Name: Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Impara a misurare potenziali di membrana e risposte sinaptiche nei gamberi per neurofisiologia. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare circuiti neuronali e neuromodulazione in preparati educativi.

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Supportato da University of Kentucky, Dipartimento di Biologia, Ufficio di studi universitari e il College of Arts &amp; Sciences.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Potenziale di membrana Già nel 1902, Bernstein aveva a che fare con i temi di un potenziale di riposo nel assone di un calamaro. E &#39;interessante considerare come queste prime idee e osservazioni di Berstein (1902) e Nernst (1888) in seguito influenzato la ricerca in fisiologia della membrana. (Vedi recensione di Malmivuo e Plonsey, 1995, disponibile anche sul www <a href="http://www.bem.fi/book/">http://www.bem.fi/book/</a> ). Ci sono ancora, fino ad oggi, le scoperte in corso sulla funzione dei canali ionici e le proprietà delle membrane biologiche che sono molto importanti per comprendere la fisiologia cellulare, che si riferisce alla funzione di tessuti, organi e sistemi. Il confronto degli effetti sperimentali e teoricamente derivata esterno [K +] sul potenziale di membrana a riposo indica l&#39;influenza di ioni sul potenziale di membrana. Ulteriori esperimenti utilizzando questa stessa preparazione rimangono da eseguire per affrontare le domande fondamentali fisiologico. Alcuni sono stati evidenziati nel 1968 da Atwood e Parnas e devono ancora essere pienamente affrontato. Con le tecniche ottenute in questo esercizio, si può procedere a rispondere a molte domande ancora in altre preparazioni sperimentali così come nelle applicazioni fisiologiche legate alla medicina e alla salute. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità di una preparazione invertebrati modello per affrontare questioni fondamentali pertinenti a tutti gli animali. Con le conoscenze acquisite sui gradienti elettrochimici degli ioni in questo esercizio di cui sopra, è ora possibile passare alla eccitabilità delle membrane esaminando la trasmissione sinaptica a preparati neuromuscolari in gamberi. Misura Risposte Synaptic I dati forniti per la prima parte di questo laboratorio, e il film associati, hanno fornito passaggi chiave per la registrazione di potenziali di membrana e indagare la struttura muscolare. Nella seconda parte di questo laboratorio, la dimostrazione di dissezione e di registrazione, la trasmissione sinaptica alla NMJs di unità motorie fasica e tonica ha fornito una esposizione a concetti fondamentali nella fisiologia. L&#39;esposizione ad un circuito neurale, che può in parte può essere usata per spiegare comportamenti associati, nell&#39;animale intatto ha un potenziale non solo per gli studenti per studiare varie questioni di tipo aperto all&#39;interno del loro esercizio di laboratorio, ma anche per la ricerca futura sui circuiti neuronali in un pozzo invertebrati preparazione stabilita (Kennedy et al, 1969;. Antonsen e Edwards, 2003) Queste preparazioni possono essere utilizzati anche per studiare facilitazione sinaptica, depressione e lungo termine plasticità (non indagato in questo studio di laboratorio). Anche all&#39;interno di alcune specie di gamberi, plasticità neuronale dipende dallo stimolo condizioni sperimentali (Mercier e Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998) così come la loro ambiente naturale. In che misura la capacità di alterare l&#39;efficacia sinaptica e la dinamica dei muscoli serve l&#39;animale resta ancora da esplorare. Dal gambero si alterano il loro comportamento in relazione alle variazioni stagionali e il ciclo di muta, ci sono relativamente a lungo termine differenze attività nei loro sistemi neuromuscolare. E &#39;stato dimostrato che la fasica terminali del motore nervose dei muscoli artiglio più vicino esporre la morfologia classica fasica durante l&#39;inverno, ma si gonfiano e diventano più varicose per tutta la lunghezza del terminale durante i mesi estivi (Lnenicka 1993; Lnenicka e Zhao, 1991). Alcuni primi studi condotti in laterale gamberi giganti (LG) interneuroni all&#39;interno del cordone nervoso ventrale dimostrato la presenza di giunzioni gap (Johnson, 1924; Watanabe e Grundfest, 1961). E &#39;noto che la CO2 ha un effetto sulla comunicazione elettrica di disaccoppiamento giunzioni gap (Arellano et al, 1990). E &#39;stato recentemente dimostrato che il cordone nervoso e la comunicazione all&#39;interno del sistema nervoso centrale-sensoriale-motorio-muscolare