Potenciais de membrana, Responses Synaptic, circuitos neuronais, neuromodulação e Histologia Muscle Usando a lagosta: Exercícios Laboratório Student

Os objetivos gerais dos experimentos a seguir são entender as propriedades das membranas excitáveis e a base iônica do potencial de membrana em repouso e aprender métodos para medir o potencial de membrana, bem como demonstrar as propriedades da transmissão sináptica. Em uma parte do experimento, o potencial de membrana em repouso será medido enquanto altera o potássio extracelular. Em outra parte do experimento, os mecanismos de diferenciação sináptica serão investigados por meio do registro, respostas sinápticas estimuladas em várias unidades motoras.

Em seguida, é apresentado um circuito neural de fácil manutenção. Esta preparação pode ser usada para o ensino, bem como para a pesquisa de vários aspectos de um circuito sensorial para o SNC, para o neurônio motor e para o músculo. Este conjunto de experimentos mostra a facilidade de usar o modelo de lagostim para abordar questões relacionadas à integração e transmissão sináptica do potencial de membrana e diferenças estruturais dos tipos de fibras musculares.

As principais vantagens do uso da preparação de lagostins no ensino de conceitos e técnicas eletrofisiológicas são a facilidade de dissecação, a viabilidade da preparação de solução salina mínima, a facilidade de obter respostas sinápticas e a facilidade de discernir o arranjo anatômico geral dos músculos. Essas técnicas também podem ser aplicadas a outras preparações e irão aprofundar nossa compreensão da fisiologia e modulação sináptica e das diferenças bioquímicas e estruturais na preparação demonstrada. Para iniciar a cirurgia, selecione um lagostim de aproximadamente seis a 10 centímetros de comprimento do corpo e coloque-o em gelo picado por cinco minutos para anestesiá-lo para decapitar o lagostim, segure-o pela parte de trás da cabeça, certificando-se de manter os dedos fora do alcance das garras e da boca do lagostim usando uma tesoura grande.

Remova rapidamente a cabeça fazendo um corte limpo por trás dos olhos do lagostim, remova as pernas e garras do lagostim para evitar ferimentos. Remova os estilos nos machos e os nadadores nos machos e fêmeas. Descarte a cabeça e os apêndices.

Em seguida, separe o abdômen do tórax fazendo um corte ao longo da membrana articular, que une o abdômen e o tórax. Salve a porção abdominal do lagostim e descarte o tórax, apontando a tesoura ligeiramente para baixo em direção ao lado ventral e, em ângulo, faça um corte na concha ao longo da borda lateral inferior de cada lado do abdômen. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente o lagostim.

Siga o padrão natural de concha das linhas do lagostim que percorrem o comprimento de cada segmento usando uma pinça. Remova a parte ventral da concha puxando-a para cima e para trás. Tomando cuidado para não destruir os músculos abdominais.

Remova os músculos flexores. Neste ponto, uma massa branca de tecido pode ser vista no topo dos músculos flexores profundos. Remova este tecido cuidadosamente com uma pinça.

O trato gastrointestinal agora é visível como um pequeno tubo que corre ao longo da linha média dos músculos flexores profundos. Remova-o apertando-o com uma pinça na parte superior e puxando-o para longe do abdômen. Corte a parte inferior do trato gastrointestinal no final da cauda.

Enxágue a dissecção com solução salina para garantir que os resíduos fecais não interfiram na preparação. Usando pinos de dissecação, prenda os cantos superior e inferior da preparação em uma placa de Petri revestida com proteção S. Os músculos extensores abdominais estão agora expostos.

Despeje a solução salina na placa de Petri para cobrir a preparação até que os registros intracelulares sejam realizados. Mova a placa de Petri para o microscópio e use cera embaixo da placa para evitar que ela se mova. O aparelho usado para registros intracelulares é mostrado nesta figura.

