Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

O objetivo geral deste procedimento é estudar a funcionalidade da junção neuromuscular por meio de uma abordagem experimental ex vivo. Isso é realizado estimulando a preparação do nervo muscular de duas maneiras: diretamente na membrana muscular e através do nervo. Como a estimulação da membrana contorna a sinalização da transmissão neural, quaisquer diferenças entre as duas respostas contráteis podem ser consideradas uma medida indireta da funcionalidade da junção neuromuscular.

Aqui apresentamos este procedimento em preparação do nervo ciático do sóleo. O músculo é dissecado juntamente com seu nervo e colocado em um banho de tecido perfundido. É fixado a um controlador de força e comprimento, e um par de eletrodos de platina é posicionado paralelamente ao músculo.

Um eletrodo de sucção de vidro é então movido próximo à extremidade cortada do nervo. Um protocolo abrangente de testes é então aplicado para avaliar minuciosamente tanto a junção neuromuscular quanto a funcionalidade muscular. A conexão funcional entre músculo e nervo é conclusiva para ambas as partes e para a fração sobrevivente dois.

No primeiro estágio do nível de cada um dos dois tecidos, ocorre comunicação nas junções neuromusculares, que normalmente exibem uma morfologia em forma de prato. No entanto, em diversas condições patológicas, a funcionalidade mútua entre músculo e nervo é gravemente comprometida e as junções neuromusculares perdem a organização morfológica complexa. O objetivo geral do nosso procedimento é estudar a funcionalidade das junções neuromusculares utilizando uma abordagem experimental ex vivo.

Isso é realizado estimulando a preparação do nervo muscular de duas maneiras: uma estimulando diretamente a membrana muscular e outra estimulando o nervo e analisando as propriedades musculares. Ligue o banho de água com circulação e ajuste a temperatura para 30 graus Celsius.

Encha o banho com a solução de Krebs-Ringer. Permita que 0,4 bar de mistura gasosa passe pelo oxitubo e entre no banho. Ligue o transdutor do atuador e os dois estimuladores de pulso.

Defina os valores de corrente em 300 milhões de pares para a estimulação da membrana e em cinco milhões de pares para a estimulação do nervo. Após sacrificar o camundongo por dislocação cervical, remova a pele das patas. Em seguida, corte o tendão de Aquiles e, enquanto segura firmemente o tendão com uma pinça, puxe o músculo gastrocnêmio e o sóleo juntos para cima.

Uma vez exposto o tendão proximal do sóleo, corte toda a panturrilha acima dele e coloque rapidamente a amostra na banho tecidual preparatório localizado sob o microscópio estereoscópico. Usando uma pinça, prenda firmemente o tendão proximal do sóleo e puxe-o suavemente para expor a inervação ciática. Após a exposição da inervação, remova os tecidos circundantes para revelar cerca de cinco milímetros do nervo.

Em seguida, utilize um par de tesouras finas para cortar cuidadosamente o nervo. Complete a remoção do músculo e do nervo cortando o tendão de Aquiles para separar o sóleo do gastrocnêmio. Agora, o preparado de músculo e nervo está pronto para ser montado no aparelho de teste.

Crie um nó corrediço na extremidade do fio de náilon e aperte-o ao redor do tendão de Aquiles. Prenda o tendão proximal dentro do grampo fixo e amarre o fio de náilon ao braço da alavanca do transdutor de força. Deixe o músculo equilibrar na solução.

Para determinar o comprimento inicial ideal, estimule o músculo com uma série de pulsos únicos enquanto ajusta suavemente o valor da carga de fluência. O comprimento ideal é obtido quando a força do contração de choque é máxima. Posicione os eletrodos de sucção próximos ao músculo e puxe o nervo para dentro.

Em seguida, enquanto altera suavemente o valor da corrente de pulso, estimule o músculo com uma série de pulsos únicos. A força de contração gerada pelo músculo quando estimulado através do nervo deve ser igual aos valores medidos ao estimulá-lo na membrana. Uma vez determinado o valor ideal da corrente, afaste o nervo do eletrodo e aplique alguns pulsos de corrente.

