Name: Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Impara la tecnica Western blotting per l'analisi proteica biochimica utilizzando campioni di tessuto. Questo metodo dimostra la preparazione dei campioni, l'elettroforesi su gel e il trasferimento su membrana per rilevare proteine specifiche con elevata sensibilità.

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1. Preparazione del campione Il primo passo nella Western blotting è la preparazione del campione. Per preparare i campioni per l&#39;esecuzione di un gel di cellule e tessuti devono essere lisate per rilasciare le proteine ​​di interesse. <ul><li> Un comodo, pronto a utilizzare il reagente che è versatile e facile da usare per l&#39;estrazione delle proteine ​​solubili è CytoBuster o PhosphoSafe. I buffer di estrazione contengono detergenti ottimizzate per l&#39;estrazione efficiente di proteine ​​solubili dalle cellule dei mammiferi e insetti. Il dolce, non ionici composizione del reagente di estrazione proteine ​​CytoBuster consente l&#39;isolamento di funzionalmente endogena attiva o proteine ​​espresse senza la necessità di un trattamento secondario come sonicazione o di gelo / disgelo. PhoshoSafe ha il vantaggio di contenere quattro inibitori della fosfatasi. <ol><li> Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a bassa velocità (ad esempio 5 min a 2500 xg), scolare il pellet bene. </li><li> Risospendere le cellule in reagente di estrazione delle proteine ​​CytoBuster utilizzando 150 microlitri per 10 6 cellule (quantità ottimale di reagente di estrazione proteine ​​CytoBuster possono variare in base alla dimensione della cella). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Trasferire in un tubo adatto e girare per 5 min a 16000 xga 4 ° C. </li><li> Trasferimento cancellato surnatante (estratto cellulare) in una nuova provetta e procedere con l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Per l&#39;estrazione di proteine ​​specializzate, si consiglia di utilizzare il nostro Kit ProteoExtract di alta qualità. EMD ha più di una dozzina di kit per l&#39;isolamento dei mitocondri, estrazione proteomica subcellulare, l&#39;estrazione di proteine ​​transmembrana, e molti altri. Visitate la nostra pagina di destinazione occidentale blot per ulteriori dettagli. </li><li> EMD vende anche una grande varietà di proteasi e fosfatasi set cocktail inibitore. Non appena si verifica la lisi, proteolisi, defosforilazione e denaturazione iniziare. Questi eventi possono essere rallentato enormemente se i campioni sono conservati in ghiaccio o a 4 ° C in ogni momento e gli inibitori appropriati vengono aggiunti allo stato fresco al tampone di lisi. Visitate la nostra pagina di destinazione occidentale blot per ulteriori dettagli. </li></ul> 2. SDS-PAGE Il secondo passo Western blotting è la separazione delle proteine. Le proteine ​​sono separate in base al peso molecolare. <ul><li> Potete fare i vostri gel propria pagina, ma useremo un normale pre-cast gel. <ol><li> Dopo aver preparato il campione, si è pronti per determinare la concentrazione di proteine. EMD ha due kit per questo per misurare la concentrazione, una è il non-interferenti kit di analisi delle proteine ​​e l&#39;altro è il kit BCA Protein Assay. </li><li> Una volta che la concentrazione di proteine ​​è valutata siamo pronti a preparare il nostro campione per il caricamento del gel. Gli anticorpi riconoscono tipicamente una piccola porzione della proteina di interesse (denominato epitopo) e questo dominio può soggiornare nel conformazione 3D della proteina. Per abilitare l&#39;accesso degli anticorpi a questa parte, è necessario dispiegare la proteina. </li><li> Per denaturare, utilizzare un tampone di caricamento con la anionici denaturazione dodecil solfato di sodio detergente (SDS), e fate bollire il composto a 95-100 ° C per 5 minuti. Un buffer di caricamento facile e comodo da usare è Sample Buffer 4X. </li></ol></li><li> Caricare il vicolo prima bene con Marker Proteine ​​Trail Mix. Questo indicatore ha tre fasce di riferimento che permettono di monitorare l&#39;elettroforesi. Quando il gel è macchiato, 10 sono visibili le bande che vanno 10-225 kDa. </li><li> Riempire l&#39;apparecchio con la gestione del buffer di elettroforesi. Per i gel PAGINA, questo è di solito 1X Tris-glicina. Per le ricette di buffer dettagliate, visitare la pagina Western blotting. EMD offre alta qualità tamponi reagenti con la nostra linea di prodotti chimici OmniPur. Attivare il gel a 220V per 1 ora. </li><li> Una volta che le proteine ​​si sono separati, macchia il gel con Coomassie blu per garantire le proteine ​​sono migrati in modo uniforme e uniformemente. RAPIDstain è un ultra-sensibile macchia che è pronto per l&#39;uso. Decolorazione non è