As conexões e configurações apropriadas são fornecidas no texto que acompanha. Configure o software de gráfico de laboratório de acordo com as instruções. No texto que acompanha, coloque o fio terra no banho de solução salina.

Coloque a ponta de uma micropipeta de vidro cheia de cloreto de potássio de três molares no banho de solução salina e teste a resistência do eletrodo. A resistência do eletrodo deve ser de 20 a 60 mega ohms. Use o botão grosso no amplificador para mover a linha no gráfico de laboratório para zero sob iluminação de alta intensidade.

Olhe através do microscópio e identifique os músculos DEM longitudinais. Use a sonda do eletrodo para inserir o eletrodo intracelular em uma fibra muscular do músculo DEM. O eletrodo mal deve ser inserido na fibra muscular.

Tenha cuidado para não penetrar em toda a célula. Meça a amplitude do potencial de repouso. Arraste o cursor M para o traçado a partir do local no canto inferior esquerdo da janela do gráfico.

Coloque o marcador M na linha de base e mova o cursor para o ponto mais baixo do sinal registrado. A diferença entre o marcador e o cursor ativo é exibida no canto superior direito da tela. Este valor é a tensão do potencial de membrana em repouso.

Divida a tensão registrada pela quantidade de amplificação, neste caso foi utilizada amplificação 10 x. Em seguida, converta a tensão de volts para milivolts. Depois de registrar o potencial de repouso dessa fibra muscular, olhe ao microscópio e remova cuidadosamente o eletrodo da fibra muscular.

Repita o registro intracelular em outras fibras musculares. A próxima parte deste experimento monitorará o efeito do aumento da concentração de potássio extracelular na membrana em repouso. Potenciais seis soluções salinas de lagostim serão usadas com concentrações de potássio de 5,4 20, 40, 60, 80 e 100 milimolares.

Escolha um músculo que não esteja se contorcendo para fazer a próxima gravação intracelular entre as gravações. Substitua a solução do banho pela próxima concentração mais alta de solução de cloreto de potássio. Certifique-se de cobrir a preparação completamente a cada vez.

Registre as mudanças no potencial de membrana para cada solução. O efeito de aumentar a concentração de potássio extracelular, o potencial de membrana é mostrado neste gráfico de captura de tela os potenciais de membrana em repouso para cada concentração de potássio em um gráfico semilogarítmico de concentração de potássio extracelular versus potencial de membrana. Alinhe o potencial de repouso em 5,4 milimolares de potássio extracelular.

Para as curvas hipotéticas e observadas, compare a inclinação da linha observada com a inclinação da linha hipotética. Depois de terminar esses registros eletrofisiológicos, o próximo passo é examinar a anatomia das fibras musculares e seu padrão de inervação. Transfira a preparação para o prato de pé e adicione azul de metileno.

Após cinco minutos, remova o azul de metileno e adicione solução salina fresca para lagostins. Procure o nervo principal que inerva os músculos dentro de um segmento. Esboce o padrão de inervação para os músculos S-E-M-D-E-L 2D EL um e DEM em um segmento.

Em seguida, mova a preparação para baixo de uma hotte. Remova a solução salina e adicione o fixador. O fixador usado aqui é uma solução de poin.

O objetivo da hotte é evitar os vapores do fixador. Tenha muito cuidado para não colocar esta solução em sua pele ou em seus olhos. Se seus olhos começarem a arder, lave-os imediatamente na estação de lavagem dos olhos.

Deixe a solução boin permanecer na preparação por cerca de 10 minutos e, em seguida, use uma pipeta para trocar a solução por solução salina. Corte um segmento fino de músculo DEL um ou DEL dois. Coloque-o em uma lâmina de vidro.

Rotule o slide. Repita o procedimento para o músculo MEV. Use o microscópio composto para visualizar o padrão de bandas do sarcômero em ambas as preparações de tecido.

