Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti

Gli obiettivi generali dei seguenti esperimenti sono comprendere le proprietà delle membrane eccitabili e le basi ioniche del potenziale di membrana a riposo, e apprendere metodi per misurare il potenziale di membrana e dimostrare le proprietà della trasmissione sinaptica. In una parte dell'esperimento, il potenziale di membrana a riposo sarà misurato alterando il potassio extracellulare. In un'altra parte dell'esperimento, i meccanismi di differenziamento sinaptico saranno studiati registrando risposte sinaptiche stimolate in varie unità motorie.

Successivamente, viene presentato un circuito neurale di facile manutenzione. Questa preparazione può essere utilizzata per l'insegnamento e la ricerca di vari aspetti di un circuito sensoriale, del SNC, del motoneurone e del muscolo. Questa serie di esperimenti mostra la facilità di utilizzo del modello del gambero di fiume per affrontare i problemi relativi all'integrazione e alla trasmissione sinaptica del potenziale di membrana e alle differenze strutturali dei tipi di fibre muscolari.

I principali vantaggi dell'utilizzo della preparazione di gamberi nell'insegnamento di concetti e tecniche elettrofisiologiche sono la facilità di dissezione, la vitalità della preparazione di soluzione salina minima, la facilità di ottenere risposte sinaptiche e la facilità di discernere la disposizione anatomica complessiva dei muscoli. Queste tecniche possono essere applicate anche ad altre preparazioni e miglioreranno la nostra comprensione della fisiologia sinaptica e della modulazione e delle differenze biochimiche e strutturali nella preparazione dimostrata. Per iniziare l'intervento, seleziona un gambero di circa 6-10 centimetri di lunghezza del corpo e mettilo nel ghiaccio tritato per cinque minuti per anestetizzarlo per decapitare il gambero, tienilo dalla parte posteriore della testa, assicurandoti di tenere le dita fuori dalla portata delle chele e della bocca del gambero usando grandi forbici.

Rimuovere rapidamente la testa praticando un taglio netto da dietro gli occhi del gambero, rimuovere le zampe e le chele del gambero per evitare lesioni. Rimuovi gli stili sui maschi e le swimmer ettes sia sui maschi che sulle femmine. Smaltire la testa e le appendici.

Successivamente, separa l'addome dal torace praticando un taglio lungo la membrana articolare, che unisce l'addome e il torace. Conservare la parte addominale del gambero e smaltire il torace, puntando leggermente le forbici verso il lato ventrale e, ad angolo, praticare un taglio nel guscio lungo il bordo laterale inferiore di ciascun lato dell'addome. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità i gamberi.

Segui lo schema naturale del guscio delle linee dei gamberi che corrono per la lunghezza di ogni segmento usando il forcipe. Rimuovere la parte ventrale del guscio tirandolo su e indietro. Facendo attenzione a non distruggere i muscoli addominali.

Rimuovere i muscoli flessori. A questo punto, una massa bianca di tessuto può essere vista sopra i muscoli flessori profondi. Rimuovere questo tessuto con cura con una pinza.

Il tratto gastrointestinale è ora visibile come un piccolo tubo che corre lungo la linea mediana dei muscoli flessori profondi. Rimuoverlo pizzicandolo con una pinza nella parte superiore e tirandolo via dall'addome. Taglia la parte inferiore del tratto gastrointestinale all'estremità della coda.

Sciacquare la dissezione con soluzione fisiologica per assicurarsi che i rifiuti fecali non interferiscano con la preparazione. Utilizzando i perni di dissezione, fissare gli angoli superiore e inferiore della preparazione su una piastra di Petri rivestita con protezione a S. I muscoli estensori addominali sono ora esposti.

Versare la soluzione salina nella capsula di Petri per coprire la preparazione fino a quando non vengono eseguite le registrazioni intracellulari. Sposta la capsula di Petri al microscopio e usa la cera sotto la piastra per evitare che si muova. L'apparato utilizzato per le registrazioni intracellulari è mostrato in questa figura.

I collegamenti e le impostazioni appropriati sono riportati nel testo di accompagnamento. Configura il software per cartelle cliniche secondo le istruzioni. Nel testo di accompagnamento, posizionare il filo di terra nel bagno salino.