Se a quantidade de corrente previamente selecionada for excessiva, os pulsos de corrente entregues através do eletrodo de sucção provocam a contração muscular ao conduzir a corrente através do banho. Utilizando um software desenvolvido em laboratório, idealizamos um protocolo automatizado de testes para o estudo da funcionalidade da junção neuromuscular do sóleo. O protocolo dura cerca de 65 minutos e é composto por quatro partes diferentes.

Na primeira parte, o músculo é estimulado com quatro pulsos únicos. Dois aplicados diretamente e dois por meio do nervo. O tempo até o pico, o tempo半-relaxamento, o valor máximo da derivada da força e a força do contração são então medidos a partir das respostas de contração.

Na segunda parte, o músculo é estimulado com uma série de trens de pulsos variando de 20 hertz a 80 hertz, que é a frequência tetânica. Para calcular as curvas de força em função da frequência, tanto para estimulação nervosa quanto direta. Nas terceira e quarta partes do protocolo, o músculo é submetido a dois paradigmas de fadiga para medir a falha na transmissão neuromuscular e a fadiga intratetânica.

Durante esses paradigmas de fadiga, o músculo é continuamente estimulado com uma tremulação de pulsos aplicada na membrana, seguida por 14 tremulações de pulsos aplicadas através do nervo. Toda a sequência é repetida 20 vezes. O primeiro paradigma é aplicado com uma frequência de disparo de 35 hertz.

O segundo na frequência tetânica de 80 hertz. Acredita-se que a falha na transmissão neuromuscular desempenhe um papel importante no desenvolvimento da fadiga, pois está relacionada ao bloqueio externo da propagação do potencial de ação, à diminuição da liberação do neurotransmissor e à excitabilidade reduzida da junção neuromuscular e da capacidade de fadiga. Outro aspecto da capacidade de fadiga da junção neuromuscular é claramente expresso pela fadiga intratetânica, que é uma estimativa da capacidade do músculo de manter a força durante uma única contração tetânica e reflete a fadiga de alta frequência.

No final do protocolo, o comprimento e o peso musculares líquidos são medidos utilizando um paquímetro analógico e uma balança de precisão para calcular a área da seção transversal muscular. Estudos com o modelo murino transgênico SOD1 de esclerose lateral amiotrófica destacaram o potencial desta metodologia. De fato, os músculos sóleos transgênicos apresentam uma resposta contrátil reduzida tanto na derivada da força quanto na força tetânica quando estimulados diretamente, e uma redução ainda maior quando estimulados por meio do nervo.

No que diz respeito à força tetânica, por exemplo, esses experimentos demonstraram que a contratilidade muscular representa 25% dos danos, enquanto mais 45% estão relacionados a defeitos na transmissão neuromuscular. Outro ponto interessante é a ausência de qualquer diferença nos músculos controle quando estimulados direta ou indiretamente. Esse achado comprova que a metodologia não induz artefatos técnicos, já que a junção neuromuscular é esperada ser plenamente funcional em animais controle.

No que diz respeito à fadiga intratetânica, os resultados mostraram valores significativamente mais baixos nos músculos sóleos transgênicos do que nos seus controles. Curiosamente, o músculo sóleo transgênico é significativamente danificado pela estimulação repetitiva, o que significa que a funcionalidade da junção neuromuscular pode ser avaliada por um tempo máximo de estimulação de oito minutos. Após oito minutos, o músculo transgênico retorna a um valor quase nulo de força quando estimulado.

Após assistir ao vídeo, você deverá ter compreendido como medir a funcionalidade da junção neuromuscular e do músculo sóleo de camundongo. Dado que esta técnica baseia-se na medição indireta da funcionalidade da junção neuromuscular, ela não permite determinar se os defeitos relatados estão relacionados a alterações morfológicas ou bioquímicas. Por outro lado, esta abordagem representa um meio essencial para avaliar se essas agressões afetam a funcionalidade do sinal de neurotransmissão no organismo.

Por fim, a proposta de protocolo pode ser facilmente adotada para medir a funcionalidade da junção neuromuscular do diafragma, outro músculo frequentemente envolvido em doenças patológicas.