del circuito, come descritto nella presente relazione, è anche sensibile al CO 2 l&#39;esposizione, che indica la presenza di giunzioni gap (Bierbower, 2010; Bierbower e Cooper, 2010) L&#39;attività spontanea della radice 3 ° motore è stato un argomento in quanto il 1960, quando Eckert (1961) ha esaminato se il tonico di tiro statico organo recettore muscolare (MRO) nello stesso segmento o vicini potrebbe spiegare l&#39;unità motoria spontanea. In questi studi precedenti è emerso che l&#39;attività è stata guidata all&#39;interno del cordone nervoso ventrale (VNC) eventualmente da centri superiori (Eckert, 1961; Kennedy e Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). Poiché la presenza di CO 2 smesso l&#39;attività spontanea, si può assumere in qualche parte del disco ai motoneuroni potrebbe esserci giunzioni gap o glutamatergica disco eccitatori. Il NMJs sono bloccati o esibire diminuita sensibilità al glutammato in presenza di CO 2, e possono essere bloccoKED come pure all&#39;interno del sistema nervoso centrale (Bierbower, 2010; Bierbower e Cooper, 2010; vedi anche Badre et al, 2005).. L&#39;azione di diversi neuromodulatori è anche facilmente studiato i vari tipi di NMJs (Cooper e Cooper, 2009; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). Inoltre, varie influenze sono esercitate dai neuromodulatori sul circuito nervoso centrale. È stato suggerito che la 5-HT e neuroni octopaminergic può funzionare come &#39;guadagno-setter&#39; nel alterando la produzione di circuiti neuronali (Ma et al, 1992;. Schneider et al, 1996;. Hörner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Molto lavoro resta da fare prima di poter comprendere appieno gli effetti dei neuromodulatori sulle cellule bersaglio individuali. Dato che neuromodulatori diversi possono lavorare in concerto con gli altri, l&#39;analisi della loro azione mista è uno spazio per la ricerca futura (Djokaj et al., 2001). Inoltre, pochi studi, in particolare nei vertebrati, affrontare gli effetti dei neuromodulatori su percorsi intero che può regolare uno specifico comportamento. In questo senso-SNC-motore preparazione unità si può esaminare l&#39;influenza sia di input sensoriali e neuromodulatori sull&#39;attività dei motoneuroni (Kennedy et al., 1969). Poiché è stato ipotizzato che il 5-HT gioca un ruolo nella regolazione dello stato comportamentale di gamberi, aragoste e granchi (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000), diversi tentativi sono stati fatti per determinare la sua concentrazione in il VNC, l&#39;emolinfa, e nei gangli isolati di aragoste (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick e Kravitz 1984;. Fadool et al, 1988). Tuttavia, c&#39;è stata una notevole variazione nelle misure registrato, precludendo specifiche relazioni dose-risposta, che potrebbe spiegare le azioni comportamentali. Un gambero di fiume con gli artigli tenuto in posizione rialzata e con la coda nascosta sotto il suo addome è stato pensato di esporre una posizione dominante (Livingstone et al., 1980). Lo stato di flessione addominale in gamberi non sembra essere la postura che gambero dominante, all&#39;interno di una coppia, mostra durante le interazioni sociali e, pur mantenendo uno status dominante gerarchico (Listerman et al., 2000). Gamberi sottomesso sarà anche infilare sotto i loro addomi se stessi come si ritirano da un avversario. Rimboccare coda tale è anche visto come una postura di difesa (Listerman et al., 2000). Questi comportamenti sono stati prontamente osservati in campo e in laboratorio (Bovbjerg, 1953, 1956; Bruski e Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). È interessante notare che le posture del comportamento osservato nel aragoste (Livingstone et al., 1980) sono invertiti per la 5-HT e iniezioni octopamina nel gambero australiano, distruttore Cherax (McRae, 1996). Forse, risposte completamente diverse sarebbe osservata nella preparazione flessore superficiale nel gambero australiano. Inoltre, poiché il dominio è generalmente dimensioni legati tra gamberi, ci si aspetterebbe un sistema di risposta molto rapido in plastica per mutate condizioni sociali (Strawn et al., 2000). La plasticità in risposta a neuromodulatori negli invertebrati è uno spazio aperto di indagine. Wyttenbach, Johnson e Hoy (1999) hanno prodotto dei media digitali e un manuale di laboratorio per sperimentazioni che coinvolgono le varie gamberi muscolare stesso presentati in questo rapporto, oltre ad altre preparazioni di gamberi. Questa è una risorsa eccellente per le esercitazioni degli studenti.