richiesto. </li></ul> 3. Proteina di trasferimento Proprio come le proteine ​​con una carica elettrica può essere indotto a viaggiare attraverso un gel in un campo elettrico, in modo le proteine ​​possono essere trasferiti in un campo elettrico dal gel su una membrana, essendo o PVDF o nitrocellulosa. <ul><li> Oggi faremo un trasferimento bagnato. Nel trasferimento bagnato, il gel e la membrana sono inseriti tra spugna e carta (spugna / carta / gel / membrana / carta / spugna) e tutti sono serrate insieme dopo garantendo l&#39;assenza di bolle d&#39;aria si sono formate tra il gel e la membrana. Il panino è immerso in buffer di trasferimento a cui è applicato un campo elettrico. Le proteine ​​cariche negativamente viaggio verso l&#39;elettrodo di carica positiva, ma la membrana li ferma, li lega, e impedisce loro di continuare. </li><li> Due tipi di membrane sono disponibili: nitrocellulosa e PVDF. Entrambi funzionano bene. Oggi useremo PVDF. Membrane PVDF richiedono ammollo in methanol per pochi minuti, seguito da buffer di trasferimento di ghiaccio freddo per 5 minuti. Il gel ha anche bisogno di equilibrare per pochi minuti in buffer di trasferimento ghiacciata. Non farlo può ridurre il gel durante il trasferimento. </li><li> Il buffer per il trasferimento bagnato è 1X Tris-glicina con il 20% di metanolo. Preparazioni di buffer dettagliate sono disponibili sul nostro sito web. </li><li> Una volta completato il trasferimento, è una buona idea per visualizzare le proteine ​​per assicurare anche il trasferimento senza sacche d&#39;aria. Questo può essere fatto facilmente con RedAlert Western Blot Stain. Questa macchia è pronto per l&#39;uso e decolorazione può essere fatto facilmente con l&#39;acqua. </li></ul> 4. Anticorpi e reagenti accessori <ul><li> Il primo passo per fare di sondaggio e di anticorpi contro l&#39;antigene è quello di bloccare la membrana. Bloccando la membrana impedisce legame aspecifico di fondo. </li><li> In entrambi i casi non grassi del latte o BSA può essere utilizzato come soluzione di blocco. Tuttavia, quando si usa fosfo-specifici anticorpi, non è raccomandato l&#39;uso di latte in quanto causerà fondo elevato. </li><li> EMD offre diversi reagenti blocco di alta qualità, tra cui SeaBlock, che è un non-mammiferi agente bloccante e QuickBlocker BLOT, preparato, pronto per l&#39;uso di blocco degli agenti. Abbiamo anche di alta qualità BSA (Frazione V) disponibili. <ol><li> Incubare la membrana 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Lavare tre volte in TBST o PBST dopo l&#39;incubazione. Un modo semplice e conveniente per fare TBST o PBST è quello di utilizzare il nostro compresse (PBS TWEEN compresse / compresse TWEEN TBS) </li></ol></li><li> Una volta che la membrana è stata bloccata, si è pronti per incubare con l&#39;anticorpo primario. EMD ha offerto un portafoglio completo di anticorpi eccezionale con la garanzia migliore di anticorpi nel settore da oltre 30 anni. Ricorda che tutti gli anticorpi EMD, offriamo una completa al 100% senza rischio di garanzia. Acquisto di un anticorpo e usarlo per qualsiasi specificità di specie o applicazione che si desidera. Se l&#39;anticorpo non funziona in modo soddisfacente, si fornirà un credito pieno per essere utilizzato su qualsiasi altro prodotto. Per maggiori dettagli, visitate la nostra pagina web occidentale blotting. <ol><li> Oggi ci sarà incubando il nostro anticorpo primario usando la soluzione di 1 di SignalBoost. SignalBoost è un ottimo prodotto che permette il segnale di essere migliorato in modo significativo. È sufficiente incubare la tua anticorpo primario in Soluzione 1 e incubare per 1 ora o come si farebbe normalmente. Non c&#39;è bisogno di aggiungere ulteriori agenti di blocco. In alternativa, è possibile utilizzare BSA o latte scremato secco come un agente bloccante. </li><li> Lavare con TBST. Facciamo TBST con il ready-to-tablet sciogliere TBST. </li><li> Incubare il tuo anticorpo secondario utilizzando la soluzione 2 di SignalBoost. Incubare l&#39;anticorpo secondario nel tampone di bloccaggio per 1 ora. Lavare la membrana più volte con TBST. </li></ol></li></ul> 5. Rivelazione Per HRP coniugando anticorpi secondari, ECL è tradizionalmente utilizzato. Di un reagente eccellente ECL che offriamo è RapidStep. I vantaggi di RapidStep sono che nessuna mescolanza di luminale o enhancer è richiesto. Basta spruzzare la membrana un paio di volte e sviluppare con x-ray film. RapidStep offre una bassa sensibilità pittogramma così come la luce che emettono fino a 2 ore dopo l&#39;aggiunta del substrato.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Gli autori Anna Eslami e Jesse Lujan sono impiegati da EMD chimici Inc che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