Posizionare la punta di una micropipetta di vetro riempita con tre molari di cloruro di potassio nel bagno salino e testare la resistenza dell'elettrodo. La resistenza dell'elettrodo deve essere compresa tra 20 e 60 mega ohm. Utilizzare la manopola grossolana sull'amplificatore per spostare la linea sul grafico di laboratorio a zero in condizioni di illuminazione ad alta intensità.

Guarda attraverso il microscopio e identifica i muscoli DEM longitudinali. Utilizzare la sonda dell'elettrodo per inserire l'elettrodo intracellulare in una fibra muscolare del muscolo DEM. L'elettrodo deve essere inserito a malapena nella fibra muscolare.

Fare attenzione a non penetrare fino in fondo attraverso la cella. Misurare l'ampiezza del potenziale di riposo. Trascinare il cursore M sulla traccia dalla posizione nell'angolo in basso a sinistra della finestra del grafico.

Posizionare il marcatore M sulla linea di base e spostare il cursore sul punto più basso del segnale registrato. La differenza tra l'indicatore e il cursore attivo viene visualizzata nella parte superiore destra dello schermo. Questo valore è la tensione del potenziale di membrana a riposo.

Dividi la tensione registrata per la quantità di amplificazione, in questo caso è stata utilizzata 10 x l'amplificazione. Quindi convertire la tensione da volt a millivolt. Dopo aver registrato il potenziale di riposo per quella fibra muscolare, guarda attraverso il microscopio e rimuovi con cura l'elettrodo dalla fibra muscolare.

Ripetere la registrazione intracellulare su altre fibre muscolari. La prossima parte di questo esperimento monitorerà l'effetto dell'aumento della concentrazione extracellulare di potassio sulla membrana a riposo. Verranno utilizzate potenziali sei soluzioni saline di gamberi con concentrazioni di potassio di 5,4, 20, 40, 60, 80 e 100 millimolari.

Scegli un muscolo che non si contragga per eseguire la successiva registrazione intracellulare tra le registrazioni. Sostituire la soluzione del bagno con la successiva concentrazione più alta di soluzione di cloruro di potassio. Assicurati di coprire completamente la preparazione ogni volta.

Registrare le variazioni del potenziale di membrana per ciascuna soluzione. L'effetto dell'aumento della concentrazione extracellulare di potassio, il potenziale di membrana è mostrato in questo grafico di cattura dello schermo i potenziali di membrana a riposo per ciascuna concentrazione di potassio su un grafico semilogaritmico della concentrazione di potassio extracellulare rispetto al potenziale di membrana. Allineare il potenziale di riposo a 5,4 millimolari di potassio extracellulare.

Per le curve ipotetiche e osservate, confrontare la pendenza della retta osservata con la pendenza della retta ipotetica. Dopo aver terminato queste registrazioni elettrofisiologiche, il passo successivo è esaminare l'anatomia delle fibre muscolari e il loro modello di innervazione. Trasferire la preparazione nella pirofila e aggiungere il blu di metilene.

Dopo cinque minuti, rimuovere il blu di metilene e aggiungere soluzione salina fresca per i gamberi. Cerca il nervo principale che innerva i muscoli all'interno di un segmento. Disegna il modello di innervazione per i muscoli S-E-M-D-E-L 2D EL uno e DEM in un segmento.

Quindi, spostare il preparato sotto una cappa aspirante. Togliere la soluzione salina e aggiungere il fissativo. Il fissativo qui utilizzato è una soluzione di punta.

Lo scopo della cappa è quello di evitare i vapori del fissativo. Fai molta attenzione a non mettere questa soluzione sulla pelle o negli occhi. Se gli occhi iniziano a bruciare, lavarli immediatamente presso la stazione di lavaggio oculare.

Lasciare riposare la soluzione di boin sul preparato per circa 10 minuti, quindi utilizzare una pipetta per sostituire la soluzione con soluzione fisiologica. Ritagliare un segmento sottile di DEL uno o DEL due muscoli. Posizionalo su un vetrino.

Etichettare la diapositiva. Ripetere la procedura per il muscolo SEM. Utilizzare il microscopio composto per visualizzare il modello di bande del sarcomero in entrambe le preparazioni tissutali.

La prossima serie di esperimenti esaminerà come registrare le risposte sinaptiche nei muscoli addominali dei gamberi. Seleziona un altro gambero, decapitalo. Rimuovere il torace e le appendici ed esporre i muscoli estensori addominali come mostrato nell'intervento chirurgico.

