Name: Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri l'analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un apparato cytospin autocostruito. Questo metodo economico crea un monostrato cellulare per l'osservazione e la quantificazione affidabile dei marcatori di superficie.

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Finanziamento parziale per questo lavoro è stato fornito da NSF-CARRIERA 0744556 (Rao) e una borsa di studio attraverso il VCU-HHMI Scienze dell&#39;educazione e della Research Program (Pascual).

Parte 1: Sospensione colorazione immunocitochimica <ol><li> Le cellule sono raccolte in una sospensione di cellule singole. </li><li> Le cellule sono poi trasferiti in 1,5-microcentrifuga da 2 ml tubi e centrifugati a 200g per 4 minuti. </li><li> Le cellule sono lavate aspirando fuori surnatante, risospesi in 1 ml di PBS - (senza Mg 2 + e Ca 2 +) e poi centrifugati nuovamente a 200g per 4 minuti. Questo dovrebbe essere fatto due volte. </li><li> Dopo il lavaggio, le cellule vengono poi fissati dalla ri-sospensione in 1 ml di paraformaldeide 4% (PFA) a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Le cellule sono lavate di nuovo per due volte con 1 ml di PBS -. </li><li> Dopo il lavaggio, le cellule blocco per ri-sospensione in 1 ml di soluzione di blocco (6% serum/94% PBS -). Incubare questi a temperatura ambiente per 45 minuti. </li><li> Dopo, centrifugare le provette a 200 g per 4 minuti e aspirare fuori Solution Block. Risospendere le cellule in 1 ml della soluzione di anticorpo primario (fatta con la soluzione al blocco di diluizione consigliato). Le celle possono essere incubate a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C per una notte prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Le cellule vengono poi lavate due volte con 1 ml di soluzione di blocco. </li><li> Dopo, risospendere le cellule in 1 ml di soluzione di anticorpo secondario (fatta con la soluzione al blocco di diluizione consigliato) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, le cellule devono poi essere lavate di nuovo due volte con 1 ml di soluzione di blocco. </li><li> Dopo il lavaggio con la soluzione di blocco, lavare le cellule di nuovo con 1 ml di PBS -. </li><li> Dopo i lavaggi vari, risospendere le cellule in 1 ml di DAPI nucleare macchia (1:10.000 diluizione del DAPI in PBS -) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Dopo 5 minuti, centrifugare le provette a 200 g per 4 minuti. Aspirare la soluzione nucleare DAPI macchia e risospendere le cellule in 1 ml di PBS -. </li></ol> Incorporazione di hPSCs nelle diapositive generate attraverso apparato cytospin: parte 2 <ol><li> Slitte di plastica vengono preparati facendo la quantità desiderata di fori con un trapano a colonna. Il diametro deve essere al massimo 1 millimetro più grande del diametro massimo della punta micropipetta (s) da utilizzare. </li><li> Carta da filtro viene tagliata ai parametri del vetrino di plastica con le forbici. </li><li> I fori vengono poi realizzati in carta da filtro. La dimensione del foro (s) deve essere abbastanza grande che la punta micropipetta (s) si adatta snuggly attraverso di essa. </li><li> Dopo, una delle diapositive plastica preparato è posizionato sulla parte superiore e una lastra di vetro in posto al fondo della carta filtro taglia (Figura 1). Gli strati sono fissati con nastro adesivo. </li><li> Un massimo di 100μL (a seconda della densità monostrato desiderato) di sospensione cellulare macchiato da parte 1 viene posto nella parte superiore della punta micropipetta (s). </li><li> Se necessario, l&#39;apparato con una soluzione di cella può essere pesato e un contro-bilanciamento di peso simile creato. </li><li> L&#39;apparato cytospin e contro-equilibrio può vengono quindi inseriti in una centrifuga desktop e centrifugato a 200g per 4 minuti. </li><li> Dopo la centrifugazione, l&#39;apparato cytospin viene accuratamente smontata in un modo che doesnt rimuovere le cellule dal vetrino. </li><li> Se necessario, l&#39;eccesso di PBS circostanti - dalla parte di vetro in aspirato fuori. </li><li> Le celle possono poi essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza per verificare se il monostrato cellulare desiderato è stato raggiunto. </li></ol> Parte 3: scivoli di montaggio <ol><li> Una goccia del supporto di montaggio desiderata viene inserito direttamente nel centro di ogni area contenente le cellule. </li><li> Dopo, una scivolata coperchio è abbassato delicatamente sul diapositive cercando di evitare bolle d&#39;aria, se possibile. </li><li> Eccesso di mezzi di montaggio viene quindi rimosso da diapositive. </li><li> Dopo, i lati del coprioggetto sono sigillati con smalto. </li><li> Le slide possono essere conservati in un deposito scuro finché i risultati sono stati osservati e documentati. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ai fini del nostro laboratorio, un piatto di 35 mm di colture di cellule staminali coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) è assegnato per la procedura di colorazione immunocitochimica per l&#39;utilizzo con l&#39;apparecchio cytospin. Le cellule sono poi raccolti tramite enzimatica passaging, eliminando quanto più dello strato MEF possibile, in una cella singola sospensione. Se è più efficace isolamento delle cellule staminali dallo strato MEF si desidera, le colonie possono essere raccolte manualmente poi ...

