Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali

Prima parte, Introduzione. Ciao, mi chiamo Rafael. Sono un postdoc presso il Professor Stevens Hans Lab dell'Università Federale di Rio de Janeiro in Brasile.

Ciao, mi chiamo Ismail. Sono assistente di ricerca, anche professore. In questo video, mostreremo come preparare sezioni chiare dei corpi Android.

Quindi iniziamo. Parte seconda, materiali e attrezzature. Per questa procedura, avremo bisogno di un mezzo di inclusione per i campioni congelati.

4%Soluzione di aldeide paraforme per la fissazione delle cellule, soluzioni di saccarosio per la crioprotezione. Un ago con la punta leggermente piegata, uno stereomicroscopio per una migliore visualizzazione dell'EBS e uno shaker. Parte terza.

Qui i corpi embrionali umani vengono coltivati in piastre di coltura non aderenti. Utilizzando una pipetta, raggruppiamo tutti i corpi embrionali il più vicino possibile per trasferirli in una provetta conica da 15 millilitri. Gli EBS vengono raccolti con cura e trasferiti nel tubo.

È importante raccogliere tutti gli ebs poiché non c'è una grande quantità di materiale Dopo che gli EBS sono stati travasati, il terreno di coltura viene accuratamente scartato. Dovresti essere in grado di vedere il pellet sul fondo del tubo. Ora possiamo procedere alla procedura di fissaggio.

L'EBS sarà fissato in soluzione aldeidica paraforma al 4% in PBS o soluzione salina tamponata con fosfato. È importante risospendere il pellet con una soluzione di PFA. Gli EBS vengono quindi fissati in soluzione di fissazione per 30 minuti.

Dopo il fissaggio, la soluzione di PFA viene accuratamente rimossa. Facendo attenzione a evitare che Resus sospenda l'EBS e lo sostituisca con una soluzione di saccarosio al 10% in PBS per avviare la crioprotezione dell'EBS, il materiale viene conservato per 30 minuti in questa soluzione. Successivamente, rimuoviamo con cura la soluzione di saccarosio al 10% e risospendiamo l'EBS in una soluzione di saccarosio al 20%.

Ancora una volta, gli EBS vengono conservati per 30 minuti in questa soluzione. Infine, la soluzione di saccarosio al 20% viene rimossa e sostituita da una soluzione di saccarosio al 30% in PBS dove viene conservata per altri 30 minuti. Ora possiamo procedere all'orientamento e al blocco di ebs.

Nel nostro laboratorio, utilizziamo gusci di capsule vuote come stampi. Per il blocco dell'ebs, è importante rivestire le pareti interne della punta con una soluzione di saccarosio prima di raccogliere l'ebs. Ora possiamo raccogliere con cura gli EBS e aspettare che decantino sul fondo della punta.

Successivamente, gli EBS vengono posizionati al centro del blocco. Questa dovrebbe essere la posizione finale di EBS all'interno del blocco. Con l'aiuto di uno stereomicroscopio e di una punta fine, raccogliamo e scarichiamo la maggior quantità possibile di soluzione di saccarosio.

Facendo sempre attenzione a non raccogliere gli ebs. Utilizzando un ago con la punta leggermente piegata, tutti gli EBS vengono posizionati al centro del blocco. Infine, la soluzione di saccarosio rimanente viene raccolta con pezzi di carta da filtro.

La posizione specifica dell'EBS all'interno del blocco è molto importante per ottenere fette di buona qualità. Ecco un esempio di cattivo posizionamento dell'EB all'interno della scocca. Dopo il posizionamento dell'EBS e la rimozione della soluzione di saccarosio, il guscio viene riempito con OCT a partire dai bordi, facendo sempre attenzione ad evitare che il Resus sospenda l'ebs.

Le bolle rimanenti vengono rimosse con una pipetta e i gusci vengono agitati per 15 minuti. Dopo l'agitazione. Il blocco OCT è congelato in ghiaccio secco.

A questo punto, è possibile conservare il blocco avvolto in un foglio di alluminio a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi o procedere al criostato Parte quarta, Taglio. Per realizzare le sezioni criogeniche, avrai bisogno di una lama monouso o permanente, OCT e vetrini in polietilene L lisina. Il blocco OCT viene rimosso dal congelatore e conservato all'interno del criostato fino a quando non raggiunge meno 20 gradi Celsius.

Il blocco viene quindi posizionato sul supporto e allineato parallelamente al bordo della lama. I campioni di EB sono molto più piccoli della maggior parte degli altri campioni di tessuto, quindi è molto importante essere sicuri che l'intera superficie del blocco tocchi la lama allo stesso tempo, riducendo così al minimo la perdita di materiale. Dopo essere stato posizionato, il blocco viene tagliato in fette di 10 micrometri, che vengono raccolte direttamente sui vetrini.

I vetrini possono essere conservati, preferibilmente a meno 70 gradi Celsius, o possono essere utilizzati lo stesso giorno. Il materiale può essere colorato per l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza. Conclusione. Il metodo qui descritto fornisce un protocollo ragionevolmente economico e facile da seguire per ottenere sezioni sottili di criostato di corpi embrionali sviluppati da linee di cellule staminali umane H nove o US P one di topo.

Le sezioni criogeniche risultanti possono essere utilizzate in un'ampia varietà di procedure al fine di analizzare l'espressione proteica o la morfologia dell'EB.