Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Ciao, mi chiamo Rick Pasqua, studente del Laboratorio di Ingegneria delle Cellule Staminali qui nel Dipartimento di Chimica e Scienze della Vita della Virginia Commonwealth University. In questo video, dimostrerò come il nostro laboratorio utilizza un apparato di spin STO economico e autocostruito per creare un monostrato osservabile di cellule staminali pluripotenti umane per la quantificazione dei marcatori della superficie cellulare. Dato che molti protocolli IMMUNOCHIMICI sono adattati per le PSC coltivate in vetrini da camera come colonie, possono sorgere problemi nella caratterizzazione dell'espressione dei biomarcatori a livello di singola cellula.

Avere le cellule in un monostrato aiuta non solo nell'analisi visiva di queste, ma forse anche nel quantificare la loro espressione, l'apparato di spin sinusale utilizzato dai nostri laboratori può essere costruito utilizzando materiali trovati nella maggior parte dei laboratori richiede solo un piccolo campione di cellule e non necessita di alcun tipo di reagente specifico. E, cosa più importante, è in grado di riprodurre in modo affidabile una serie di singole cellule per l'osservazione. Ecco alcune delle cose di cui avrai bisogno per costruire l'apparato di citosina.

Vetrini in plastica, poiché questi non devono necessariamente essere puliti, puoi utilizzare vecchi vetrini da camera se lo desideri. Vetrini pre-puliti. Questi devono essere puliti perché è qui che si crea il monostrato di celle.

Carta da filtro, qualsiasi tipo dovrebbe fare e micro puntali per pipette. Le punte da uno a 10 microlitri sono ciò che il nostro laboratorio utilizza prima che la costruzione possa iniziare. I fori devono essere prima praticati nelle guide di plastica.

Questo può essere fatto usando un trapano a colonna. Il diametro dei fori dipende dalle dimensioni del puntale della micropipetta e deve essere all'incirca della larghezza della sezione più larga del puntale utilizzato per un puntale per micropipetta standard da uno a 10. Questo dovrebbe essere di circa sette millimetri.

La quantità di fori che crei nelle guide di plastica dipende completamente dall'uso che ne intendi. Per la colorazione immunochimica del nostro laboratorio, ad esempio, di solito utilizziamo due fori, uno per la colorazione positiva e l'altro per il controllo di fondo negativo. Queste diapositive possono essere riutilizzate per un numero indefinito di volte.

Per la carta da filtro, è sufficiente ritagliarne un pezzo secondo i parametri del vetrino di plastica. Utilizzare i fori della diapositiva come riferimento per praticare fori sulla carta da filtro. La dimensione del foro sulla carta da filtro deve essere sufficientemente grande da consentire al puntale della micropipetta di adattarsi perfettamente, come mostrato qui.

Dobbiamo quindi ritagliare il numero appropriato di puntali per micropipette, uno per ogni foro a circa la metà della sua lunghezza. Questo servirà come base del vetrino per il quale verrà creato il monostrato cellulare. Successivamente, la carta da filtro verrà messa sopra di essa.

La carta da filtro servirà ad assorbire il mezzo in eccesso dalla colorazione della sospensione. Questo sarà poi completato dallo scivolo in plastica che fungerà da solido supporto per gli apparecchi. Questo può quindi essere sigillato su tutti e quattro i lati con un normale nastro adesivo per uso domestico.

Infine, le punte intere della micropipetta vengono inserite nelle punte tagliate dell'apparato. Questo sarà il punto in cui verranno inseriti i campioni cellulari dopo la colorazione in sospensione. Potrebbe anche essere utile contrassegnare inizialmente il punto del vetrino in cui si trovano le punte tagliate per un riconoscimento più comodo.

Il protocollo di colorazione immunochimica in sospensione utilizzato dal nostro laboratorio prevede la prima raccolta di cellule staminali in una singola sospensione cellulare, solitamente effettuata mediante enzimatica, utilizzando tamponi di dissociazione cellulare basati su tripsina o EDTA non enzimatico. Le cellule vengono quindi trasferite su un ml di provette da microcentrifuga da due ml e il loro terreno di coltura standard. Questi vengono poi centrifugati a 200 Gs per quattro minuti.

La stessa velocità di centrifugazione verrà utilizzata per tutte le successive fasi di lavaggio e centrifuga. Il fluido viene quindi aspirato manualmente, prestare particolare attenzione durante l'aspirazione per assicurarsi che il pellet della cella venga lasciato indisturbato. Questo viene quindi lavato con un ml di PBS due volte, girando verso il basso e aspirando ogni volta.

