Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

O objetivo geral deste procedimento é estudar a funcionalidade da junção neuromuscular por meio de uma abordagem experimental ex vivo. Isso é feito estimulando a preparação do nervo muscular de duas maneiras, diretamente na membrana muscular e através do nervo. Como a estimulação da membrana ignora a sinalização da transmissão neurológica, quaisquer diferenças entre as duas respostas contráteis podem ser consideradas como uma medida indireta da funcionalidade da junção neuromuscular.

Aqui apresentamos este procedimento na preparação do nervo sóleo ciático. O músculo é dissecado junto com seu nervo e colocado em um banho de tecido perfundido. Ele é fixado a um controlador de força e comprimento e um par de eletrodos de platina é colocado paralelamente ao músculo.

Um eletrodo de sucção de vidro é então movido para perto da extremidade cortada do nervo. Um protocolo de teste abrangente é então aplicado para avaliar minuciosamente a junção neuromuscular e a funcionalidade muscular. A conexão funcional entre músculo e nervo é conclusão para ambas as partes e duas facções sobreviventes.

Na primeira região do nível de cada um dos dois tecidos comunicam que essas junções neuromusculares, que normalmente exibem uma pressão como morfologia. No entanto, em várias condições patológicas, a funcionalidade interligada entre músculo e nervo é severamente comprometida e a junção neuromuscular perde a complexa organização morfológica. O objetivo geral do nosso procedimento é estudar a funcionalidade da junção neuromuscular usando uma abordagem experimental ex vivo.

Isso é feito estimulando a preparação do nervo muscular de duas maneiras. Um estimulando diretamente a membrana muscular e o outro estimulando o nervo e analisando as propriedades musculares. Ligue o banho-maria de circulação e ajuste a temperatura para 30 graus Celsius.

Encha o banho com a solução Krebs-Ringer. Deixe o ponto O quatro bar de mistura de gás fluir através do oxitubo e para o banho. Ligue o transdutor do atuador e os dois estimuladores de pulso.

Defina os valores atuais para 300 milhões de pares para a estimulação da membrana e para cinco milhões de pares para a estimulação do nervo. Depois de sacrificar o rato por luxação cervical, remova a pele das pernas. Agora corte o tendão de Aquiles e, enquanto aperta firmemente o tendão, puxe o músculo gastrocnêmio e o sóleo juntos para cima.

Uma vez exposto o tendão proximal do sóleo, corte toda a panturrilha acima dele e coloque rapidamente a amostra no banho preparatório de tecido localizado sob o microscópio estereoscópico. Usando uma pinça, prenda firmemente o tendão proximal do sóleo e puxe-o suavemente para expor a inervação ciática. Uma vez que a inervação é exposta, remova os tecidos circundantes para revelar cerca de cinco milímetros do nervo.

Em seguida, use uma tesoura fina para cortar cuidadosamente o nervo. Complete a excisão do músculo e do nervo cortando o tendão de Aquiles para separar o sóleo do gastrocnêmio. Agora o músculo, a preparação do nervo está pronta para ser montada no aparelho de teste.

Crie um nó deslizante na extremidade do fio de náilon e aperte-o ao redor do tendão de Aquiles. Prenda o tendão proximal dentro do grampo fixo e amarre o fio de náilon ao redor do braço de alavanca do transdutor de força. Permita que o músculo se equilibre na solução.

Para determinar o comprimento ideal inicial, estimule o músculo com uma série de pulsos únicos enquanto altera suavemente o valor da carga de fluência. O comprimento ideal é obtido quando a força de contração é máxima. Coloque os eletrodos de sucção perto do músculo e puxe o nervo para dentro.

Em seguida, enquanto altera suavemente o valor da corrente de pulso, estimule o músculo com uma série de pulsos únicos. A força de contração gerada pelo músculo quando estimulado através do nervo deve ser igual aos valores medidos ao estimulá-lo na membrana. Uma vez determinado o valor ideal da corrente, empurre o nervo para fora do eletrodo e forneça alguns pulsos de corrente.

