Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Produzir registros eletrofisiológicos estáveis das junções neuromusculares da larva de Joof. Primeiro disseque uma larva para expor a parede do corpo, os músculos e o sistema nervoso antes de gravar. Os axônios na base do SNC são cortados posteriormente ao gânglio ventral.

Em seguida, um eletrodo de registro é colocado no músculo de interesse e um eletrodo estimulante é colocado próximo aos neurônios motores inervantes. Os axônios cortados dos neurônios motores são sugados para a pipeta estimulante. Os potenciais de junção excitatória podem então ser registrados.

Olá, sou Wendy MLA do Laboratório McCabe no Departamento de Fisiologia e Biofísica Celular da Universidade de Columbia. Hoje mostraremos um procedimento para medir a transmissão de tiques na junção neuromuscular da lava GE. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a fisiologia sináptica e a transmissão neurológica.

Então vamos começar. Para iniciar o experimento, disseque as larvas errantes da terceira e da estrela para expor a parede do corpo. Este protocolo é modificado para experimentos eletrofisiológicos usando pinos de dissecação curtos.

Eles têm cerca de dois a quatro milímetros de comprimento e são menos propensos a atingir a objetiva do microscópio em eletrodos durante o experimento. Depois de expor a parede do corpo, use uma pinça para segurar o SNC e levante-o ligeiramente. Em seguida, corte os axônios motores dos nervos periféricos e remova o cérebro.

Após a remoção do cérebro, lave a preparação dissecada duas vezes com tampão HL 3.1 com um cálcio milimolar. Agora que a dissecção está completa, registros intracelulares podem ser feitos a partir das células musculares larvais. Coloque a placa de dissecção no microscópio de eletrofisiologia e mergulhe a preparação com tampão HL 3.1 mais cálcio.

Em seguida, fixe o eletrodo do banho de forma que fique em contato com a solução. O eletrodo de sucção é usado para estimular os nervos periféricos que inervam o músculo. Posicione primeiro o eletrodo de sucção no prato para evitar vibrações quando o eletrodo intracelular for colocado no músculo.

Quando o eletrodo estiver no prato, posicione-o próximo ao neurônio motor que inerva o músculo seis. No terceiro segmento abdominal, aplique uma sucção suave até que o nervo cortado esteja dentro da pipeta de vidro. Tenha cuidado para não esticar os nervos quando a sucção for aplicada.

Levante ligeiramente a pipeta para que não toque no músculo. Em seguida, posicione-o de forma que não puxe as fibras nervosas cortadas. Assim que o eletrodo de sucção estiver no lugar, posicione o eletrodo de gravação para as gravações intracelulares.

Use um microeletrodo afiado preenchido com cloreto de potássio de três molares. Posicione o eletrodo de gravação acima do centro do músculo seis. Ajuste o deslocamento de entrada para que seja zero para a solução de banho.

Abaixe lentamente o eletrodo e aproxime-se do músculo sob alta ampliação óptica até que ele toque a superfície muscular. Para confirmar que o músculo foi penetrado, observe o osciloscópio. O potencial de membrana em repouso deve ser de pelo menos 60 milivolts negativos.

O potencial esporádico de nplate em miniatura agora deve ser visível. Assim que o eletrodo de gravação estiver no lugar, deixe as células se estabilizarem por um minuto. Antes de iniciar as gravações, use um axônio HS dois, um estágio de cabeça em um amplificador de braçadeira de eixo dois B para detectar mudanças no potencial de membrana.

A braçadeira do eixo dois B é a interface com um computador que executa o software da braçadeira P através dos dados do dígito. 1322 A, que digitaliza o sinal. Registre o potencial de membrana em um PC. Com o software clamp X, aplique estímulos ao axônio motor para gerar potenciais de membrana excitatória ou ejs.

Depois que os ejs forem gerados, registre os ejs em miniatura durante um período de três minutos sem sinapse de estímulos. O software de mini análise suave pode ser usado para analisar os traços e determinar a amplitude e a frequência do mini EJP. Para gerar ejs.

Use um gerador mestre de oito pulsos para estimular até a extremidade cortada de um programa de neurônios motores. O gerador para fornecer um programa de pulsos de tensão quadrada de 0,3 milissegundos. Um intervalo de cinco segundos entre os estímulos para permitir a recuperação sináptica.

Na JNM, registre pelo menos 10 potenciais evocados de cada músculo e calcule a média das amplitudes. Esta figura mostra um traço típico registrado do músculo seis de uma larva de sal do tipo selvagem com respostas EJP evocadas e mini EJ.PS Acabamos de mostrar como registrar potenciais cy da junção neuromuscular da lava drosófila. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de completar a dissecção dentro de três a 10 minutos e iniciar os registros eletrofisiológicos imediatamente enquanto as células ainda estão saudáveis e responsivas.

Se a dissecção demorar muito, o potencial de membrana em repouso das células musculares será inferior a 60 milivolts negativos, o que é muito baixo para ser registrado. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.