Indurre un blocco di replica siti specifici in E. coli Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di bloccare una forcella di replicazione in un blocco nucleoproteico e osservare le strutture del DNA nel sito del blocco allo scopo di studiare le vie di riparazione del DNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla replicazione e la riparazione del DNA, come ad esempio il modo in cui il DNA viene elaborato quando l'apparato di replicazione della cellula incontra un blocco proteico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo bloccare in modo reversibile una forcella di replicazione in una posizione specifica sul cromosoma in un'intera popolazione di cellule viventi.

A dimostrare questa procedura saranno i seguenti membri del mio laboratorio, la dottoressa Karla Mettrick, e la studentessa laureata, Georgia Weaver e Tayla-Ann Corocher. Per questa procedura viene utilizzato un ceppo di E.coli che trasporta un array di operatori di tetraciclina nel plasmide pKM1. pKM1 codifica per TetR-YFP, una proteina repressore della tetraciclina marcata con proteina fluorescente gialla inducibile.

Diluire una coltura fresca durante la notte di questo ceppo di E.coli a una densità ottica a 600 nanometri di 0,01 in un terreno complesso diluito con antibiotici come richiesto per la selezione. Coltiva la coltura a 30 gradi Celsius con agitazione a una densità ottica a 600 nanometri da 0,05 a 0,1. Rimuovere un campione da 10 millilitri per fungere da controllo non indotto.

Aggiungere lo 0,01% di arabinosio alla coltura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a far crescere sia le colture non indotte che quelle indotte a 30 gradi Celsius con agitazione. Dopo un'ora, verificare la presenza di un singolo punto focale all'interno di ciascuna cellula della coltura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Se le cellule indotte sono confermate bloccate, indicate da oltre il 70% delle cellule aventi un unico fuoco, registrare la densità ottica e rimuovere 7,5 millilitri del campione per l'analisi mediante elettroforesi su gel bidimensionale. Rimuovere un campione equivalente dalla coltura di controllo non indotta. Prima della microscopia a fluorescenza, preparare i cuscinetti di agarosio per impedire il movimento delle cellule durante la visualizzazione.

Per ogni tampone di agarosio, pipettare 500 microlitri di agarosio fuso su un vetrino da microscopio e sovrapporre il vetrino coprioggetti immediatamente prima che l'agarosio si solidifichi. Conservare i vetrini tra i fazzoletti bagnati a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quando è il momento di controllare le cellule, rimuovere il vetrino coprioggetti dal tampone di agarosio e pipettare 10 microlitri di coltura batterica al centro del tampone.

Dopo circa cinque minuti, quando il tampone di agarosio si è asciugato, sostituire il vetrino coprioggetti. Posizionare una goccia di olio da immersione sul vetrino coprioggetti e posizionare il vetrino sotto l'ottica. Visualizzare le cellule utilizzando la microscopia di fase con ingrandimento 100x.

Nella finestra di dialogo Acquisisci all'interno del software di imaging, impostare Tempo di esposizione su 100 millisecondi. Selezionare Acquisisci per acquisire l'immagine. Non spostare il tavolino.

Nella finestra di dialogo Acquisito, selezionare YFP come illuminazione per l'otturatore esterno collegato alla fotocamera. Impostare il tempo di esposizione su 1.000 millisecondi. Spegnere la luce del palcoscenico e selezionare Acquisisci per acquisire l'immagine a fluorescenza.

Per iniziare questa procedura, aggiungere l'azide di sodio ai campioni di coltura precedentemente raccolti a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare su ghiaccio per almeno cinque minuti. Centrifugare le cellule a 5.000 volte g per dieci minuti. Scartare il surnatante.

Risospendere ogni pellet di cellula in 200 microlitri di tampone PIV e trasferire le cellule in una provetta per microfuge. Microcentrifuga per pellettare le celle e scartare il surnatante. Trattare un vetrino da microscopio con 40 microlitri di una soluzione di vetro, idrorepellente o siliconica appropriata.

Strofinare il vetrino con un fazzoletto fino a quando non è asciutto. Risospendere le celle con la densità cellulare più bassa in 50 microlitri di PIV e posizionarle a 50 gradi Celsius in un blocco termico. Per tutti gli altri campioni, regolare i volumi di PIV in modo che la densità cellulare finale sia la stessa in ciascuna provetta.

Aggiungere ai campioni un volume uguale di soluzione di agarosio allo 0,8% appena preparata in PIV. Conservare i campioni nel blocco termico per assicurarsi che siano superiori a 50 gradi Celsius per evitare la solidificazione. Porre 20 microlitri di sospensione di cellule-agarosio sul vetrino trattato per produrre tappi semisferici.

Quando i tappi si sono solidificati, far scorrere delicatamente tutti i tappi da un campione in una singola provetta per microfugi e aggiungere un millilitro di tampone di lisi cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, rimuovere il tampone di lisi cellulare e aggiungere 1 millilitro di soluzione EDTA-Sarkosil-Proteinasi K o ESP.

