Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la facilità di esecuzione di un Western blot quando si utilizzano prodotti appropriati. Dopo la preparazione del campione, le proteine vengono separate in base alle dimensioni e quindi trasferite in una fase solida. Le proteine vengono quindi sondate con anticorpi e rilevate: l'uso di protocolli adeguati e reagenti di alta qualità ed economici produce risultati di western blotting migliorati.

Ciao, sono Jesse Luhan, scienziato di ricerca e sviluppo presso EMD Chemicals a San Diego, in California. EMD è un'affiliata di Merck, KGAA in Dharm stat Germania. Oggi ti mostreremo una procedura di western blotting.

Quindi iniziamo. Il primo passo del western blotting è la preparazione del campione. Iniziare la preparazione del campione pellettando le celle utilizzando una centrifugazione a bassa velocità, ad esempio cinque minuti a 2.500 volte la gravità.

Dopo la centrifugazione, scolare i pellet delle celle. Risospendere bene le cellule nel reagente di estrazione proteica cyto buster utilizzando 150 microlitri per 10 alle sei cellule. Incubare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente, far girare il campione per cinque minuti a 16.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione. Trasferire l'SNA chiarificato in una nuova provetta e procedere con l'analisi. Dopo aver valutato la concentrazione proteica del campione, preparare il campione per il caricamento del gel per denaturare la proteina.

Utilizzare un tampone campione contenente un detergente denaturante onico come il solfato di sodio o SDS. Far bollire il composto a 95-100 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando un gel prefabbricato disponibile in commercio, le proteine possono essere separate rapidamente in base al peso molecolare.

Riempire l'unità di elettroforesi con un tampone di corsa, che può essere prodotto con i reagenti offerti dalla linea chimica Omni PU. Caricare la prima corsia del pozzo con il marcatore proteico trail mix. Questo marcatore ha tre bande di riferimento che consentono il monitoraggio durante l'elettroforesi.

Una volta che il gel è colorato, sono visibili 10 bande, che vanno da 10 a 225 chili Dalton. Caricare il campione denaturato nei pozzetti rimanenti. Far funzionare il gel a 220 volt per un'ora.

Una volta che le proteine si sono separate, colorare il gel con il blu kumasi per assicurarsi che le proteine siano migrate in modo uniforme e uniforme utilizzando una colorazione rapida e ultrasensibile, che è pronta per l'uso senza DS. La colorazione è necessaria proprio come le proteine con una carica elettrica possono essere indotte a viaggiare attraverso un gel in un campo elettrico, quindi le proteine possono essere trasferite in un campo elettrico dal gel su una membrana come la nitrocellulosa o il PVDF. Quando si utilizzano membrane in PVDF, immergere la membrana in metanolo per alcuni minuti, seguita da un equilibrio in un tampone di trasferimento ghiacciato per cinque minuti. Inoltre, immergere il gel per alcuni minuti nel tampone di trasferimento ghiacciato E, l'equilibratura previene il restringimento del gel durante il trasferimento.

Per un trasferimento a umido, assemblare un sandwich di gel e membrana tra la spugna e la carta. Quindi fissare saldamente il gruppo dopo essersi assicurati che non si siano formate bolle d'aria tra il gel e la membrana. Immergere il sandwich nel buffer di trasferimento e applicare un campo elettrico.

Le proteine caricate negativamente viaggeranno verso l'elettrodo caricato positivamente. La membrana quindi li ferma, li lega e impedisce loro di continuare. Una volta completato il trasferimento, visualizza le proteine per garantire un trasferimento uniforme senza sacche d'aria.

Questo può essere fatto facilmente con l'allarme rosso Western blot stain. Questa macchia è pronta per l'uso e la colorazione può essere eseguita facilmente con acqua. Questo è il gel una volta che è stato trattenuto dal lavaggio in acqua prima che la membrana possa essere provata con l'anticorpo, la membrana è bloccata.

Per evitare legami aspecifici, bloccare la membrana con reagenti bloccanti di alta qualità. Per evitare un aumento del fondo, incubarlo in una soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione, quindi lavare la membrana tre volte in TBST o PBST dopo l'incubazione. Questi tamponi possono essere realizzati in modo semplice e conveniente utilizzando rispettivamente le tavolette TBS tween e le tavolette PBS tween.

Una volta che la membrana è stata bloccata e lavata, può essere incubata con l'anticorpo primario. Applicare l'anticorpo primario utilizzando una soluzione, una di potenziamento del segnale, che consente di migliorare significativamente il segnale. Preparare l'anticorpo primario nella prima soluzione e incubare la membrana per un'ora.

Non è necessario aggiungere ulteriori agenti bloccanti dopo l'incubazione. Lavare la membrana con TBST. Successivamente, incubare la membrana con l'anticorpo secondario diluito nella soluzione due di signal boost per un'ora.

Infine, lavare nuovamente la membrana più volte con TBST per HRP coniugato. In questo caso viene tradizionalmente utilizzata la rilevazione di anticorpi secondari mediante chemiluminescenza potenziata o ECL. Viene utilizzato il reagente ECL rapid step in quanto non richiede la miscelazione di luminol o potenziatore.

Basta spruzzare la membrana un paio di volte, incubare per due minuti e svilupparla utilizzando una pellicola a raggi X. Rapid Step offre una bassa sensibilità al picogramma e una missione più leggera fino a due ore dopo l'aggiunta del substrato. I marcatori proteici Trail Mix consentono il tracciamento delle proteine durante l'elettroforesi rispetto ai protocolli Western blot standard.

Signal Boost consente una maggiore gamma dinamica e sensibilità. Infine, è possibile ottenere una sensibilità superiore utilizzando Rapid step invece dei tradizionali reagenti ECL. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'oscuramento occidentale in modo efficiente ed economico con una gamma completa di prodotti.

Ricordate che la qualità dei vostri risultati si basa sulla qualità dei vostri reagenti. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.