Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

L'obiettivo generale di questa strategia sperimentale è quello di studiare la funzionalità delle varianti non codificanti associate alla malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in genomica, come ad esempio come le varianti genetiche che in realtà non modificano la sequenza degli aminoacidi, contribuiscono comunque al fenotipo della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un processo semplificato per la valutazione della varianza genetica per l'attività funzionale e fornisce informazioni sulle proteine regolatorie e sui percorsi effettuati.

Questa tecnica può essere utile per l'indagine di qualsiasi malattia con una variante causale candidata. Perché la procedura per analizzare queste varianti è universale indipendentemente dal fenotipo studiato. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle malattie umane, può anche essere applicato alle mutazioni in qualsiasi organismo.

In questo esperimento verranno preparati lisati nucleari da cellule B-linfoblastoidi, tuttavia questa procedura può essere applicata alla maggior parte delle linee cellulari. Dopo aver contato le cellule utilizzando un emocitometro, ridurre il numero desiderato di cellule per la lisi. Aspirare il terreno, aggiungere 10 millilitri di PBS ghiacciato e far girare nuovamente le cellule.

Lavare le celle una seconda volta con PBS e rimuovere il PBS dopo la centrifuga. Risospendere il palato cellulare in PBS ghiacciato utilizzando un millilitro di PBS per 10-settima cellula. Aliquotare un millilitro della sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri, in modo che ogni provetta contenga da 10 a sette cellule in PBS.

Centrifugare per due minuti e aspirare il PBS. Aggiungere a una scorta di tampone CE, un ditiotreitolo millimolare, o DTT, 1X inibitore della fosfatasi e 0,5 millimolare di fenilmetanosulfonilfluoruro, o PMSF. Risospendere ogni tavolozza cellulare con 400 microlitri di questo tampone e incubare su ghiaccio per 15 minuti.

Aggiungere 25 microlitri di Nonidet P-40 al 10% a ciascuna provetta per microcentrifuga e miscelare mediante pipettaggio. Centrifugare a quattro gradi Celsius e alla massima velocità per tre minuti. Decantare e scartare il surnatante.

Successivamente, aggiungere a una scorta di lavoro di NE-buffer, un millimolare DTT, 1X inibitore della fosfoasi e un millimolare PMSF. Risospendere ogni palato cellulare con 30 microlitri di questo tampone e mescolare vorticando. Incubare a 4 gradi Celsius, in un rotatore di provette, per 10 minuti.

Centrifugare per due minuti. Raccogli il surnatante chiaro, che è il lisato nucleare. Aliquotare il lisato nucleare prima di conservarlo a meno 80 gradi Celsius per evitare cicli multipli di congelamento, disgelo che potrebbero degradare la proteina.

Iniziare questa procedura preparando un working stock a 50 nanomolari dell'oligonucleotide, come descritto nel testo del protocollo. Metti gli oligo in un blocco termico a 90 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, spegnere il blocco termico e lasciare raffreddare lentamente gli oligo a temperatura ambiente per almeno un'ora prima dell'uso.

Successivamente, preparare il test di spostamento della mobilità elettroforetica o il gel EMSA. Rimuovere il vetrino da un gel prefabbricato, al sei percento di tris-borato-EDTA o TBE, e sciacquare più volte sotto acqua deionizzata per rimuovere eventuali tamponi dai pozzetti. Assemblare l'apparecchio per elettroforesi su gel e verificare la presenza di perdite riempiendo la camera interna con tampone TBE 0,5X.

Se non ci sono perdite di tampone nella camera esterna, riempire la camera esterna, all'incirca, per due terzi. Pre-far funzionare il gel a 100 volt per 60 minuti. Al termine della pre-corsa, lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di tampone TBE 0,5X.

Preparare un master mix del buffer di legatura. In una provetta da microcentrifuga, mescolare questi reagenti comuni a tutte le reazioni. Tampone legante 10X, polisorbato DTT, Poly(dI-dC) e DNA spermatico di salmone.

Per impostare le reazioni EMSA, aggiungere acqua priva di nucleasi a ciascuna provetta per microcentrifuga, in modo tale che il volume finale, dopo l'aggiunta di tutti i reagenti, sia di 20 microlitri. Aggiungere la quantità appropriata di master mix a ciascuna provetta per microcentrifuga. Aggiungere otto microgrammi di lisato nucleare alle provette per microcentrifuga appropriate.

Includere i tubi contenenti l'oligo, senza estratto nucleare, come controlli negativi. Aggiungere 50 femtomoli di oligo alle provette per microcentrifuga appropriate e mescolare con un colpo. Centrifugare brevemente il contenuto sul fondo del tubo.

