Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Ciao, mi chiamo Rick Pasqua, studente del laboratorio di Ingegneria delle Cellule Staminali presso il Dipartimento di Scienze Chimiche e della Vita della Virginia Commonwealth University. In questo video, mostrerò come il nostro laboratorio utilizzi un apparecchio STO per centrifugazione economico e autocostruito per creare un monocstrato osservabile di cellule staminali pluripotenti umane, al fine di quantificare i marcatori della superficie cellulare. Poiché molti protocolli IMMUNOCITOCIMICI sono adattati per cellule PSC umane coltivate in camere da coltura sotto forma di colonie, possono sorgere problemi nella caratterizzazione dell'espressione dei biomarcatori a livello cellulare individuale.

Il fatto di avere le cellule in un monostrato facilita non solo l'analisi visiva di queste, ma possibilmente anche la quantificazione della loro espressione; l'apparato sinus spin che i nostri laboratori utilizzano può essere costruito con materiali reperibili nella maggior parte dei laboratori, richiede solo un piccolo campione di cellule e non necessita di alcun tipo di reagente specifico. E cosa più importante, è in grado di riprodurre in modo affidabile una distribuzione di cellule singole per l'osservazione. Ecco alcune delle cose necessarie per costruire l'apparato per la citosina.

Slide di plastica, poiché queste non devono necessariamente essere pulite, è possibile utilizzare vecchie slide con camera, se lo si desidera. Slide di vetro pre-pulite. Queste devono essere pulite perché qui verrà creata la monocellulare.

Carta da filtro, qualsiasi tipo va bene, e punte per micropipetta. Il nostro laboratorio utilizza punte da 1 a 10 microlitri prima che la costruzione possa iniziare. È necessario praticare prima dei fori nelle lamelle di plastica.

Questo può essere eseguito utilizzando un trapano a colonna. Il diametro dei fori dipende dalle dimensioni della punta della micropipetta e deve corrispondere circa alla larghezza della sezione più larga della punta utilizzata per una micropipetta standard da uno a dieci microlitri. Tale valore dovrebbe aggirarsi intorno ai sette millimetri.

La quantità di fori che create nelle diapositive di plastica dipende interamente dall'uso previsto. Per la colorazione immunoistochimica nel nostro laboratorio, ad esempio, utilizziamo solitamente due fori: uno per la colorazione positiva e l'altro per il controllo negativo dello sfondo. Queste diapositive possono essere riutilizzate un numero indefinito di volte.

Per la carta da filtro, tagliare semplicemente un pezzo delle stesse dimensioni della lamina di plastica. Utilizzare i fori della lamina come riferimento per realizzare i fori sulla carta da filtro. La dimensione del foro sulla carta da filtro deve essere sufficientemente ampia da permettere al beccuccio della micropipetta di inserirsi saldamente, come mostrato qui.

Successivamente, dobbiamo ritagliare il numero appropriato di punte per micropipetta, una per ogni foro, lunghe circa la metà della punta stessa. Queste fungeranno da base per il vetrino, nel punto in cui verrà creata la monocellulare. In seguito, il filtro di carta verrà posizionato sopra questa base.

La carta da filtro servirà ad assorbire qualsiasi eccesso di mezzo dalla sospensione colorata. Successivamente, verrà posizionata sopra la lamina di plastica, che fungerà da supporto solido per l'apparato. Quindi, si potrà sigillare su tutti e quattro i lati con del comune nastro adesivo domestico.

Infine, le punte intere delle micropipette vengono inserite nelle estremità tagliate dell'apparato. Questo sarà il punto in cui verranno posizionati i campioni cellulari dopo la colorazione in sospensione. Potrebbe inoltre essere utile segnare inizialmente la posizione delle estremità tagliate sul vetrino per un riconoscimento più agevole.

Il protocollo di colorazione in sospensione immunochemica utilizzato nel nostro laboratorio prevede innanzitutto il recupero delle cellule staminali sotto forma di sospensione monocellulare, generalmente ottenuta mediante digestione enzimatica con tripsina o con tamponi di dissociazione cellulare a base di EDTA non enzimatici. Le cellule vengono quindi trasferite in provette microcentrifuga da uno o due ml contenenti il loro mezzo di crescita standard. Successivamente, vengono centrifugate a 200 G per quattro minuti.

La stessa velocità di centrifugazione verrà utilizzata per tutti i successivi passaggi di lavaggio e di centrifugazione. Il mezzo viene quindi aspirato manualmente; prestare particolare attenzione durante l'aspirazione per assicurarsi che il pellet cellulare rimanga indisturbato. Successivamente, il pellet viene lavato due volte con un ml di PBS, centrifugando e aspirando ogni volta.