Se a quantidade de corrente previamente selecionada for excessiva, os pulsos de corrente fornecidos através do eletrodo de sucção provocam a contração muscular conduzindo a corrente através do banho. Usando um software caseiro, desenvolvemos um protocolo de teste automatizado para o estudo da funcionalidade da junção neuromuscular do sóleo. O protocolo dura cerca de 65 minutos e é composto por quatro partes diferentes.

Na primeira parte, o músculo é estimulado com quatro pulsos únicos. Dois entregues diretamente e dois através do nervo. O tempo até o pico, o tempo de meio relaxamento, o valor máximo da derivada da força e a força de contração são então medidos a partir das respostas de contração.

Na segunda parte, o músculo é estimulado com uma série de trens de pulso que variam de 20 hertz a 80 hertz, que é a frequência tetânica. Para calcular a força, curvas de frequência para estímulos nervosos e diretos. Na terceira e quarta partes do protocolo, o músculo é submetido a dois paradigmas de fadiga para medir a falha da neurotransmissão e a fadiga intratetânica.

Durante esses paradigmas de fadiga, o músculo é continuamente estimulado com um trem de pulso entregue na membrana seguido por 14 trens de pulso entregues através do nervo. Toda a sequência é repetida 20 vezes. O primeiro paradigma é entregue a uma frequência de disparo de 35 hertz.

O segundo na frequência tetânica de 80 hertz. Acredita-se que a falha na transmissão neurológica desempenhe um papel importante no desenvolvimento da fadiga, pois está relacionada à propagação do potencial de bloqueio externo de ação, diminuição da liberação do transmissor e diminuição da excitabilidade da placa da capacidade de fadiga da junção. Outro aspecto da capacidade de fadiga da junção neuromuscular é claramente expresso pela fadiga intratetânica, que é uma estimativa da capacidade do músculo de manter a força durante uma única contração tetânica e reflete a fadiga de alta frequência.

Ao final do protocolo, o comprimento e o peso do músculo líquido são medidos usando um paquímetro analógico e uma balança de precisão para calcular a área da seção transversal do músculo. Estudos sobre o modelo de camundongo transgênico SOD1 de esclerose lateral amiotrófica destacaram o potencial dessa metodologia. De fato, os músculos sóleo transgênicos produzem uma resposta contrátil reduzida tanto para a força derivada quanto para a força tetânica quando estimulados diretamente e uma redução ainda maior quando estimulados através do nervo.

No que diz respeito à força tetânica, por exemplo, esses experimentos mostraram que a contratilidade muscular é responsável por 25% dos danos, enquanto outros 45% estão relacionados a defeitos na transmissão neurológica. Outro ponto interessante é a ausência de qualquer diferença nos músculos de controle quando estimulados direta ou indiretamente. Esse achado comprova que a metodologia não induz nenhum artefato técnico, uma vez que se espera que a junção neuromuscular seja totalmente funcional em animais controle.

Em relação à fadiga intratetânica, os resultados mostraram valores significativamente menores nos músculos sóleos transgênicos do que em seus equivalentes controle. Curiosamente, o músculo sóleo transgênico é significativamente danificado pela estimulação repetitiva, o que significa que a funcionalidade da junção neuromuscular pode ser avaliada por um tempo máximo de estimulação de oito minutos. Após oito minutos, o músculo transgênico retorna a um valor de força quase nulo quando estimulado.

Depois de assistir ao vídeo, você deve ter entendido como medir a funcionalidade da junção neuromuscular e o músculo sóleo do mouse. Dado que esta técnica se baseia na medição indireta da funcionalidade da junção neuromuscular, não permite ser feita quando os defeitos relatados estão relacionados a alterações morfológicas ou bioquímicas. Por outro lado, essa abordagem representa uma forma essencial de avaliar se essas agressões afetam a funcionalidade do sinal de neurotransmissão pelo usuário.

Finalmente, a proposta do protocolo pode ser facilmente adotada para medir a funcionalidade da junção neuromuscular do diafragma, outro músculo frequentemente envolvido em doenças patológicas.