermente il vetrino per far uscire l&#39;aria intrappolata nel adesivo. Questo aiuterà a evitare eventuali bolle d&#39;aria di entrare nel canale di flusso. </li><li> Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e tenuta in posizione con resina epossidica. Questo deve asciugare per qualche minuto. </li><li> Una volta asciutto, cominciano bloccando la superficie tirando alcuni dei buffer degasato blocco attraverso uno dei tubi. Un 21-gauge si adatta perfettamente all&#39;interno del tubo di 0,76 mm. Stanare un paio di volte per eliminare le bolle d&#39;aria, e permettere la camera di incubazione per almeno mezz&#39;ora. </li></ol> 4. Singola molecola di replica Experiment Materiali: camera di flusso preparati, SYTOX Orange, microscopio TIRF, 532 nm laser, telecamera CCD, computer con software di acquisizione delle immagini, Rolling-cerchio substrato DNA, proteine ​​di replica <ol><li> Dopo la cella di flusso è stato bloccato, tutto è pronto per iniziare la singola molecola esperimento. </li><li> Prendere la cella di flusso e posizionarlo sul palco microscopio. Tenere la camera in posizione con clip palco ed essere sicuri che il canale di flusso è posizionato dritto lungo l&#39;asse y. </li><li> Collegare la cella tubo di flusso in uscita per la pompa a siringa con un più grande tubo connettore diametro o un ago. Posto l&#39;ingresso nel tampone di bloccaggio e tirare indietro la siringa per rimuovere l&#39;aria nel tubo. Un film delicato del tubo di uscita aiuterà chiaro eventuali bolle d&#39;aria intrappolate nella cella di flusso. </li><li> Diluire il modello del DNA magazzino a 25 pM in 1 ml di tampone di bloccaggio. Flusso nella camera a portata moderata per consentire una buona copertura della superficie del DNA. 0,025 ml / min per 30 minuti funziona bene. Questo può essere variata in base al numero di molecole di DNA sono sulla superficie di ciascun lotto di coprioggetto o quanti sono voluti per l&#39;esperimento. </li><li> Una volta che il DNA è, lavare il DNA in eccesso con un tampone di bloccaggio. Lavare per almeno 200 volumi di flusso di cellule per sbarazzarsi di tutto il DNA libero. </li><li> Iniziare degasaggio il buffer di replica. Per la E. esperimenti replica coli, farlo a 37 ° C per ridurre il rischio di bolle nella camera di flusso riscaldato. </li><li> Accendere il laser e telecamera. Il CCD raffreddata deve raggiungere la temperatura prima di poter essere utilizzato. </li><li> Se si esegue a 37 ° C esperimento, girare la stufa. Assicurarsi che l&#39;obiettivo è a contatto con la cella di flusso o sarà un dissipatore di calore in seguito. </li><li> Dopo il lavaggio e degasaggio, la reazione può essere preparato. Nucleotidi mix, DTT, e SYTOX nel buffer di replica. Quindi aggiungere proteine ​​e mescolare delicatamente. </li><li> Flusso della miscela di reazione nella cella di flusso. Questa velocità di flusso deve essere sufficiente per allungare dsDNA. Per un 2-mm di larghezza, 100-micron canale di flusso alto 0,04 ml / min funziona bene. </li><li> Attendere che la miscela di entrare nella camera e iniziare imaging. Un buon consiglio è quello di spostare il campo di vista a lato del canale e concentrarsi sul materiale adesivo. Questo farà sì che sono vicino alla superficie messa a fuoco. </li><li> Regolare potenza del laser, messa a fuoco microscopio, e l&#39;angolo TIRF. Mantenere il potere basso per evitare qualsiasi photocleavage del DNA macchiato. Acquisire al 05/01 fotogrammi / secondo per diversi minuti a seconda del tasso di replicazione del DNA. Se lo si desidera, ripetere per ottenere traiettorie replica più o passare ad un nuovo campo per vedere di più molecole. </li><li> Dopo la miscela di reazione è quasi vuoto, è una buona idea di flusso in più tampone con SYTOX per vedere altri campi di vista. Prendendo immagini multiple di diverse molecole replicato fornisce statistiche per la determinazione processività. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Molecole di replicazione attiva sono facilmente visibili come linee crescente di DNA macchiato. Nei nostri esperimenti, che scorre 25 pM del substrato M13 dà 100-1000 molecole in una, 60x 125 micron x 125 micron campo di vista (Figura 1). Esecuzione di esperimenti di replica utilizzando la E. proteine ​​coli replisoma a 37 ° C (vedi Materiali per i dettagli) dà molecole 5-50 replicare per campo di vista. A concentrazioni equivalente del replisoma T7, che avvia sul substrato molto più efficiente, osserviamo&gt; 70% delle molecole in un campo di replicare. Queste condizioni producono una densità del prodotto così alto che le molecole individuali sono difficili da risolvere ed analizzare, per cui gli esperimenti vengono eseguiti T7 a concentrazioni inferiori di proteine. Analisi dei dati: per ottenere dati di frequenza, è sufficiente tracciare il punto finale del DNA in funzione del tempo e calcolare la pendenza (Figura 2). Per processività, determinare la lunghezza totale del DNA. Entrambi questi numeri dovranno essere convertiti in coppie di basi. Prima di eseguire l&#39;esperimento, si dovrebbe sapere la dimensione in pixel della fotocamera al proprio ingrandimento. Per la conversione basepair, una buona stima è semplicemente convertendo in base alla lunghezza cristallografica del DNA, 2,9 bp / nm. Tuttavia, il flusso laminare non sarà completamente allungare il DNA, così una calibrazione lunghezza del DNA deve essere effettuata prendendo un DNA noto lunghezza, ad esempio, 48.502 bp λ DNA, allegando alla cella di flusso con un oligo biotinilato e misurazione della SYTOX macchiato di lunghezza a la portata utilizzata per l&#39;esperimento di replica. Determinazione del numero di coppie di basi / pixel consente il calcolo preciso dei tassi di replicazione e processivities. Prendendo numerose immagini e filmati fornirà un gran numero di molecole di prodotto, permettendo di tracciare distribuzioni votare e processività (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (Da Rif. ​​1.) A), Cartoon del rolling-cerchio saggio di replica. (SA, streptavidina). Leader filo-sintesi si estende la coda che collega il cerchio e la superficie. La coda viene convertito in dsDNA dalla polimerasi filamento in ritardo e si estendeva dal flusso laminare. b) Esempio di campo di vista con SYTOX arancia e 532 nm di eccitazione. Piccole macchie fluorescenti sono legati, non replicate substrati. Si noti la estrema lunghezza dei prodotti e il gran numero di prodotti per campo (ogni cella di flusso contiene&gt; 5000 tali campi). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adattato da Rif. ​​1). A, b) Kymographs molecole tipiche di replicare da T7 (a) ed E. coli (b) esperimenti. c) traiettorie Endpoint di molecole da a) e b) tracciati in funzione del tempo. Traiettorie sono dotati di regressione lineare per ottenere tassi di replica. Esempi riportati sono 99,4 bp s -1 e 467,1 pb s -1. d) le distribuzioni Lunghezza di prodotti per la replica, in forma con singolo decadimento esponenziale di ottenere processività: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) le distribuzioni di frequenza delle traiettorie singola molecola, in forma con gaussiane singolo. Significa: 75,9 ± 4,8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Un controllo critico sta esaminando l&#39;effetto della macchia, SYTOX Orange, sulle proteine ​​replica di interesse. Un modo semplice per farlo è quello di eseguire l&#39;esperimento di replica nella cella di flusso, come descritto, ma con l&#39;omissione di SYTOX. Dopo la miscela di reazione è fluito attraverso la camera, aggiungere tampone con SYTOX a macchia di DNA ed esamina la ripartizione lunghezza delle molecole replicati. In alternativa, le reazioni di massa standard può essere utilizzato per verificare eventuali effetti di SYTOX sul tasso di replicazione e di efficienza. L&#39;esperimento descritto qui utilizza solo un singolo canale di flusso. Questo può essere cambiato facilmente con la creazione di multi-canale camere di flusso o con PDMS o simili dispositivi microfluidici. Aumentare il numero di canali facilita notevolmente lo screening delle concentrazioni di proteine, mutanti, o molecole inibitori ed aumenta la rapidità della raccolta di replica dei dati. Come detto, noi dobbiamo fare la E. coli esperimenti replica a 37 ° C con una casa costruita flusso riscaldatore cellula in alluminio, un elemento riscaldante resistivo (riscaldatore a cartuccia) e alimentatore variabile. Questo dà una buona stabilità della temperatura ed evita l&#39;acquisto di un riscaldatore obiettivo. Per calibrare il riscaldamento, abbiamo semplicemente praticato un foro al centro di un top quarzo cella di flusso, una termocoppia inserita nel canale di flusso e di buffer scorreva normalmente. Misurare la temperatura della cella di flusso del buffer a tensioni sempre più accurata permette di riscaldamento.

