Visualizzazione della distribuzione delle proteine batteriche in tre dimensioni tramite imaging a fluorescenza

Inizia con un vetrino sigillato contenente cellule batteriche marcate con un marcatore fluorescente rosso citoplasmatico e un marcatore fluorescente verde specifico per proteina.

Osserva il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza.

Individua un campo contenente cellule batteriche ben isolate e concentrati sul centro di una cellula rappresentativa.

Imposta il primo canale di fluorescenza e acquisisci un'immagine z-stack a parametri specifici per catturare la forma tridimensionale della cellula rappresentativa e delle cellule vicine.

Poi, passa al secondo canale di fluorescenza e acquisisci un'altra immagine z-stack delle stesse celle con gli stessi parametri.

Cattura la distribuzione delle proteine batteriche all'interno delle cellule.

Ritaglia singole cellule da ogni z-stack per isolarle e l'analisi a singola cella.

Allinea queste immagini per visualizzare la distribuzione delle proteine batteriche rispetto alla forma cellulare, consentendo un'analisi precisa durante le interazioni ospite-patogeno.

Immediatamente dopo aver sigillato il coperchio, posizionare il vetrino su un palco del microscopio e, dopo cinque minuti di equilibrio termico, utilizzare le ruote di messa a fuoco del microscopio per mettere a fuoco il centro di una cella. Nel software di microscopio associato sotto ND Acquisition, seleziona la casella Z per acquisire uno stack Z e clicca sul pulsante Home per impostare il centro della cella come punto di partenza. Imposta la dimensione dello Step a 0,1 micrometri e la Range a quattro micrometri, e assicurati che il dispositivo Z sia impostato sullo stadio piezo.

È fondamentale che ci sia una sufficiente sfocatura sia sulla parte superiore che inferiore della cella, in modo che la cellula sia quasi indistinguibile dallo sfondo. Imposta i canali fluorescenti sotto la finestra lambda sulle impostazioni per le molecole fluorescenti da immagine, e conferma che l'ordine dell'esperimento sia impostato su lambda in modo che venga ottenuto uno stack Z completo in ciascun canale colore prima di cambiare. Poi, clicca su Esegui ora per iniziare l'acquisizione dell'immagine.

Quando tutte le immagini sono state acquisite, apri i file in un software di analisi delle immagini appropriato. Disegna una casella intorno a una singola cella e duplica quella cella due volte, una per ogni canale, assicurandoti che sia selezionata la casella Duplicate hyperstack, e cambia il canale in uno o due. Una volta che entrambi gli stack sono disponibili, seleziona Immagini, Stack, Tools e Concatenate per combinare le immagini.