Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como expor e distinguir os terminais motores fásicos e tônicos com coloração morfológica e registro eletrofisiológico no músculo extensor do lagostim. Isso é feito primeiro arrancando a primeira ou a segunda perna de um lagostim de tamanho médio, cortando a cutícula e removendo o músculo flexor no segmento meite. Isso expõe o músculo extensor e o feixe de nervos.

A segunda etapa do procedimento é corar a preparação com quatro iodeto de etil amino estéril e metil peritônio, ou quatro D dois asp para visualizar os axônios e terminais nervosos. A terceira etapa do procedimento é estimular seletivamente os neurônios tônicos e/ou fásicos e, simultaneamente, fazer registros intracelulares de EPSPs evocados na fibra muscular. A etapa final do procedimento é usar um eletrodo focal para registrar eventos qu espontâneos e evocados dos terminais.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que separam os terminais tônicos e fásicos, morfologicamente e fisiologicamente por meio de microscopia de imunofluorescência e eletrofisiologia. Este método pode ajudar a responder às questões-chave no campo da fisiologia sináptica em áreas como fadiga muscular, depressão sináptica e diafonia sináptica. O experimento começa pegando o lagostim com cuidado para evitar suas garras.

Separe a perna do corpo no segmento da cápsula isia. Um beliscão forte no segmento da vagem isia induz o lagostim a automatizar ou quebrar naturalmente a primeira perna de caminhada. O lagostim para de sangrar e é colocado de volta em seu tanque de retenção.

O lagostim não é sacrificado. Coloque a perna em um pedaço de papel de seda para que a preparação possa ser virada facilmente durante os cortes. Vire a perna até que a parte externa, que é o lado lateral, esteja voltada para cima na placa de dissecação.

Isso geralmente tem o lado arqueado voltado para cima. Usando uma lâmina de barbear afiada presa a um disjuntor de lâmina de bisturi, grave a cutícula dentro do segmento meite seguindo o padrão mostrado na figura. Tenha cuidado para não cortar muito distalmente no corte dorsal a ventral ao longo da junta do carpod meite.

Este corte resulta em uma janela no meite acima dos músculos subjacentes da perna. Deixe a cutícula no lugar por enquanto. Coloque a preparação em uma placa de dissecação contendo soro fisiológico de lagostins.

Neste ponto, coloque um alfinete no meio do segmento da vagem e na face dorsal do segmento da vagem do ísquio com uma pinça fina, levante a janela cortada na cutícula ligeiramente da extremidade distal e, usando a navalha, corte as fibras musculares flexoras da cutícula. Continue cortando de maneira distal a proximal e, finalmente, levante a janela da cutícula. Para expor o músculo extensor, o músculo flexor sobrejacente deve ser removido.

Separe o tendão do músculo flexor deslocando-o do músculo flexor com um pino. Em seguida, corte o tendão na junta do carpod Mari poddy. Como mostrado, tenha muito cuidado para afastar o tendão da cavidade da perna antes de fazer o corte e cortar apenas o tendão e não o nervo principal da perna que está no lado interno do tendão.

Aperte o tendão onde foi cortado com uma pinça e puxe o músculo flexor da perna, levantando-o na direção do mimo Para expor o nervo ao músculo extensor, corte o nervo principal da perna na articulação do carpod do merepod e puxe cuidadosamente o nervo principal da perna de volta sobre o músculo extensor. A separação do nervo para o músculo extensor do nervo principal da perna pode ser aprimorada puxando suavemente o coto distal do nervo principal da perna para o lado da preparação. Ao descascar o nervo principal da perna de volta sobre o músculo extensor, pequenos ramos do axônio inibitório podem precisar ser cortados.

O feixe nervoso pode ser visualizado com coloração com azul de metileno. No entanto, o azul de metileno não seria usado para registros eletrofisiológicos nesta imagem superior. Setas vermelhas para marcar o rastro nervoso de interesse.

O feixe nervoso de interesse é o feixe maior que se ramifica do nervo principal da perna perto da extremidade proximal de onde está o merepo. Observe a ramificação do axônio e os dois axônios prontamente visíveis dentro do nervo. Agora que o nervo e o músculo estão expostos, prepare o aparelho usado para o experimento.

As gravações intra e extracelulares são feitas com um estágio de cabeça padrão e amplificador. Usamos um modelo de grampo de axônio, dois amplificadores B e uma cabeça XLU. São necessários eletrodos de estágio três, um intracelular e dois extracelulares.

Os dois eletrodos extracelulares serão usados para estimular o nervo e registrar eventos sinápticos evocados e espontâneos. Polir os eletrodos focais e dobrá-los levemente sobre um elemento de aquecimento. Depois de encher um eletrodo focal com solução salina, coloque-o no suporte do eletrodo estimulante e insira o fio estimulador de forma que ele entre em contato com a solução salina.