Replica T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutammato di potassio, 10 mM cloruro di magnesio, 100 mg / ml BSA, con mM ditiotreitolo 5, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 mM CTP, e 15 nM SYTOX Arancione aggiunto immediatamente prima uso. Proteine ​​aggiunto: 5 nM gp4 (esamero), 40 nM polimerasi (1:1 GP5: tioredoxina), 360 nm gp2.5 1,5. Replica E. coli: 50 HEPES mM pH 7,9, 12 mM acetato di magnesio, 80 mM di cloruro di potassio, 100 mg / ml BSA con mM ditiotreitolo 10, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs microM e 15 nM SYTOX Arancione aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso. Proteine ​​aggiunto come: 30 nM DnaB (esamero), 180 nM DnaC (monomero), 30 αεθ nM, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ o τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dimero), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramero), 20 nM Pria, 40 nM PriB, 320 nM PRIC, 480 nM DNAT 1,6

visualizzazione singola molecola di dna replica con microscopia a fluorescenza

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Descriviamo un semplice microscopio a fluorescenza basato in tempo reale metodo per osservare la replicazione del DNA a livello di singola molecola. Una circolare, modello di DNA biforcuta è collegato a un coprioggetto di vetro funzionalizzati e replicato ampiamente dopo l&#39;introduzione di proteine ​​e nucleotidi replica (Figura 1). La crescita dei prodotti a doppio filamento di DNA (dsDNA) è esteso a flusso laminare e visualizzati utilizzando un colorante intercalante. Misurare la posizione della fine del DNA in crescita in tempo reale permette la precisa determinazione del tasso di replicazione (Figura 2). Inoltre, la lunghezza dei prodotti di DNA completato rapporti sulla processività della replicazione. Questo esperimento può essere eseguita molto facilmente e rapidamente e richiede solo un microscopio a fluorescenza con una macchina fotografica abbastanza sensibile.

Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

Descriviamo un semplice metodo in tempo reale basato sulla microscopia a fluorescenza per l'osservazione della replicazione del DNA a livello di singola molecola. Un DNA circolare e forcut...