Nella prima sezione di questo video, usando il microscopio, trova il nervo che porta gli assoni motori ai muscoli estensori. Cerca il segmento con il nervo più accessibile. Il nervo è bianco e può essere visto usando una pipetta per spruzzare soluzione salina sul preparato o soffiando leggermente sul preparato.

Questo fa muovere il nervo e quindi ne facilita l'identificazione. Posizionare l'elettrodo di aspirazione tenuto dal manipolatore microm direttamente sopra il nervo. Tirare delicatamente la siringa per aspirare il nervo nell'elettrodo.

È possibile vedere il nervo che viene risucchiato nell'elettrodo attraverso il microscopio. Regola le impostazioni nel software per cartelle cliniche come specificato nell'articolo allegato. Riempire un microelettrodo di vetro con cloruro di potassio a tre molari e collegarlo allo stadio principale e al laboratorio di potenza.

Utilizzare la manopola di rotta sull'amplificatore per spostare la linea sul grafico di laboratorio a zero. Prima di inserire l'elettrodo, la manopola di commutazione deve essere accesa e poi spenta più volte. Per testare la resistenza dell'elettrodo, misurare l'ampiezza dei valori risultanti.

Guarda attraverso il microscopio e usa la sonda dell'elettrodo per inserire l'elettrodo in una delle fibre muscolari longitudinali, DEM o DL uno o DL due. Fare attenzione a non penetrare attraverso la fibra muscolare. La preparazione è ora pronta per l'esperimento.

L'elettrodo di aspirazione viene utilizzato per stimolare il fascio nervoso segmentale e il microelettrodo di vetro viene utilizzato per registrare la risposta sinaptica dalla fibra muscolare, attivare lo stimolatore dell'innesto per stimolare il nervo a un hertz per le risposte fasiche. Quindi, posizionare l'elettrodo in una fibra muscolare SEL. Il SEL è un muscolo tonico.

Stimola il nervo con brevi raffiche di impulsi a 10 hertz per risposte toniche. Confronta le risposte registrate dei muscoli DEL e SEL. Si noti che i muscoli DEL fasici hanno risposte sinaptiche di ampiezza maggiore rispetto ai muscoli SEL tonici.

Questa prossima serie di esperimenti si concentra sui muscoli flessori dei gamberi piuttosto che sui muscoli estensori. Iniziando con un nuovo gambero, isolare l'addome come mostrato in questo intervento chirurgico. Nella prima sezione di questo video, posiziona la preparazione della coda isolata in una capsula di Petri piena di soluzione salina, fissa la coda e la parte superiore della preparazione.

Si noti che dopo gli esperimenti di Caro sui muscoli flessori tonici, il cordone nervoso ventrale deve essere lasciato intatto. Utilizzare un bisturi per iniziare un taglio longitudinale attraverso la membrana articolare tra due costole sul lato ventrale del preparato. Fare molta attenzione a non tagliare troppo in profondità quando si esegue questo taglio poiché un taglio profondo potrebbe sezionare la radice nervosa motoria per garantire che i muscoli superficiali non vengano danneggiati.

Fai il passaggio successivo. Guardando attraverso un microscopio usando le forbici o un bisturi tagliato orizzontalmente dal taglio longitudinale nello strato sottile di membrana che copre il muscolo. Ingrandisci il taglio per creare un lembo di membrana articolata e solleva il lembo verso l'alto.

Usa le forbici per tagliare il lembo che espone i muscoli flessori superficiali per la registrazione intracellulare dai muscoli flessori superficiali. Utilizzare la stessa strumentazione e configurazione utilizzata per registrare il potenziale di membrana a riposo e le risposte sinaptiche degli estensori addominali. Come in precedenza, utilizzare un elettrodo intracellulare riempito con tre molari di cloruro di potassio.

Inserire l'elettrodo in una fibra muscolare dei muscoli flessori superficiali, facendo attenzione a non penetrare attraverso il muscolo. Registrare l'attività spontanea degli EPSP. Si noti le diverse dimensioni degli EPSP e se sono presenti IPSP.