<ol><li> Gambero di fiume (Procambarus clarkii). Atchafalaya biologica Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard di gamberi salina: Modificato dalla soluzione di Van Harreveld (1936). (In mm) 205 NaCl, 5.3 KCl; 13,5 CaCl 2 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES e portato a pH 7.4. Serotonina, dopamina, glutammato e sono realizzati in soluzione salina gamberi. Soluzione fissante di Bouin è stato utilizzato direttamente e blu di metilene è fatto in soluzione salina gamberi. Tutti i prodotti chimici sono ottenuti da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Strumenti di dissezione: Fine # 5 pinzette, forbici, lama portalama, spille # 26002-20 insetti (tutti ottenuti da Strumenti Scienze Fine (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) . </li><li> Sylgard a fondo piatto in vetro </li><li> Bicchieri (di tenere soluzioni chimiche) </li><li> I segnali elettrici vengono registrati in linea ad una interfaccia PowerLab 26T a un computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Noi utilizziamo software standard da ADInstruments nome o Campo Grafico. </li><li> Modello 3000 AC / DC amplificatore per le registrazioni intracellulari così come extracellulare può essere utilizzato. </li><li> Dissezione microscopio con funzione di zoom per le registrazioni intracellulari. Per la registrazione focale su terminali visualizzato un microscopio composto con obiettivi in ​​posizione verticale (4 x e 20X) viene utilizzato. Uno ha bisogno di una fonte di luce Hg. </li><li> Per le registrazioni intracellulari usiamo tubo capillare di vetro (catalogo # 30-31-0 da FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). L&#39;elettrodo intracellulare dovrebbe avere una resistenza di 20 a 30 mOhm. Elettrodi intracellulari sono stati riempiti con 3 M KCl. </li><li> Un elettrodo di aspirazione viene utilizzata per registrare i segnali extracellulari. </li><li> Gabbia di Faraday. </li><li> Illuminatore ad alta intensità (sorgente luminosa). </li><li> Micromanipolatore </li></ol>

potenziali di membrana, risposte synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e istologia muscolare utilizzando la gamberi: esercizi di laboratorio per studenti

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

Lo scopo di questa relazione è quello di contribuire a sviluppare una comprensione degli effetti causati da gradienti ionici attraverso una membrana biologica. Due aspetti che influenzano il potenziale di membrana di una cellula e che affronteremo in questi esperimenti sono: (1) la concentrazione di ioni di K + all&#39;esterno della membrana, e (2) la permeabilità della membrana agli ioni specifici. Il addominale muscoli estensori gamberi sono in raggruppamenti con alcuni tonico essere (lento) e altri fasica (veloce) nel loro fenotipo biochimico e fisiologico, così come nella loro struttura, i motoneuroni che innervano questi muscoli sono corrispondentemente diverse caratteristiche funzionali. Noi usiamo questi muscoli così come il superficiale, il muscolo flessore tonico addominali per dimostrare la proprietà nella trasmissione sinaptica. Inoltre, si introduce un senso-SNC-motoneurone-muscolare circuito per dimostrare l&#39;effetto della stimolazione sensoriale cuticolare così come l&#39;influenza dei neuromodulatori su alcuni aspetti del circuito. Con le tecniche ottenute in questo esercizio, si può cominciare a rispondere a molte domande ancora in altre preparazioni sperimentali così come nelle applicazioni fisiologiche legate alla medicina e alla salute. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità di preparati invertebrati modello per affrontare questioni fondamentali pertinenti a tutti gli animali.