In questa tecnica, le lamelle di vetro vengono funzionalizzate con una miscela di molecole di PEG inerti e biotinilate. Viene creato una camera di flusso con questa superficie funzionalizzata e posizionata su un microscopio TIRF. I modelli circolari biotinilati vengono legati alla superficie mediante streptavidina multivalente.Quando i substrati vengono replicati mediante l'aggiunta di proteine della zona di replicazione e nucleotidi, il DNA a doppio filamento risultante viene allungato mediante flusso laminare e visualizzato in tempo reale utilizzando un colorante intercalante. Ciao, sono Nathan Tanner del laboratorio di Antoine Van Ian del Dipartimento di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare della Harvard Medical School. Sono anche Joe Laro del laboratorio Van Noian.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'imaging a fluorescenza della replicazione del DNA in tempo reale a livello di singola molecola. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le attività coordinate di sintesi del DNA nei singoli complessi di replicazione. Cominciamo dunque.Per iniziare questa procedura, aggiungere l'oligonucleotide con coda biotinilata al DNA a singolo filamento M13 aggiungendo un eccesso dieci volte dell'oligo nel buffer TBS, riscaldare a 65 gradi Celsius, quindi spegnere il blocco termico per consentire un raffreddamento lento e permettere l'annealing corretto del primer. Ora che il primer M13 è pronto, aggiungerlo a una miscela contenente la DNA polimerasi T7 a 64 nanomolar e il buffer di replicazione T7 contenente dNTP e cloruro di magnesio, quindi incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 12 minuti. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione con 100 millimolar di EDTA.Successivamente, purificare il DNA del prodotto riempito mediante fenolo-isoamile alcol-cloroformio, estrazione e dialisi in tampone TE o un altro tampone di conservazione adatto; effettuare nuovamente l'estrazione di ciascuna fase organica per recuperare qualsiasi primer residuo. Dopo la dialisi, determinare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro UV-vis. Un singolo ciclo di preparazione del template può produrre una concentrazione nanomolare sufficiente di template per centinaia o migliaia di esperimenti su singola molecola.Ora che il DNA è pronto, procedere alla preparazione dei vetrini funzionalizzati. Il DNA da replicare viene fissato su vetrini di vetro funzionalizzati con Amil Lane, il cui gruppo Ossigeno si lega al vetro lasciando un gruppo amminico disponibile per il legame con molecole di peg biotinilato. Questo rivestimento contribuisce a ridurre il legame non specifico alla superficie.Per pulire accuratamente i vetrini di vetro, posizionarli nei barattoli per colorazione e riempire i barattoli con etanolo sottoposto a sonica. Risciacquare i barattoli per 30 minuti, quindi riempirli con idrossido di potassio 1 M e sottoporre a sonica per 30 minuti; ripetere entrambi i lavaggi. Per la prima reazione di funzionalizzazione, è necessario rimuovere ogni traccia di acqua.Riempire i barattoli di colorante con acetone e sottoporre ad ultrasuoni per 10 minuti. Svuotare i barattoli e riempirli nuovamente con acetone. Procedere aggiungendo il reagente sine ai barattoli e agitare per due minuti.Quindi, spegnere la reazione con un eccesso abbondante di acqua. Successivamente, asciugare le lamelle riscaldandole a 110 gradi Celsius in forno per 30 minuti. Poi, preparare la miscela di PEG a circa lo 0,2% in peso per volume mediante PEG aminato; l'inserimento di un distanziatore di vetro sotto la lamella permetterà la separazione delle lamelle; pipettare 100 microlitri sulla lamella silanizzata e asciutta.Posizionare un secondo vetrino coprioggetto in alto. Incubare i vetrini coprioggetto nella soluzione di PEG per tre ore. Successivamente, separare ogni coppia di vetrini coprioggetto e lavare abbondantemente con acqua.Attenzione a mantenere i coprioggetti con il lato funzionalizzato rivolto verso l'alto, poiché solo un lato sarà rivestito con peg. Infine, asciugare i coprioggetti con aria compressa e conservarli sotto vuoto in un essiccatore; le superfici rimangono stabili per almeno un mese. In questo modo, si possono produrre dozzine di