Prendi un pennello piccolo e spazzola con cura lungo il bordo della cuticola all'interno dello stesso segmento contenente l'elettrodo di registrazione. Notare qualsiasi cambiamento nella frequenza o nelle dimensioni degli EPSP dovuto alla stimolazione se si osserva una risposta maggiore. Ciò indicherebbe il reclutamento di ulteriori motoneuroni che rispondono al cambiamento nell'attivazione del nervo sensoriale.

Sostituire con cura la soluzione del bagno salino con una contenente un neuromodulatore come una serotonina micromolare o una soluzione salina bollita con anidride carbonica. Quindi ripetere la stimolazione del pennello. Notare l'effetto che la modifica della soluzione del bagno ha sull'attività registrata.

Riportare la soluzione fisiologica del bagno alla soluzione fisiologica normale e osservare che l'attività delle fibre muscolari ritorna al basale. Questa figura mostra gli EPSP registrati in una fibra muscolare flessore superficiale. Si notino le diverse dimensioni degli EPSP.

La fase successiva di questo esperimento utilizza un elettrodo extracellulare per monitorare i potenziali d'azione dei motoneuroni che rispondono all'attività sensoriale del SNC e del circuito dei motoneuroni. Inizia realizzando un elettrodo di aspirazione per stimolare i nervi sensoriali. Tirare un pezzo di tubo di plastica su una fiamma.

Il passaggio successivo consiste nel rifilare il tubo alla dimensione desiderata. Per fare ciò, dovrai guardare il nervo nella tua preparazione per giudicare il diametro di apertura desiderato per il tuo elettrodo di aspirazione. A seconda delle dimensioni del gambero, i fasci nervosi possono variare di dimensioni da circa un millimetro a pochi millimetri di diametro.

Tagliare la sezione allungata del tubo per fare in modo che l'apertura nella punta abbia la dimensione corretta per trattenere il nervo. Se l'apertura è troppo grande, il nervo potrebbe cadere. Se l'apertura è troppo piccola, il nervo potrebbe essere danneggiato dalla pressione dell'elettrodo.

Posizionare il tubo di plastica sulla punta di un elettrodo di vetro suc. L'elettrofisiologia e la configurazione del software sono leggermente diverse dal monitoraggio delle risposte extracellulari rispetto alle registrazioni intracellulari. L'apparecchiatura, come specificato nell'articolo di accompagnamento, aspira la terza via che innerva il muscolo flessore superficiale nell'elettrodo di aspirazione.

Ora potete iniziare a registrare i potenziali d'azione. Questo percorso ha cinque motoneuroni eccitatori e un motoneurone inibitore. Dopo aver registrato l'attività di base, stimolare la cuticola con uno spazzolino per osservare la variazione dei potenziali d'azione generati.

Successivamente, sostituire la soluzione del bagno con neuromodulatori come la serotonina come nell'esperimento precedente e registrare qualsiasi cambiamento nella risposta. Ulteriori esercizi sono forniti nel testo di accompagnamento. Questa registrazione mostra i potenziali d'azione registrati dalla terza via prima e durante la stimolazione della cuticola con uno spazzolino, confronta la frequenza dei potenziali d'azione prima dello spazzolamento con la loro frequenza durante la stimolazione.

Questa registrazione mostra i potenziali d'azione registrati dalla terza via in soluzione fisiologica normale e in una soluzione di serotonina. Confronta la frequenza dei potenziali d'azione nella soluzione salina normale con la loro frequenza e serotonina Come appena mostrato. La spazzolatura aumenta la frequenza di sparo rispetto alla linea di base.

L'attività dimostrata è anche che la serotonina aumenta la frequenza di attivazione rispetto alla soluzione salina normale. Questa figura mostra che quando lo spazzolamento e la serotonina sono combinati, c'è un aumento ancora maggiore della frequenza di sparo. Il confronto degli effetti derivati esternamente e teoricamente della concentrazione esterna di potassio sul potenziale di membrana a riposo indica l'influenza degli ioni sul potenziale di membrana.

Ti abbiamo anche mostrato come registrare le risposte ntiche alle giunzioni neuromuscolari dei muscoli fasici e tonici. Queste tecniche possono essere utilizzate per laboratori di ricerca degli studenti per insegnare concetti fondamentali e fisiologia. Le tecniche ottenute in questa esercitazione di laboratorio possono essere utilizzate per rispondere a domande relative ad altre preparazioni di laboratorio, nonché ad applicazioni fisiologiche legate alla medicina e alla salute.