A próxima série de experimentos examinará como registrar as respostas sinápticas nos músculos abdominais dos lagostins. Selecione outro lagostim, decapite-o. Remova o tórax e os apêndices e exponha os músculos extensores abdominais conforme mostrado na cirurgia.

Na primeira seção deste vídeo, usando o microscópio, encontre o nervo que transporta os axônios motores para os músculos extensores. Procure o segmento com o nervo mais acessível. O nervo é branco e pode ser visto usando uma pipeta para borrifar solução salina na preparação ou soprando levemente na preparação.

Isso faz com que o nervo se mova e, portanto, facilita a identificação. Coloque o eletrodo de sucção segurado pelo manipulador microm diretamente sobre o nervo. Puxe suavemente a seringa para puxar o nervo para dentro do eletrodo.

Você pode ver o nervo sendo sugado para dentro do eletrodo através do microscópio. Ajuste as configurações no software de gráfico de laboratório conforme especificado no artigo anexo. Encha um microeletrodo de vidro de cloreto de potássio de três molares e conecte-o ao estágio principal e ao laboratório de energia.

Use o botão de curso no amplificador para mover a linha no gráfico de laboratório para zero. Antes de inserir o eletrodo, o botão de alternância deve ser ligado e desligado várias vezes. Para testar a resistência do eletrodo, meça a amplitude dos valores resultantes.

Olhe através do microscópio e use a sonda do eletrodo para inserir o eletrodo em uma das fibras musculares longitudinais, DEM ou DL um ou DL dois. Tenha cuidado para não penetrar na fibra muscular. A preparação está agora pronta para o experimento.

O eletrodo de sucção é usado para estimular o feixe nervoso segmentar e o microeletrodo de vidro é usado para registrar a resposta sináptica da fibra muscular, acionar o estimulador do enxerto para estimular o nervo em um hertz para respostas fásicas. Em seguida, coloque o eletrodo em uma fibra muscular SEL. O SEL é um músculo tônico.

Estimule o nervo com rajadas curtas de pulsos a 10 hertz para respostas tônicas. Compare as respostas registradas dos músculos DEL e SEL. Observe que os músculos DEL fásicos têm respostas sinápticas de maior amplitude do que os músculos tônicos SEL.

Este próximo conjunto de experimentos se concentra nos músculos flexores do lagostim, em vez dos músculos extensores. Começando com um novo lagostim, isole o abdômen como mostrado nesta cirurgia. Na primeira seção deste vídeo, coloque a preparação isolada da cauda em uma placa de Petri cheia de solução salina, prenda a cauda e a parte superior da preparação.

Observe que dec Caro experimenta nos músculos flexores tônicos, o cordão nervoso ventral deve ser deixado intacto. Use um bisturi para iniciar um corte longitudinal através da membrana articulada entre duas costelas no lado ventral da preparação. Tenha muito cuidado para não cortar muito profundamente ao fazer este corte, pois um corte profundo pode atravessar a raiz nervosa motora para garantir que os músculos superficiais não sejam danificados.

Execute a próxima etapa. Olhando através de um microscópio usando uma tesoura ou um bisturi cortado horizontalmente a partir do corte longitudinal na fina camada de membrana que cobre o músculo. Amplie o corte para fazer uma aba de membrana articulada e levante a aba para cima.

Use uma tesoura para cortar o retalho expondo os músculos flexores superficiais para registro intracelular dos músculos flexores superficiais. Use a mesma instrumentação e configuração que foi usada para registrar o potencial de membrana em repouso e as respostas sinápticas dos extensores abdominais. Como antes, use um eletrodo intracelular preenchido com cloreto de potássio de três molares.

Insira o eletrodo em uma fibra muscular dos músculos flexores superficiais, tomando cuidado para não penetrar no músculo. Registre a atividade espontânea dos EPSPs. Observe os diferentes tamanhos dos EPSPs e se algum IPSP está presente.