Gli esperimenti dimostrano un approccio facile per gli studenti di acquisire esperienza nell&#39;esame struttura muscolare, le risposte sinaptiche, gli effetti dei gradienti ionici e permeabilità di potenziali di membrana. Inoltre, un senso-SNC-motorio-muscolare circuito è presentato per mostrare un modo per testare gli effetti dei composti su un circuito neuronale.

Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti

Lo scopo di questo rapporto è contribuire a sviluppare la comprensione degli effetti causati dai gradienti ionici attraverso una membrana biologica. Due aspetti che ...

Gli obiettivi generali dei seguenti esperimenti sono comprendere le proprietà delle membrane eccitabili e la base ionica del potenziale di membrana a riposo, nonché apprendere metodi per misurare il potenziale di membrana e dimostrare le proprietà della trasmissione sinaptica. In una parte dell'esperimento, il potenziale di membrana a riposo verrà misurato modificando la concentrazione di potassio extracellulare. In un'altra parte dell'esperimento, i meccanismi della differenziazione sinaptica saranno studiati registrando risposte sinaptiche evocate in diverse unità motorie.Successivamente, viene presentato un circuito neurale facile da mantenere. Questo preparato può essere utilizzato sia per scopi didattici che per lo studio di vari aspetti di un circuito sensoriale verso il sistema nervoso centrale, dai neuroni motori ai muscoli. Questa serie di esperimenti dimostra la facilità di utilizzo del modello di gambero per affrontare questioni relative all'integrazione e alla trasmissione sinaptica del potenziale di membrana e alle differenze strutturali dei tipi di fibre muscolari.I principali vantaggi dell'utilizzo del preparato di gambero nell'insegnamento dei concetti e delle tecniche elettrofisiologici sono la facilità di dissezione, la capacità del preparato di rimanere vitale in una soluzione salina minima, la facilità di ottenere risposte sinaptiche e la semplicità nel distinguere l'organizzazione anatomica complessiva dei muscoli. Queste tecniche possono essere applicate anche ad altri preparati e contribuiranno a migliorare la comprensione della fisiologia e della modulazione sinaptica, nonché delle differenze biochimiche e strutturali nel preparato dimostrato. Per iniziare l'intervento chirurgico, selezionare un gambero di circa sei-dieci centimetri di lunghezza corporea e posizionarlo in ghiaccio tritato per cinque minuti per anestetizzarlo; per decapitare il gambero, afferrarlo dalla parte posteriore della testa, assicurandosi di tenere le dita lontane dalle chele e dalla bocca dell'animale, utilizzando forbici grandi.Rimuovere rapidamente la testa effettuando un taglio netto dietro gli occhi dell'astice d'acqua dolce, quindi rimuovere le zampe e le chele per evitare lesioni. Rimuovere gli stili nei maschi e le natatoie sia nei maschi che nelle femmine. Smaltire la testa e gli arti.Successivamente, separare l'addome dal torace effettuando un taglio lungo la membrana articolare che unisce addome e torace. Conservare la porzione addominale dell'astice e scartare il torace; orientando leggermente verso il basso, in direzione del lato ventrale e con un angolo, effettuare un taglio nel carapace lungo il margine laterale inferiore di ciascun lato dell'addome. Prestare attenzione a non tagliare troppo in profondità all'interno dell'astice.Seguire il disegno naturale delle linee del carapace dell'astice, che si estendono lungo la lunghezza di ogni segmento, utilizzando una pinzetta. Rimuovere la porzione ventrale del carapace tirandola verso l'alto e all'indietro, avendo cura di non danneggiare i muscoli addominali.Rimuovere i muscoli flessori. A questo punto, una massa bianca di tessuto può essere vista sopra i muscoli flessori profondi. Rimuovere con cura questo tessuto utilizzando pinzette.L'apparato digerente è ora visibile come un piccolo tubo che corre lungo la linea mediana dei muscoli flessori profondi. Rimuoverlo pinzandolo con una pinzetta nella parte superiore e tirandolo via dall'addome. Tagliare la parte inferiore dell'apparato digerente all'estremità della coda.Risciacquare la dissezione con soluzione fisiologica per assicurarsi che i residui fecali non interferiscano con il preparato. Utilizzando perni da dissezione, fissare gli angoli superiore e inferiore del preparato a una piastra di Petri rivestita con S guard. I muscoli estensori addominali sono ora esposti.Versare soluzione salina nella piastra di Petri in modo da coprire il preparato fino all'esecuzione delle registrazioni