coprioggetti in un unico lotto e utilizzarli secondo necessità.Ora che i coprioggetti sono pronti, è possibile assemblare la camera di flusso per l'esperimento a singola molecola. Iniziare versando da 20 a 25 millilitri di buffer bloccante contenente BSA in un desiccante per rimuovere eventuali bolle d'aria nei passaggi successivi. Successivamente, diluire 25 microlitri di streptavidina in 100 microlitri di PBS e distribuire la soluzione sulla superficie di un coprioggetto funzionalizzato con perni, quindi incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire alla streptavidina di legarsi alla biotina superficiale, mentre si preparano le altre parti della camera.Mentre il vetrino coprioggetto è in incubazione, tagliare un pezzo di nastro adesivo doppio lato con supporto su entrambi i lati in modo che corrisponda alle dimensioni del vetrino in quarzo utilizzato per assemblare la camera di flusso. Segnare la posizione dei fori per i tubi sul nastro con una matita in modo da poter disegnare un contorno della camera di flusso sul nastro. Dopo aver segnato i fori, tracciare un rettangolo largo due millimetri intorno alle marcature.Questo rettangolo fungerà da canale di flusso, quindi assicurarsi di realizzare lati dritti e di lasciare spazio intorno all'ingresso e all'uscita del tubo. Ora tagliare il nastro segnato lungo il contorno disegnato, effettuando tagli dritti e puliti per garantire che nessun adesivo sporga nel canale. Pulire accuratamente la lamella di quarzo utilizzando acetone per rimuovere l'adesivo residuo della cella a flusso utilizzata negli esperimenti precedenti.Trova l'allineamento migliore del contorno del canale. Rimuovi un lato del supporto adesivo e posiziona con attenzione il nastro sul vetrino. Presta attenzione ad allineare correttamente il nastro, poiché i fori di ingresso e di uscita devono rimanere liberi da ostruzioni.Successivamente, preparare i pezzi di tubo tagliati di lunghezza di 0,76 millimetri per l'ingresso e l'uscita della cella a flusso. È utile tagliare l'estremità del tubo con un angolo di circa 30 gradi in modo che il tubo non prema piatto contro il fondo della camera. Sospendere i tubi su portaprovetta per facilitarne il collegamento alla cella a flusso nei passaggi successivi.A questo punto l'incubazione del vetrino è terminata. Risciacquare accuratamente il vetrino ricoperto da strep avid ENC con acqua ed asciugare utilizzando aria compressa. Fare attenzione a non capovolgere il vetrino, poiché solo un lato è funzionalizzato.Infine, completare il montaggio della camera a flusso rimuovendo l'altro lato del supporto adesivo e posizionando la lamella di quarzo sul vetrino coprioggetto. Premere leggermente sul vetrino coprioggetto per espellere qualsiasi aria intrappolata nell'adesivo. Questo aiuterà a prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale di flusso.Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e fissarlo con resina epossidica, quindi lasciare asciugare per alcuni minuti. Quando il sigillo di resina epossidica è asciutto, iniziare il bloccaggio della superficie.Utilizzando un ago da 21 gauge. Aspirare un po' del buffer di bloccaggio Degas attraverso una delle provette. Lavare alcune volte per rimuovere le bolle d'aria e lasciare incubare la camera per almeno mezz'ora prima di passare all'esperimento di replicazione a singola molecola.Ora che la cella a flusso è stata bloccata, posizionarla sul palchetto del microscopio. Fissare la camera con le clip del palchetto e assicurarsi che il canale di flusso sia allineato lungo l'asse y. Collegare il tubo di uscita della cella a flusso alla pompa per siringhe utilizzando un tubo connettore di diametro maggiore.Posizionare l'ingresso nel buffer di blocco e tirare indietro la siringa per rimuovere qualsiasi aria presente nel tubo. Un leggero colpetto sul tubo di uscita aiuterà a eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nella cella di flusso. Aggiungere ora il DNA, diluire il template di DNA stock a 25 picomolari in un millilitro di buffer di blocco e farlo fluire nella camera a una velocità moderata, ad esempio 0,025 millilitri al minuto per 30 minuti, per consentire un'adeguata copertura della superficie da parte del DNA.Una volta che il DNA è nella