In questo video di presentazione, abbiamo evidenziato i passaggi principali in Western blotting che sono la preparazione del campione, SDS-PAGE, membrana blocco / sondaggio con gli anticorpi, e la rilevazione. Per ogni fase del processo, i protocolli di corretta e reagenti appropriati dovrebbero essere usati per ottenere risultati di alta qualità.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Reagente per l'estrazione delle proteine</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Reagente per l'estrazione</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dosaggio proteico non interferente&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit per saggio proteico BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Buffer campione SDS 4X </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Miscela di frutta secca e snack&amp;#8482; Marcatori proteici</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Proteine&amp;#8211;xtract&amp;#8482; Kit per l'estrazione delle proteine</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Prodotti</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; Colorazione per Western Blot 10X</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reagente, plasma di salmone</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Reagente BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumina, Sierica Bovina, Frattione V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Compresse</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Compresse</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Kit potenziatore della reazione immunitaria</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; Reagente ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting è una tecnica analitica utilizzata per rilevare le proteine ​​specifiche in un dato campione di tessuto omogenato o estratto. Utilizza elettroforesi su gel per separare le proteine ​​nativo o denaturato dalla lunghezza del polipeptide (condizioni di denaturazione) o dalla struttura 3-D della proteina (nativo / non-denaturazione condizioni). Le proteine ​​sono poi trasferiti ad una membrana (solitamente di nitrocellulosa o PVDF), dove viene effettuato il controllo (rilevato) con anticorpi specifici per la proteina bersaglio.