Incubare tutte le provette, per 20 minuti, a temperatura ambiente. Quindi, aggiungi due microlitri di colorante di caricamento arancione 10X a ciascuna provetta per microcentrifuga. Pipettare su e giù per mescolare.

Caricare i campioni nel gel TBE al sei percento pre-esecuzione pipettandolo su e giù per mescolare, quindi espellendo ciascun campione in un pozzetto separato. Far funzionare il gel a 80 volt per circa 60-75 minuti, fino a quando il colorante arancione non è migrato da due terzi a tre quarti del gel. Al termine della corsa, usa un coltello da gel per aprire la cassetta di plastica.

Rimuovi il gel dalla cassetta e mettilo in un contenitore con tampone TBE allo 0,5% per evitare che si secchi. Posizionare il gel sulla superficie di un sistema di imaging a infrarossi e chemiluminescenza. Elimina eventuali bolle o contaminanti che possono disturbare l'immagine.

Scansionare il gel utilizzando il software del sistema di scansione come descritto nel testo del protocollo. Per iniziare questa procedura, preparare un ceppo di lavoro oligo a cinque micromolari come descritto nel testo del protocollo. Metti gli oligo in un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, spegnere il blocco termico e lasciare raffreddare lentamente gli oligo a temperatura ambiente prima dell'uso. Riscaldare i seguenti tamponi a temperatura ambiente: tampone di legame, tampone di lavaggio a bassa stringenza, tampone di lavaggio ad alta stringenza e tampone di eluizione. Preparare le miscele leganti per ogni variante.

Mescolare un volume di lisato nucleare con due volumi di tampone legante. Aggiungere 1X inibitore della fosfatasi, PMSF 0,5 millimolare e potenziatore di legame 1X. Aggiungere 10 microlitri di DNA di cattura biotinilato a cinque micromolari a ciascuna miscela legante.

Mescolare muovendo più volte il tubo. Incubare le miscele leganti per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungi 100 microlitri di streptavidina MicroBeads a ciascuna miscela legante.

Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Per ogni sonda oligo da testare, posizionare una colonna di legame nel separatore magnetico. Assicurarsi che le colonne siano etichettate con l'oligo variante utilizzato nella miscela legante.

Posizionare una provetta da microcentrifuga direttamente sotto ogni colonna di legatura e applicare 100 microlitri di tampone legante per risciacquare la colonna. Pipettare il contenuto di ogni miscela legante in colonne separate. Lasciare che il liquido fluisca completamente attraverso la colonna nella provetta della microcentrifuga.

Applicare 100 microlitri di tampone di lavaggio a bassa rigore sulla colonna e attendere che il serbatoio della colonna sia vuoto. Applicare nuovamente 100 microlitri di tampone di lavaggio a bassa stringenza sulla colonna. Applicare 100 microlitri di tampone di lavaggio ad alta rigore sulla colonna e attendere che il serbatoio della colonna sia vuoto.

Applicare nuovamente 100 microlitri di tampone di lavaggio ad alta rigore sulla colonna. Aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione nativo alla colonna e lasciare riposare per cinque minuti. Infine, aggiungere altri 50 microlitri di tampone di eluizione nativo per eluire i fattori di trascrizione legati.

Al fine di esplorare la riproducibilità dei risultati dell'EMSA e le conseguenze dei cicli di congelamento e scongelamento, sono stati utilizzati oligo contenenti l'allele di riferimento o non di riferimento di una variante genetica per sondare la stessa preparazione di estratto nucleare di linfociti B dopo più cicli di congelamento e scongelamento. La freccia blu indica la sonda libera. Il legame dei fattori di trascrizione all'oligo è visto come una banda nella metà superiore del gel, indicata dalla freccia rossa.

Questi risultati indicano che il congelamento e lo scongelamento di questo particolare estratto nucleare fino a cinque volte non ha, apparentemente, alcun effetto sull'integrità delle proteine. È anche importante ottimizzare il rapporto segnale/rumore per l'EMSA. Varie concentrazioni di oligo sono state utilizzate per sondare una singola preparazione di lisato nucleare.

È stato osservato un aumento dell'intensità della banda, fino a 100 femtomoli di oligo. I risultati rappresentativi di uno studio su un allele di rischio associato al lupus sono mostrati qui. Il fattore di trascrizione, STAT 1, è stato identificato per la prima volta dal DAPA seguito dall'analisi proteomica.

Un western blot DAPA ha poi confermato l'identità di STAT 1 e il maggiore legame della forma fosforilata di STAT 1 all'oligo di rischio di lupus. Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche, come la spettrometria di massa e il western blot. Questo ci aiuterà a identificare la proteina regolatrice che mostra un legame allele dipendente.

I saggi reporter come la luciferasi possono anche essere utilizzati per studiare i cambiamenti nell'espressione genica in funzione dell'allele.