intracellulari. Spostare la piastra di Petri sul microscopio e utilizzare della cera sotto la piastra per impedirne lo spostamento. L'apparato utilizzato per le registrazioni intracellulari è mostrato in questa figura.I collegamenti e le impostazioni appropriati sono indicati nel testo allegato. Configurare il software della scheda di laboratorio seguendo le istruzioni. Nel testo allegato, posizionare il cavo di messa a terra nel bagno salino.Posizionare la punta di una micropipetta di vetro riempita con cloruro di potassio tre molare nel bagno salino e verificare la resistenza dell'elettrodo. La resistenza dell'elettrodo deve essere compresa tra 20 e 60 megaohm. Utilizzare la manopola grossolana dell'amplificatore per spostare la linea sul diagramma del laboratorio a zero sotto un'illuminazione intensa.Esaminare al microscopio e identificare i muscoli DEM longitudinali. Utilizzare la sonda elettrodica per inserire l'elettrodo intracellulare in una fibra muscolare del muscolo DEM. L'elettrodo deve essere inserito appena appena nella fibra muscolare.Attenzione a non penetrare completamente la cellula. Misurare l'ampiezza del potenziale di riposo. Trascinare il cursore M sul tracciato a partire dalla posizione situata nell'angolo in basso a sinistra della finestra del grafico.Posizionare il marcatore M sulla linea di base e spostare il cursore sul punto più basso del segnale registrato. La differenza tra il marcatore e il cursore attivo viene visualizzata nell'angolo superiore destro dello schermo. Questo valore corrisponde al voltaggio del potenziale di membrana a riposo.Dividere la tensione registrata per il fattore di amplificazione; in questo caso è stato utilizzato un'amplificazione 10x. Successivamente, convertire la tensione da volt a millivolt. Dopo aver registrato il potenziale di riposo per quella fibra muscolare, osservare attraverso il microscopio e rimuovere con attenzione l'elettrodo dalla fibra muscolare.Ripetere la registrazione intracellulare su altre fibre muscolari. La parte successiva di questo esperimento monitorerà l'effetto dell'aumento della concentrazione di potassio extracellulare sul potenziale di membrana a riposo. Saranno utilizzate sei soluzioni saline per gambero con concentrazioni di potassio pari a 5,4, 20, 40, 60, 80 e 100 millimolari.Scegliere un muscolo che non stia fremendo per effettuare la successiva registrazione intracellulare tra una registrazione e l'altra. Sostituire la soluzione nel bagno con la soluzione successiva di cloruro di potassio a concentrazione più elevata. Assicurarsi di coprire completamente il preparato ogni volta.Registrare le variazioni del potenziale di membrana per ogni soluzione. L'effetto dell'aumento della concentrazione extracellulare di potassio sul potenziale di membrana è mostrato in questo grafico, in cui i potenziali di membrana a riposo per ciascuna concentrazione di potassio sono riportati in un grafico semilogaritmico della concentrazione extracellulare di potassio in funzione del potenziale di membrana. Allineare il potenziale di riposo a una concentrazione extracellulare di potassio di 5,4 millimolare.Per le curve ipotetiche e osservate, confrontare la pendenza della linea osservata con quella della linea ipotetica. Al termine di queste registrazioni elettrofisiologiche, il passo successivo consiste nell'esaminare l'anatomia delle fibre muscolari e il loro schema di innervazione. Trasferire il preparato nella bacinella in piedi e aggiungere blu di metilene.Dopo cinque minuti, rimuovere il blu di metilene e aggiungere soluzione salina fresca per gamberi. Individuare il nervo principale che innerva i muscoli all'interno di un segmento. Disegnare lo schema di innervazione dei muscoli S-E-M-D-E-L 2D EL uno e DEM in un segmento.Successivamente, spostare il preparato sotto una cappa aspirante. Rimuovere la soluzione salina e aggiungere il fissativo. Il fissativo utilizzato qui è una soluzione poin.Lo scopo della cappa chimica è evitare i vapori del fissativo. Prestare molta attenzione a non far entrare la soluzione a contatto con la pelle o gli occhi. Se gli occhi iniziano a bruciare, lavarli immediatamente alla stazione per il lavaggio degli occhi.Lasciare la soluzione boina in contatto con il preparato per circa 10 minuti, quindi utilizzare una pipetta per sostituire la soluzione con soluzione fisiologica. Ritagliare un sottile segmento del muscolo DEL uno o DEL due. Posizionarlo su un vetrino.Etichettare il vetrino. Ripetere la procedura per il muscolo SEM. Utilizzare il microscopio ottico per osservare