Este é conectado a uma unidade de isolamento de estimulação de grama P 15, que é conectada a um estimulador de grama S 88. Durante os registros eletrofisiológicos, o corante vital para D dois ASP é usado para visualizar os axônios para corar os axônios, trocar a solução salina do banho por solução salina contendo cinco micromolares de quatro D dois como corante por cinco minutos. Após cinco minutos, reabasteça o prato com a solução salina fisiológica do lagostim, colocando a preparação sob um microscópio e usando uma objetiva Forex.

E a 10 x ocular, mova o eletrodo estimulante para a área de interesse. O próximo passo é colocar o lúmen do eletrodo estimulador do adesivo macro no axônio fásico ou tônico. Esta fotografia de uma preparação corada com quatro corantes mostra que o axônio tônico é mais brilhante

Os terminais tônicos mostram numerosas varicosidades e os terminais fásicos são de natureza mais fina à microscopia de fluorescência. E a objetiva de 20 x coloca o eletrodo no axônio tônico ou fásico. Aqui o eletrodo está sendo colocado no axônio tônico.

Coloque o eletrodo intracelular em seu micromanipulador, coloque o eletrodo intracelular em uma célula muscular extensora. Isso será usado para registrar potenciais pós-sinápticos excitatórios intracelulares ou EPSPs. Para gravar EPSPs qual.

Coloque o segundo eletrodo focal em um micro manipulador. Isso é feito removendo o eletrodo intracelular e o suporte anteriores e substituindo-o pelo suporte do eletrodo limpo. Use o manipulador micrométrico para colocar o lúmen do segundo eletrodo focal diretamente sobre uma varicosidade sináptica.

A resistência do eletrodo e da vedação é determinada passando pulsos de corrente de teste através do eletrodo. Em nossos experimentos, as resistências de vedação variaram de 0,3 a um mega ohm e a resistência do eletrodo variou de 0,5 a um. A resistência da vedação de mega ohm pode ser monitorada durante toda a gravação.

Quando estiver pronto para iniciar a estimulação, ligue o software scope 5.0 e comece a estimular o axônio isolado. No feixe nervoso, o axônio tônico é estimulado pelo eletrodo de sucção e os EPSPs da fibra muscular são registrados com um eletrodo intracelular ou extracelular. Os EPSPs são gravados em um computador por meio de uma interface de floresta de laboratório de energia.

Após a estimulação do axônio tônico, o eletrodo estimulante pode ser movido para o axônio fásico e o experimento repetido após a estimulação nervosa. O eletrodo intracelular registra EPSPs gerados em resposta à atividade do neurônio motor tônico e fásico. A facilitação sináptica das junções neuromusculares tônicas depende da frequência de estimulação nervosa, conforme mostrado aqui, para trens sucessivos de aproximadamente 20 estímulos cada um a uma frequência de 60 hertz.

Observe a facilitação que ocorre com múltiplos estímulos. Esta figura compara as amplitudes dos EPSPs gerados pela estimulação do nervo tônico nas frequências de 20 hertz em azul, 40 hertz em verde e 60 hertz em vermelho, observe a facilitação do mercado mostrada em frequências mais altas de estimulação. Os terminais tônicos são de baixa eficácia sináptica, mas mostram respostas facilitadas dramáticas.

Aqui estão apenas os EPSPs tônicos e, em seguida, as respostas fásicas são sobrepostas na mesma escala. Em contraste com os terminais tônicos, os terminais fásicos são de alta eficácia, mas apresentam depressão sináptica com estimulação de alta frequência. A depressão sináptica nos terminais fásicos também está relacionada à frequência da estimulação, conforme mostrado aqui.

Uma estimulação contínua de cinco hertz durante 30 minutos deprime a resposta na junção neuromuscular. Com maior frequência de estimulação, a preparação diminuirá mais rapidamente com a estimulação apropriada. A junção neuromuscular do lagostim gera EPSPs não pontiagudos.

Esses EPSPs podem ser usados para investigar as propriedades de qualidade que compõem os sinais elétricos graduados nesses músculos. Aqui, as respostas sinápticas do terminal tônico são mostradas. Observe que nem todos os testes de estimulação resultam em um evento qual.

A contagem direta de eventos de qualidade é possível com estimulação de baixa frequência para cada resposta evocada. O número de eventos de qualidade pode ser facilmente determinado para os terminais tônicos. Ao contar eventos quantais, as respostas sinápticas do neurônio motor fásico podem ser registradas da mesma maneira.

No entanto, as respostas evocadas são de natureza multiqualial. O conteúdo médio de qualidade é estimado usando a amplitude ou área média das deflexões, juntamente com a amplitude média do pico ou área de eventos espontâneos. Um lembrete final, tenha cuidado ao remover o músculo flexor para não danificar o nervo na espera do músculo extensor.

É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.