Il passaggio successivo prevede la fissazione delle cellule utilizzando reagenti di formaldeide al 4% o PFA necessari per preparare questa soluzione o elencati nella relativa descrizione allegata a questo video. Le cellule vengono incubate nella soluzione di formaldeide al 4% e lasciate a temperatura ambiente per 10 minuti. Si raccomanda di eseguire questo passaggio prima della sospensione extracellulare e della colorazione per l'utilizzo dell'apparecchio citospin.

Successivamente, le cellule vengono lavate due volte con PBS per rimuovere eventuali tracce di PFA. Le cellule devono quindi essere bloccate per prevenire una colorazione non specifica. Dopo i lavaggi con PBS del passaggio precedente, aspirare il liquido di lavaggio e aggiungere un ml di soluzione bloccante.

Lasciare quindi a temperatura ambiente per circa 45 minuti. Mentre si attende che la soluzione di blocco sia pronta, è possibile preparare l'anticorpo primario diluendolo nel rapporto di diluizione raccomandato e nella soluzione di blocco. Conservare questa soluzione a quattro gradi Celsius.

Dopo che le cellule sono state nella soluzione di blocco per circa 45 minuti, centrifugare e aspirare questa soluzione, quindi risospendere le cellule nella soluzione di anticorpo primario. A scopo di rilevazione del legame non specifico e come controllo del fondo, è preferibile mantenere almeno un campione come negativo, al quale non viene applicato alcun anticorpo primario e che viene semplicemente risospeso in PBS.

Tutti i campioni vengono lasciati a temperatura ambiente per circa un'ora. Se desiderato, le cellule fissate possono essere lasciate in sospensione nella soluzione dell'anticorpo primario durante la notte e lavate due volte con la soluzione di blocco. La soluzione dell'anticorpo secondario può essere preparata mentre si esegue il lavaggio.

Gli anticorpi secondari sono generalmente sensibili alla luce, quindi, se possibile, attenuare le luci del laboratorio e coprire i contenitori utilizzati con carta d'alluminio, al fine di prevenire lo sbiancamento della fluorescenza. I reagenti antifa possono essere inclusi nel protocollo, ma bisogna fare attenzione nel loro utilizzo poiché possono causare un fondo elevato, come avviene con l'anticorpo primario diluito alla concentrazione raccomandata nella soluzione di blocco. Applicare un vis a tutti i campioni, indipendentemente dall'aggiunta o meno dell'anticorpo primario, una volta completato il lavaggio.

Lasciare in riposo in un'area buia, ad esempio all'interno di un barattolo, per circa un'ora. Lavare le cellule due volte con un ml di soluzione bloccante. A questo punto, le cellule dovrebbero essere pronte per la colorazione nucleare con il colorante DPI.

Preparare inizialmente la soluzione di DPI in un rapporto di diluizione 1:10.000 in PBS, lavare le cellule una volta con un ml di PBS, quindi risospendere in DPI e lasciare in incubazione a temperatura ambiente per circa cinque-dieci minuti. Poiché DAPI, come l'anticorpo secondario, è sensibile alla luce, effettuare le opportune precauzioni per evitare lo sbiancamento della fluorescenza. Lavare una volta con un ml di PBS e infine risospendere.

Sospendere nuovamente in un ml di PBS. Il campione dovrebbe a questo punto essere pronto per l'uso con un apparecchio cyto spin. Inserire al massimo 100 microlitri della soluzione di cellule singole nella parte superiore dei puntali per micropipetta.

È tuttavia consigliata una quantità inferiore per evitare traboccamenti o gocciolamenti inutili. Successivamente, posizionare un apparecchio cyto spin e il contrappeso in una centrifuga da banco e centrifugare a 1000 giri al minuto per quattro minuti. Dopo, smontare con cura l'apparecchio cyto spin in modo da ridurre al minimo il rischio di distacco delle cellule dal vetrino.

Verificare che lo standing sia avvenuto al microscopio a fluorescenza prima del montaggio. Queste sono immagini di un monocstrato di cellule BG one V marcate con quattro marcatori di superficie cellulare SSCA ottenute dall'apparato citospin. Si noti quanto isolate siano le cellule l'una dall'altra, rendendo possibile l'osservazione e la registrazione a livello di singola cellula.

Quello che rende vantaggioso questo protocollo è la sua capacità di riprodurre un monostrato cellulare fattibile, economico ed facilmente adattabile per qualsiasi analisi di routine delle colture di cellule staminali. Pertanto, spero che troviate utile questo video e il protocollo qui descritto per la vostra ricerca.