il modello di striature dei sarcomeri in entrambi i preparati tessutali.La prossima serie di esperimenti esaminerà come registrare le risposte sinaptiche nei muscoli addominali del gambero. Selezionare un altro gambero e decapitarlo. Rimuovere il torace e gli ap pendici ed esporre i muscoli estensori addominali come mostrato nell'intervento chirurgico.Nella prima sezione di questo video, utilizzando il microscopio, individuare il nervo che trasporta gli assoni motori ai muscoli estensori. Cercare il segmento con il nervo più accessibile. Il nervo è di colore bianco e può essere osservato spruzzando salina sulla preparazione con una pipetta o soffiando leggermente sulla preparazione.Questo provoca lo spostamento del nervo, rendendone così l'identificazione più semplice. Posizionare l'elettrodo di aspirazione, tenuto dal micromanipolatore, direttamente sopra il nervo. Tirare delicatamente sulla siringa per aspirare il nervo all'interno dell'elettrodo.È possibile osservare il nervo che viene aspirato all'interno dell'elettrodo attraverso il microscopio. Regolare le impostazioni nel software della scheda di acquisizione dati come specificato nell'articolo allegato. Riempire un microelettrodo di vetro con cloruro di potassio tre molare e collegarlo allo stadio di testa e al power lab.Utilizzare la manopola grossolana sull'amplificatore per spostare la linea del grafico del laboratorio su zero. Prima di inserire l'elettrodo, il pulsante a levetta deve essere acceso e spento più volte. Per verificare la resistenza dell'elettrodo, misurare l'ampiezza dei valori risultanti.Osservare attraverso il microscopio e utilizzare la sonda dell'elettrodo per inserire l'elettrodo in una delle fibre muscolari longitudinali, sia quella DEM, che DL uno o DL due. Fare attenzione a non penetrare completamente la fibra muscolare. Il preparato è ora pronto per l'esperimento.L'elettrodo di aspirazione viene utilizzato per stimolare il fascio nervoso segmentale e l'elettrodo microscopico di vetro viene utilizzato per registrare la risposta sinaptica dalla fibra muscolare, attivando lo stimolatore del trapianto per stimolare il nervo a un hertz per ottenere risposte fasiche. Successivamente, posizionare l'elettrodo in una fibra muscolare SEL. Il SEL è un muscolo tonico.Stimolare il nervo con brevi raffiche di impulsi a 10 hertz per ottenere risposte toniche. Confrontare le risposte registrate dei muscoli DEL e SEL. Notare che i muscoli fasici DEL presentano risposte sinaptiche di ampiezza maggiore rispetto ai muscoli tonici SEL.Questo successivo insieme di esperimenti si concentra sui muscoli flessori dell'astice piuttosto che sui muscoli estensori. Partendo da un nuovo astice, isolare l'addome come mostrato in questo intervento chirurgico. Nella prima sezione di questo video, posizionare il preparato della coda isolata in una capsula di Petri riempita di soluzione salina, fissare con spilli la coda e la porzione superiore del preparato.Si noti che negli esperimenti di decarizzazione sui muscoli flessori tonici, il cordone nervoso ventrale deve essere lasciato integro. Utilizzare un bisturi per iniziare un taglio longitudinale attraverso la membrana articolare tra due coste sul lato ventrale del preparato. Prestare molta attenzione a non tagliare troppo in profondità durante questo intervento, poiché un taglio profondo potrebbe recidere la radice del nervo motore, con l'obiettivo di garantire che i muscoli superficiali non vengano danneggiati.Eseguire il passaggio successivo. Guardando attraverso un microscopio, utilizzare forbici o un bisturi per effettuare un taglio orizzontale a partire dall'incisione longitudinale nel sottile strato membranoso che ricopre il muscolo. Allargare il taglio per creare una linguetta di membrana articolare e sollevare la linguetta verso l'alto.Usare le forbici per tagliare la falda esponendo i muscoli flessori superficiali al fine di effettuare la registrazione intracellulare dai muscoli flessori superficiali. Utilizzare la stessa strumentazione e configurazione impiegate per registrare il potenziale di membrana a riposo e le risposte sinaptiche dai flessori addominali. Come in precedenza, usare un elettrodo intracellulare riempito con cloruro di potassio tre molare.Inserire l'elettrodo in una fibra muscolare dei muscoli flessori superficiali, avendo cura di non attraversare completamente il muscolo. Registrare l'attività spontanea dei PEPS. Osservare le diverse ampiezze dei PEPS e verificare la presenza di qualsiasi PISP.Prendere un piccolo pennello e spazzolare con