Il passaggio successivo prevede il fissaggio delle cellule utilizzando il 4% di formaldeide al paio o i reagenti PFA necessari per realizzare questo o elencati nell'articolo di accompagnamento per questo video. Le cellule vengono incubate nella soluzione di formaldeide al 4% di coppia e lasciate a temperatura ambiente per 10 minuti. Si raccomanda di eseguire questo passaggio prima della sospensione ex extracellulare, colorando per l'uso dell'apparato di cyto spin.

Successivamente, le cellule vengono lavate due volte con PBS per rimuovere le tracce di PFA. La cella deve quindi essere bloccata per evitare macchie non specifiche. Dopo i lavaggi PBS al passaggio precedente, aspirare il lavaggio e aggiungere un ml di soluzione bloccante.

Questo va poi lasciato a temperatura ambiente per circa 45 minuti. In attesa della soluzione bloccante, è possibile preparare l'anticorpo primario diluendolo alla diluizione e alla soluzione bloccante raccomandata. Conservalo a quattro gradi Celsius.

Dopo che le cellule sono state nella soluzione bloccante per circa 45 minuti, centrifugare e aspirare e sospenderle nuovamente nella soluzione di anticorpi primari. Ai fini dell'individuazione del legame non specifico e del controllo in background, è meglio mantenere almeno un campione come negativo. Non sono stati applicati anticorpi primari ed è semplicemente sospeso in PBS.

Tutti i campioni vengono lasciati a temperatura ambiente per circa un'ora. Se lo si desidera, le cellule fissate possono essere lasciate in sospensione nella soluzione di anticorpi primari per una notte e lavate due volte con una soluzione bloccante. La soluzione di anticorpi secondari può essere preparata durante il lavaggio.

Gli anticorpi secondari sono generalmente sensibili alla luce, quindi se possibile abbassare le luci di laboratorio e coprire i contenitori utilizzati con un foglio di alluminio, questo viene fatto per prevenire lo sbiancamento della fluorescenza. I reagenti antifa possono essere incorporati nel protocollo, ma è necessario prestare attenzione al loro uso in quanto può comportare un background più elevato come l'anticorpo primario diluito alla concentrazione raccomandata in soluzione bloccante. Applicare una vis a tutti i campioni, indipendentemente dal fatto che la primaria sia stata aggiunta o meno dopo il completamento del lavaggio.

Lasciate riposare in una zona buia come all'interno di un barattolo per circa un'ora. Lavare due volte le cellule con un ml di soluzione bloccante. La cella dovrebbe ora essere pronta per la colorazione nucleare con colorante DPI.

Preparare inizialmente la soluzione DPI a una diluizione da uno a 10.000 in PBS, lavare le cellule in un ml di PBS una volta, quindi risus, sospendere in dpi e lasciare riposare a temperatura ambiente per circa 5-10 minuti. Come l'anticorpo secondario, DAPI è sensibile alla luce, quindi apportare le modifiche necessarie per prevenire la fluorescenza e lo sbiancamento. Lavare una volta con un ml di PBS e infine, reus.

Sospendere nuovamente in un ml di PBS. Questo dovrebbe quindi essere pronto per l'uso con un apparecchio di rotazione cyto. Inserire optim un massimo di 100 microlitri della soluzione a cellula singola nella parte superiore dei puntali per micropipette.

Si consiglia tuttavia una quantità inferiore per evitare inutili trabocchi o gocciolamenti. Dopo. Posizionare un apparecchio di centrifuga cyto e il contrappeso in una centrifuga da tavolo e centrifugare a 1000 giri/min per quattro minuti. Successivamente, smontare con cura l'apparato di cyto spin in modo da ridurre al minimo la possibilità di spostamento delle cellule dal vetrino.

Verificare che la posizione eretta sia avvenuta al microscopio a fluorescenza prima del montaggio. Queste sono immagini scattate di un monostrato di una cellula BG V colorata con marcatori di superficie SSCA a quattro cellule dall'apparato di spin cito. Si noti come le cellule siano isolate l'una dall'altra, rendendo possibili le osservazioni e la registrazione di singole cellule.

L'aspetto positivo di questo protocollo è che è in grado di riprodurre cellule monostrato fattibili, economiche e facilmente adattabili per qualsiasi analisi di routine di colture di cellule staminali. Quindi, con questo, spero che tu disegni questo video e trovi il protocollo d'uso nella tua ricerca.