Western blotting è una tecnica analitica utilizzata per rilevare le proteine ​​specifiche in un dato campione di tessuto omogenato o estratto.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Il Western blotting è una tecnica analitica utilizzata per rilevare proteine specifiche in un determinato campione di omogenato o estratto tissutale. Utilizza gel...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la facilità di esecuzione di un immunoblotting quando si utilizzano prodotti adeguati. Dopo la preparazione del campione, le proteine vengono separate in base alla dimensione e successivamente trasferite su una fase solida. Le proteine vengono quindi rivelate mediante anticorpi; l'uso di protocolli corretti e di reagenti di alta qualità ed economici consente di ottenere risultati migliorati nell'immunoblotting.Ciao, sono Jesse Luhan, scienziato R&amp;S di EMD Chemicals a San Diego, in California. EMD è un'affiliata di Merck KGaA di Darmstadt, in Germania. Oggi vi mostreremo una procedura di western blotting.Iniziamo. Il primo passaggio del western blot è la preparazione del campione. Iniziare la preparazione del campione centrifugando le cellule a bassa velocità, ad esempio per cinque minuti a 2.500 ×g.Dopo la centrifugazione, eliminare il sovranatante dai pellet cellulari. Sospendere accuratamente le cellule nel reagente di estrazione proteica CytoBuster, utilizzando 150 microlitri per 10⁶ cellule. Incubare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.Successivamente, centrifugare il campione per cinque minuti a 16.000 ×g a quattro gradi Celsius. Trasferire il SNA chiarificato in una nuova provetta e procedere con l'analisi. Dopo aver determinato la concentrazione proteica del campione, preparare il campione per il caricamento sul gel al fine di denaturare le proteine.Utilizzare un buffer campione contenente un detergente denaturante anionico come il dodecilsolfato di sodio o SDS. Far bollire la miscela a 95-100 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando un gel preconfezionato disponibile in commercio, le proteine possono essere rapidamente separate in base al peso molecolare.Riempire l'apparecchio di elettroforesi con il buffer di corsa, che può essere preparato con reagenti della linea chimica Omni PU. Caricare la prima corsia del pozzetto con il marcatore proteico trail mix. Questo marcatore presenta tre bande di riferimento che permettono il monitoraggio durante l'elettroforesi.Dopo la colorazione del gel, sono visibili 10 bande, con pesi molecolari compresi tra 10 e 225 chilo Dalton. Caricare il campione denaturato nelle rimanenti pozzetti. Eseguire l'elettroforesi a 220 volt per un'ora.Dopo la separazione delle proteine, colorare il gel con blu kumasi per verificare che le proteine si siano migrate in modo uniforme ed equilibrato, utilizzando una colorazione rapida e ultrasensibile, pronta all'uso, senza necessità di DS. Proprio come le proteine con carica elettrica possono essere indotte a migrare attraverso un gel in un campo elettrico, anche le proteine possono essere trasferite in un campo elettrico dal gel a una membrana, come NITROCELLULOSA o PVDF. Quando si utilizzano membrane PVDF, immergere la membrana in metanolo per alcuni minuti, seguito da un'equilibratura in tampone di trasferimento ghiacciato per cinque minuti. Immergere anche il gel per alcuni minuti nel tampone di trasferimento ghiacciato; l'equilibratura impedisce il restringimento del gel durante il trasferimento.Per un trasferimento umido, assemblare un sandwich costituito da gel e membrana tra spugna e carta. Quindi bloccare saldamente l'insieme dopo aver verificato che non si siano formate bolle d'aria tra il gel e la membrana. Immergere il sandwich nel buffer di trasferimento e applicare un campo elettrico.Le proteine cariche negativamente migreranno verso l'elettrodo carico positivamente. La membrana le fermerà, si legherà a esse e ne impedirà l'ulteriore avanzamento. Al termine del trasferimento, visualizzare le proteine per verificare un trasferimento uniforme e l'assenza di sacche d'aria.Questo può essere facilmente eseguito con il colorante per immunoblot di allerta rossa. Questo colorante è pronto all'uso e la decolorazione può essere effettuata facilmente con acqua. Questo è il gel dopo essere stato decolorato mediante lavaggio in acqua; prima che la membrana possa essere sottoposta a prova con l'anticorpo, la membrana viene bloccata.Per evitare il legame non specifico, bloccare la membrana utilizzando reagenti di blocco di alta qualità. Per prevenire un aumento dello sfondo, incubare la membrana in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata, quindi lavare la membrana tre volte in TBST o PBST dopo l'incubazione. Questi tamponi possono essere facilmente e convenientemente preparati utilizzando rispettivamente compresse di TBS tween e compresse di PBS tween.Dopo aver bloccato e lavato la membrana, è possibile incubarla con l'anticorpo primario. Applicare l'anticorpo primario utilizzando la soluzione, uno dei componenti per l'amplificazione del segnale, che consente un notevole potenziamento del segnale stesso. Preparare l'anticorpo primario nella soluzione uno e incubare la membrana per un'ora.Non è necessario aggiungere ulteriori agenti di blocco dopo l'incubazione. Lavare la membrana con TBST. Successivamente, incubare la membrana con l'anticorpo secondario diluito nella soluzione due del signal boost per un'ora.Infine, lavare nuovamente la membrana diverse volte con TBST per la rivelazione di anticorpi secondari coniugati con HRP. La rivelazione degli anticorpi secondari mediante chemiluminescenza migliorata o ECL è tradizionalmente utilizzata in questo passaggio. Si utilizza il reagente ECL passaggio rapido poiché non richiede la miscelazione di luminolo o potenziatore.Applicare semplicemente il reagente sulla membrana per alcune volte, incubare per due minuti e sviluppare utilizzando una pellicola radiografica. Rapid Step offre un'elevata sensibilità nell'ordine dei picogrammi e un'emissione più debole per un periodo fino a due ore dopo l'aggiunta del substrato. I marcatori proteici Trail mix consentono il tracciamento delle proteine durante l'elettroforesi, in confronto ai protocolli standard di Western blot.Signal Boost consente un intervallo dinamico e una sensibilità maggiori. Infine, una sensibilità superiore può essere ottenuta utilizzando Rapid step invece dei tradizionali reagenti ECL. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la Western blotting in modo efficiente ed economico, grazie a una gamma completa di prodotti.Ricordate che la qualità dei vostri risultati dipende dalla qualità dei vostri reagenti. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo articolo descrive una tecnica standard occidentale-blotting utilizzando la procedura disponibile sul mercato elettroforesi NuPAGE Mini-Gel sistema da Invitrogen.

Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Immunoblotting (Western blotting) è un test rapido e sensibile per la rilevazione e la caratterizzazione di proteine ​​che funziona sfruttando la specificità inerenti antigene-anticorpo riconoscimento. Questo video fornisce protocolli per la separazione delle proteine, le proteine ​​assorbente su membrane, immunoprobing, e la visualizzazione utilizzando substrati cromogeni o chemiluminescente.

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Dot blot quantitativo per stimare le proteine bersaglio in un lisato tissutale

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Western blotting quantitativo per stimare i livelli di espressione proteica

Questo video descrive il western blotting basato sulla chemiluminescenza di lisati immunoprecipitati. La tecnica aiuta a determinare l'elaborazione e l'attivazione delle proteine. Il segnale chemiluminescente rilevato è proporzionale al livello di elaborazione delle proteine durante la sua attivazione.

Saggio di Western Blot chemiluminescente per la lavorazione delle proteine

Questo protocollo esplora le ultime innovazioni in esecuzione di analisi di Western Blot. Queste nuove modifiche impiegano un sistema gel Bis-Tris con elettroforesi eseguire tempo 35 min, un sistema di trasferimento blotting secco 7 min, e infrarossi rilevamento proteina fluorescente e di imaging che genera maggiore risoluzione, qualità, sensibilità e maggiore precisione dei dati occidentali.

Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

Il progresso del western blotting utilizzando la fluorescenza ha permesso di rilevare sottili cambiamenti nell'espressione proteica consentendo analisi quantitative. Qui descriviamo una solida metodologia per il rilevamento di una serie di proteine in una varietà di specie e tipi di tessuto. Viene inoltre fornita una strategia per superare i problemi tecnici comuni.

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

Questo metodo viene descritto un approccio affidabile e riproducibile per il confronto dei livelli della proteina in tessuti differenti e timepoints inerente allo sviluppo diversi utilizzando un approccio macchiante occidentale quantitativo standardizzato.

Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

In formalina archivio fisso e paraffina (FFPE) campioni clinici sono materiale prezioso per le indagini di malattie. Qui mostriamo un flusso di lavoro di preparazione del campione che consente un'analisi approfondita proteomica del tessuto FFPE microdissezione.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Impara la tecnica Western blotting per l'analisi proteica biochimica utilizzando campioni di tessuto. Questo metodo dimostra la preparazione dei campioni, l'elettroforesi su gel e il trasferimento su membrana per rilevare proteine specifiche con elevata sensibilità.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

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