attenzione lungo il margine della cuticola all'interno del segmento contenente l'elettrodo di registrazione. Osservare eventuali variazioni nella frequenza o nell'ampiezza dei potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) in seguito alla stimolazione, qualora si osservi una risposta maggiore. Ciò indicherebbe il reclutamento di ulteriori motoneuroni che rispondono al cambiamento nell'attività di scarica del nervo sensitivo.Sostituire con attenzione la soluzione salina del bagno con una contenente un neuromodulatore, come un micromolare di serotonina o salina saturata con anidride carbonica. Ripetere quindi la stimolazione con il pennello. Osservare l'effetto che la modifica della soluzione del bagno ha sull'attività registrata.Ripristinare la soluzione fisiologica normale nel bagno e osservare il ritorno dell'attività della fibra muscolare ai livelli di base. Questa figura mostra i potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) registrati in una fibra muscolare flessoria superficiale. Notare le diverse ampiezze degli EPSP.La fase successiva di questo esperimento utilizza un elettrodo extracellulare per monitorare i potenziali d'azione dei neuroni motori in risposta all'attività del circuito da nervi sensitivi al SNC fino ai neuroni motori. Iniziare realizzando un elettrodo a succhietto per stimolare i nervi sensitivi. Tirare un pezzo di tubo di plastica sopra una fiamma.Il passaggio successivo consiste nel tagliare il tubo alla dimensione desiderata. Per farlo, è necessario osservare il nervo nel proprio preparato per valutare il diametro di apertura desiderato per l'elettrodo a suggente. A seconda delle dimensioni dell'astice, i fasci nervosi possono variare di dimensione da circa un millimetro fino a pochi millimetri di diametro.Tagliare la sezione di tubo allungata per ottenere un'apertura alla punta delle dimensioni corrette per contenere il nervo. Se l'apertura è troppo grande, il nervo potrebbe uscire. Se l'apertura è troppo piccola, il nervo potrebbe subire danni a causa della pressione dell'elettrodo.Posizionare il tubo di plastica sulla punta di un elettrodo suc in vetro. L'allestimento per elettrofisiologia e software è leggermente diverso rispetto al monitoraggio delle risposte extracellulari, rispetto a quello utilizzato per le registrazioni intracellulari. Utilizzando l'apparecchiatura specificata nell'articolo associato, aspirare la terza radice che innerva il muscolo flessore superficiale all'interno dell'elettrodo a suggizione.Ora puoi iniziare a registrare i potenziali d'azione. Questo percorso comprende cinque neuroni motori eccitatori e un neurone motore inibitore. Dopo aver registrato l'attività di base, stimola la cuticola con un pennello per osservare il cambiamento nei potenziali d'azione generati.In seguito, sostituire la soluzione di bagnatura con neuromodulatori come la serotonina, come nell'esperimento precedente, e registrare qualsiasi variazione nella risposta. Ulteriori esercizi sono riportati nel testo allegato. Questa registrazione mostra i potenziali d'azione registrati dal terzo assone prima e durante la stimolazione della cuticola con un pennello; confrontare la frequenza dei potenziali d'azione prima dello stimolo con quella durante la stimolazione.Questa registrazione mostra i potenziali d'azione registrati dal terzo nervo in soluzione salina normale e in una soluzione di serotonina. Confronta la frequenza dei potenziali d'azione in soluzione salina normale con la loro frequenza in serotonina, come mostrato poco fa. La stimolazione aumenta la frequenza di scarica rispetto al valore basale.È inoltre dimostrato che la serotonina aumenta la frequenza di scarica rispetto alla soluzione salina normale. Questa figura mostra che quando la stimolazione meccanica e la serotonina vengono combinate, si osserva un ulteriore aumento della frequenza di scarica. Il confronto tra gli effetti esterni e quelli teorici della concentrazione esterna di potassio sul potenziale di membrana a riposo indica l'influenza degli ioni sul potenziale di membrana.Abbiamo inoltre mostrato come registrare le risposte ntic alle giunzioni neuromuscolari di muscoli sia fasici che tonici. Queste tecniche possono essere utilizzate in laboratori sperimentali per studenti al fine di insegnare concetti fondamentali e principi di fisiologia. Le tecniche acquisite in questo esercizio di laboratorio possono essere impiegate per rispondere a domande relative ad altre preparazioni sperimentali, nonché ad applicazioni fisiologiche connesse alla medicina e alla salute.