<table><tbody><tr><td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Materiale per vetrini di plastica riutilizzati</td></tr><tr><td>Vetrini Microscopici Superfrost/Plus Precleaned</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Punte Filtranti 0.1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Vetrocopri Microscopico</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Serum di capra normale</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti-SSEA-4 di topo</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Anticorpo primario per la colorazione SSEA-4</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti-SSEA-3 di ratto</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Anticorpo primario per la colorazione SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG di capra anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Anticorpo secondario per la colorazione SSEA-4</td></tr><tr><td>IgG di capra anti-ratto marcato con Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Anticorpo secondario per la colorazione SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, cloridrato diidrico</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un self-made apparato cytospin

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che includono cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) sono fonti di cellule eccitante a causa della loro illimitata capacità di auto-rinnovamento e il loro potenziale di differenziarsi in tipi cellulari diversi. Lo stato pluripotente di hPSCs è tipicamente valutata mediante tecniche come qPCR, immunocitochimica, e da altri<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt; Strategie di differenziazione in tipi di cellule diverse. Tra questi, tecniche immunocitochimiche sono state sviluppate per la caratterizzazione di routine dello stato indifferenziato di hPSCs sulla base di analisi di biomarcatori candidato intracellulare e superficie cellulare. Dato il fatto che hPSCs crescere come colonie, i problemi sorgono nel quantificare l&#39;espressione di questi marcatori a livello cellulare individuali su base di routine. Analisi di citometria a flusso servire per risolvere questo problema, ma richiedono numero di cellule e l&#39;utilizzo di reagenti che non sono normalmente favorevole per la valutazione di routine di controllo di qualità di colture hPSC. Così, lo sviluppo di mezzi pratici e riproducibile di creare campioni di cellule monostrato con integrità preservata per la valutazione marcatore ha molti vantaggi nel campo della ricerca sulle cellule staminali. Questo benefici notevolmente l&#39;analisi immunocitochimica perché le cellule individuali dal monostrato può essere facilmente osservato e quantificato per l&#39;espressione di marcatori specifici. Verso questo obiettivo, un self-made cytospin apparato è stato costruito e ottimizzato per l&#39;utilizzo con colorazione immunocitochimica. Due marcatori di superficie cellulare (SSEA3/SSEA4) espressione sono stati analizzati in una linea di cellule staminali variante BG01 ai fini di questo protocollo.

Sospensione colorazione immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la superficie cellulare marcatori (SSEA-3/SSEA-4) è stato raggiunto sulla base di utilizzo di un self-made apparato cytospin per creare un monostrato di cellule per l&#39;osservazione e la quantificazione.

Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), che comprendono le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), sono entusiasmanti cellule...

Ciao, mi chiamo Rick Pasqua, studente del laboratorio di Ingegneria delle Cellule Staminali presso il Dipartimento di Scienze Chimiche e della Vita della Virginia Commonwealth University. In questo video, mostrerò come il nostro laboratorio utilizzi un apparecchio STO per centrifugazione economico e autocostruito per creare un monocstrato osservabile di cellule staminali pluripotenti umane, al fine di quantificare i marcatori della superficie cellulare. Poiché molti protocolli IMMUNOCITOCIMICI sono adattati per cellule PSC umane coltivate in camere da coltura sotto forma di colonie, possono sorgere problemi nella caratterizzazione dell'espressione dei biomarcatori a livello cellulare individuale.Il fatto di avere le cellule in un monostrato facilita non solo l'analisi visiva di queste, ma possibilmente anche la quantificazione della loro espressione; l'apparato sinus spin che i nostri laboratori utilizzano può essere costruito con materiali reperibili nella maggior parte dei laboratori, richiede solo un piccolo campione di cellule e non necessita di alcun tipo di reagente specifico. E cosa più importante, è in grado di riprodurre in modo affidabile una distribuzione di cellule sing

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Immunocitochimica è un potente metodo per determinare la presenza, localizzazione subcellulare e l'abbondanza relativa di un antigene di interesse in cellule in coltura. Questo protocollo presenta un facile da seguire serie di passaggi che permettono di conservare gli anticorpi e ottenere il massimo della propria colorazione.

Immunocitochimica: cellule staminali neuronali

Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.

Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali

Questo video mostra un test per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Le iPSC umane sono indotte a formare corpi embrioidi (EB). Gli EB vengono coltivati su un'impalcatura polimerica utilizzando un mezzo di induzione, promuovendo la differenziazione in cellule staminali neurali, cellule progenitrici e neuroni immaturi. Infine, gli EB vengono incorporati in una matrice e trasferiti in un mezzo di mantenimento per la formazione di organoidi cerebrali.

Generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficiente per propagare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana in un piatto rivestito di gelatina senza ulteriori supplementazioni esogene o substrati sintetici specifici per hPSC.

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

La caratterizzazione regolare delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per accertare il mantenimento del loro stato pluripotente, è un passo importante prima che queste cellule vengano utilizzate per altre applicazioni. Qui descriviamo un metodo per la propagazione su piccola scala di iPSC umane specificamente progettato per consentire la loro facile e routinaria caratterizzazione tramite immunocitochimica.

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Scopri l'analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un apparato cytospin autocostruito. Questo metodo economico crea un monostrato cellulare per l'osservazione e la quantificazione affidabile dei marcatori di superficie.

Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

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