camera, rimuovere il DNA in eccesso eseguendo un lavaggio con buffer bloccante per almeno 200 volumi della cella di flusso. Per eliminare tutto il DNA libero, accendere il laser e la telecamera. Il CCD refrigerato deve raggiungere la temperatura richiesta prima di poter essere utilizzato.Dopo aver rimosso l'eccesso di DNA e disgassato il buffer di replicazione, preparare la miscela di reazione per la replicazione con nucleotidi, DTT e citossina nel buffer di replicazione. Quindi aggiungere le proteine e mescolare delicatamente. Successivamente, far fluire la miscela di reazione nella cella di flusso.La velocità del flusso deve essere sufficiente per allungare il DNA a doppio filamento in un canale di flusso largo due millimetri e alto 100 micrometri; una portata di 0,04 millilitri al minuto funziona bene. Attendere il tempo necessario affinché la miscela entri nella camera, circa 10 minuti.Spostare il campo visivo sul lato del canale e mettere a fuoco sul materiale adesivo per assicurarsi di essere vicini alla superficie, necessario per la messa a fuoco e per iniziare l'acquisizione delle immagini. Regolare la potenza del laser, la messa a fuoco del microscopio e l'angolo del campione. Mantenere la potenza bassa per evitare qualsiasi scissione fotoindotta del DNA marcato.Acquisire da uno a cinque fotogrammi al secondo per diversi minuti, a seconda della velocità di replicazione del DNA. Ripetere per ottenere traiettorie di replicazione più lunghe o spostarsi in un nuovo campo per osservare più molecole quando quasi tutta la miscela di reazione è stata pompata nella cella; aggiungere ulteriore tampone con citocromo c per visualizzare altri campi. L'acquisizione di più immagini di diverse molecole replicate fornisce dati statistici per la determinazione della produttività.Nel saggio di replicazione a cerchio rotante, la sintesi del filamento principale estende la coda che collega il cerchio alla superficie; la coda viene quindi convertita in DNA a doppio filamento dalla polimerasi del filamento ritardato e stirata dal flusso laminare, come mostrato. Di seguito è riportato un esempio di campo visivo con citrosina arancione a eccitazione di 532 nanometri.I piccoli punti fluorescenti sono substrati non replicati ancorati. Si noti l'elevata lunghezza dei prodotti e il gran numero di prodotti per campo. Un campo tipico mostrerà numerose molecole in replicazione, visibili come linee luminose crescenti di DNA colorato. Negli esperimenti con E. Coli a 37 gradi Celsius si osservano da cinque a cinquanta molecole per campo, a seconda della densità superficiale.La zona di replicazione T7 si inizia in modo molto più efficiente e replicherà oltre il 50% delle molecole in un campo. Con una densità così elevata, è difficile risolvere singole molecole come mostrato qui. Pertanto, eseguire l'esperimento con T7 a concentrazioni proteiche più basse o a minore densità superficiale. I grafici Chime di molecole replicanti tipiche provenienti da esperimenti con E. coli e T7 includono le traiettorie finali di molecole da E. coli e T7 riportate in funzione del tempo. Le traiettorie sono adattate mediante regressione lineare per ottenere le velocità di replicazione, che in questo esempio sono di 467,1 paia di basi al secondo per E. coli e di 99,4 paia di basi al secondo per T7.Per T7, le distribuzioni delle velocità delle traiettorie di singole molecole, adattate con singole gaussiane, forniscono una media di 535,5 ± 39 paia di basi al secondo per E. coli e di 75,9 ± 4,8 paia di basi al secondo per G7. Per T7, le distribuzioni delle lunghezze dei prodotti di replicazione sono state adattate con un decadimento esponenziale singolo per ottenere la produttività, pari a 85,3 ± 6,1 chilopaia di basi per E. coli e 25,3 ± 1,7 chilopaia di basi per G7. Abbiamo appena mostrato come misurare la replicazione del DNA coordinata mediante singole molecole.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di funzionalizzare correttamente le lamelle e di realizzare canali di flusso puliti e lineari. Assicurarsi di mantenere bassa la potenza del laser e di minimizzare la scissione fotoindotta del DNA lungo. Questo è tutto.Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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