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Il muscolo della gamba opener gambero viene presentato per la sua importanza storica e la versatilità sperimentale nel fenotipo muscolare, la fisiologia e la plasticità sinaptica.

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Questo articolo viene illustrato come effettuare registrazioni elettrofisiologiche delle risposte sinaptiche sul muscolo estensore della gamba a piedi di un gambero e come le terminazioni nervose sono visualizzati per mostrare le differenze morfologiche lordo di alta e bassa resa terminazioni nervose.

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Questa è una dimostrazione di come le membrane biologiche può essere compreso utilizzando modelli elettrici. Abbiamo anche dimostrare le procedure per la registrazione di potenziali d'azione dal cordone nervoso ventrale del gambero per i laboratori di orientamento degli studenti.

Modellazione membrane biologiche con Circuiti e misurazione dei segnali elettrici negli assoni: Esercizi di laboratorio per studenti

Abbiamo sviluppato due metodi per lo studio degli effetti dei riferimenti visivi sul comportamento in assenza di segnali tattili e chimici. Un metodo comporta risposte videoregistrando di gamberi alle pareti riflettenti in un acquario, l'altro prende in esame gli effetti di input visivi forniti da un gambero vivo dietro un divisorio trasparente.

Registrazione di risposte comportamentali alla riflessione in gamberi di fiume

In questo rapporto si dimostra tecniche che possono essere utilizzati per studiare la biologia del hindgut gamberi. Mostriamo come dissezionare un addome gamberi e studiare l'anatomia associati, la fisiologia e la modulazione di attività. L'attività peristaltica e la forza delle contrazioni sono misurati utilizzando un trasduttore di forza.

La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

Una tecnica dal vivo imaging di fluorescenza per quantificare la ricostituzione e la mobilitazione di specifiche vescicole sinaptiche (SV) piscine in terminazioni nervose centrale è descritto. Due tornate di SV riciclaggio sono monitorati nei terminali nervosi pur prevedendo un controllo interno.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

Tecniche fisiologiche e anatomiche sono dimostrati per affrontare funzione e la struttura per propriocettori articolari e recettori tensione muscolare degli arti crostacei piedi.

Propriocezione e la tensione recettori in Crab Arti: Esercizi di laboratorio per studenti

Impara a misurare potenziali di membrana e risposte sinaptiche nei gamberi per neurofisiologia. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare circuiti neuronali e neuromodulazione in preparati educativi.

Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti (Video) | JoVE Journal

Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti

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