Pegue um pincel pequeno e escove cuidadosamente ao longo da borda da cutícula dentro do mesmo segmento que contém o eletrodo de gravação. Observe qualquer alteração na frequência ou tamanho dos EPSPs devido à estimulação se uma resposta maior for observada. Isso indicaria o recrutamento de neurônios motores adicionais que respondem à mudança no disparo do nervo sensorial.

Troque cuidadosamente a solução salina por uma contendo um neuromodulador, como um micromolar serotonina ou solução salina borbulhada com dióxido de carbono. Em seguida, repita a estimulação do pincel. Observe o efeito que a troca da solução do banho tem na atividade registrada.

Troque a solução salina do banho de volta para solução salina normal e observe que a atividade da fibra muscular retorna à linha de base. Esta figura mostra os EPSPs registrados em uma fibra muscular flexora superficial. Observe os diferentes tamanhos dos EPSPs.

A próxima etapa deste experimento usa um eletrodo extracelular para monitorar os potenciais de ação dos neurônios motores que respondem à atividade no circuito sensorial do SNC e do neurônio motor. Comece fazendo um eletrodo de sucção para estimular os nervos sensoriais. Puxe um pedaço de tubo de plástico sobre uma chama.

O próximo passo é aparar a tubulação de volta ao tamanho desejado. Para fazer isso, você terá que olhar para o nervo em sua preparação para julgar o diâmetro de abertura desejado para o eletrodo de sucção. Dependendo do tamanho do lagostim, os feixes nervosos podem variar em tamanho de cerca de um milímetro a alguns milímetros de diâmetro.

Corte a seção esticada do tubo para fazer a abertura na ponta do tamanho correto para segurar o nervo. Se a abertura for muito grande, o nervo pode cair. Se a abertura for muito pequena, o nervo pode ser danificado pela pressão do eletrodo.

Coloque o tubo de plástico na ponta de um eletrodo de vidro. A eletrofisiologia e a configuração do software são ligeiramente diferentes do monitoramento das respostas extracelulares em comparação com as gravações intracelulares configuradas. O equipamento, conforme especificado no artigo anexo, aspira a terceira via que inerva o músculo flexor superficial no eletrodo de sucção.

Agora você pode começar a registrar potenciais de ação. Esta rota tem cinco neurônios motores excitadores e um neurônio motor inibidor. Após registrar a atividade basal, estimule a cutícula com uma escova para observar a mudança nos potenciais de ação gerados.

Em seguida, substitua a solução do banho por neuromoduladores, como a serotonina, como no experimento anterior, e registre qualquer alteração na resposta. Exercícios adicionais são dados no texto que acompanha. Este registro mostra os potenciais de ação registrados da terceira rota antes e durante a estimulação da cutícula com uma escova, compare a frequência dos potenciais de ação antes da escovação com sua frequência durante a estimulação.

Este registro mostra os potenciais de ação registrados da terceira via em solução salina normal e em solução de serotonina. Compare a frequência dos potenciais de ação em solução salina normal com sua frequência e serotonina Como acabamos de mostrar. A escovação aumenta a frequência de disparo em relação à linha de base.

A atividade também demonstrada é que a serotonina aumenta a frequência de disparo em relação à solução salina normal. Esta figura mostra que, quando a escovação e a serotonina são combinadas, há um aumento ainda maior na frequência de disparo. A comparação dos efeitos derivados externa e teoricamente da concentração externa de potássio no potencial de membrana em repouso indica a influência dos íons no potencial de membrana.

Também mostramos como registrar respostas ntic nas junções neuromusculares dos músculos fásicos e tônicos. Essas técnicas podem ser usadas para laboratórios investigativos de estudantes para ensinar conceitos fundamentais e fisiologia. As técnicas obtidas neste exercício de laboratório podem ser utilizadas para responder a questões relacionadas com outras preparações laboratoriais, bem como aplicações fisiológicas relacionadas com a medicina e a saúde.