Incubare a 50 gradi Celsius durante la notte o fino a quando i tappi sono trasparenti. Una volta che i tappi sono trasparenti, rimuovere il tampone ESP e trasferire i tappi in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere 12 millilitri di tampone TE e lasciare riposare per 30 minuti.

Lavare i tappi per un totale di cinque volte con il tampone TE. Conservare i tappi a quattro gradi Celsius in un millilitro di tampone TE. Per analizzare gli intermedi di replicazione, il DNA nei tappi di agarosio viene digerito con un enzima di restrizione appropriato per la regione di interesse.

In questo esempio, EcoRV taglia il DNA immediatamente prima dell'array, all'interno dell'array e dopo l'array, per ottenere frammenti di 5,5 kb e 6,7 kb nella regione di interesse. Per iniziare questa procedura, trasferire un tappo di agarosio in una nuova provetta per microfuge e aggiungere 150 microlitri di tampone enzimatico di restrizione. Aggiungere da 25 a 100 unità di enzima di restrizione e digerire a 37 gradi Celsius per sei-otto ore.

Preparare un gel di agarosio allo 0,4% a quattro gradi centigradi. Versare 300 millilitri di agarosio fuso in una vaschetta di gel di circa 25 x 25 centimetri. Inserire un pettine per fare in modo che i pozzetti abbiano all'incirca la stessa larghezza del diametro del tappo.

Quando il gel è solidificato, rimuovere il pettine e spostare il gel a temperatura ambiente. Utilizzando un anello di inoculazione, far scorrere uno dei tappi di agarosio digerito in un pozzetto, posizionando il lato piatto del tappo contro il lato del pozzetto in cui il DNA entrerà nel gel. Inserire una singola spina allo stesso modo in ogni secondo pozzetto.

Pipettare l'agarosio fuso allo 0,4% nei pozzetti per sigillare i tappi in posizione. Caricare una scala di DNA da un kb in un pozzetto vuoto, lasciando uno spazio tra la scala e i campioni. Eseguire il gel per una notte in 1xTBE a temperatura ambiente.

Il giorno seguente, colorare il gel a bagnomaria contenente 0,3 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio per 20 minuti. Visualizza il DNA con un transilluminatore UV a onde lunghe e taglia ogni frammento di corsia con un taglio dritto e uniforme, riducendo al minimo l'inclusione di agarosio in eccesso su entrambi i lati della corsia. Posizionare la corsia di gel asportata in una vaschetta di gel a 90 gradi rispetto alla direzione di migrazione del DNA.

Il passo successivo consiste nel preparare 300 millilitri di agarosio per il gel di seconda dimensione. Quando l'agarosio si è raffreddato a 50 gradi Celsius, pipettare l'agarosio fuso attorno alle fette di gel per solidificare la loro posizione. Versare l'agarosio rimanente nella teglia ad una profondità almeno pari a quella delle fette di gel.

Una volta che il gel si è solidificato, elettroforarlo in 1xTBE contenente 0,3 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio a quattro gradi Celsius fino a quando il DNA non ha migrato di circa 10 centimetri. Asportare i blocchi in cui è presente il DNA genomico, compreso il gel sopra di esso, per includere il DNA che non è visibile. Il DNA all'interno del gel viene successivamente visualizzato mediante ibridazione meridionale come descritto nel protocollo di testo.

In questo sistema, un blocco di replicazione è stato confermato dalla maggioranza delle celle contenenti un fuoco corrispondente a una copia dell'array all'interno della cella. L'aggiunta di aniidrotetraciclina ha invertito il blocco e la successiva duplicazione dell'array è stata visualizzata come l'accumulo di cellule con focolai multipli. Le cellule con replicazione bloccata hanno anche mostrato un'inibizione della crescita che è stata invertita dalla successiva crescita in presenza di anidrotetraciclina.

Per analizzare gli intermedi di replicazione, il DNA è stato elettroforesato nella prima dimensione. Il DNA di interesse è stato quindi asportato e un'elettroforesi di seconda dimensione ha prodotto una diagonale di DNA lineare. L'ibridazione meridionale del DNA dell'array ha rivelato due punti nel campione non bloccato corrispondenti ai frammenti attesi di 5,5 kb e 6,7 kb dell'array.

Il campione bloccato ha mostrato una diminuzione dello spot di 5,5 kb e l'aggiunta di un segnale ellittico che indica un accumulo di DNA a forma di Y. L'aggiunta di aniidrotetraciclina ha eliminato il segnale del DNA a forma di Y. Un altro intermedio comune è la giunzione di Holliday visualizzata come un segnale conico alla sommità dell'arco Y e un picco dal DNA lineare alla fine dell'arco Y.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto giorni se è preformata correttamente. Sebbene si tratti di una procedura 2D, è importante ricordare che la qualità dei tappi di DNA è fondamentale per la visualizzazione ottimale delle strutture del DNA.